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Orientador: Prof. Dr. Luiz Roberto Nunes Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Sâo Bernardo do Campo, 2022. A bactéria Gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas características que a tornam atrativa para a produção industrial de diferentes bioprodutos, incluindo o bioetanol. Técnicas de manipulação genética foram desenvolvidas para esta bactéria, que vem sendo modificada geneticamente e/ou adaptada para trabalhar em sistemas de bioprocessamento integrado, produção de diversos produtos de alto valor agregado além de incorporar fontes alternativas de carbono às suas vias metabólicas. Dessa forma, Z. mobilis vem sendo vista como um microrganismo de grande potencial para a indústria de bioconversão e um melhor entendimento acerca dos mecanismos por ela utilizados para o controle de sua expressão gênica pode auxiliar no desenvolvimento de novas linhagens geneticamente manipuladas, com elevada capacidade de produção industrial. O autoindutor 2 (ou AI-2) é uma das moléculas utilizadas pelas bactérias para desencadear a resposta Quorum Sensing (QS), que ativa a expressão de genes envolvidos em uma série de mecanismos alternativos, quando as células atingem altas densidades populacionais (incluindo bioluminescência, motilidade, formação de biofilme, resistência ao estresse, fatores de patogenicidade, entre outros). Ao contrário da maioria dos autoindutores, o AI-2 pode induzir respostas QS tanto em bactérias Gram-negativas quanto Gram-positivas. Desta forma, esta molécula se apresenta como um sistema trans-específico de comunicação, capaz de afetar até mesmo bactérias que não podem produzir esse autoindutor. Neste trabalho, demonstramos que a bactéria Gram-negativa etanologênica Z. mobilis (não produtora de AI-2) responde ao AI-2 exógeno, modulando a expressão de genes envolvidos em mecanismos tipicamente associados a QS em outras bactérias como motilidade, Reparação de DNA e fixação de nitrogênio. Além disso, o metabolismo de células de Z. mobilis induzidas por AI-2 parece favorecer a produção de etanol sobre o acúmulo de biomassa, provavelmente como uma adaptação à alta demanda energética de fixação de N2. Do ponto de vista ambiental, esta estratégia pode estar ligada a mecanismos de sobrevivência em ambientes altamente competitivos onde Z. mobilis ativa a fixação de nitrogênio para sobreviver em meios escassos desta molécula e se torna mais eficaz na relação de produção glicose-etanol. Com estes achados, são abertas novas possibilidades de empregar AI-2 durante a produção industrial de etanol de segunda geração, como forma de aumentar a fixação de N2 por essas bactérias sem comprometer a produção de etanol. The Gram-negative bacterium Zymomonas mobilis has several characteristics that make it attractive for the industrial production of different bioproducts, including bioethanol. Genetic manipulation techniques were developed for this bacterium, which has been genetically modified and/or adapted to work in integrated bioprocessing systems, producing several products with high added value, in addition to incorporating alternative sources of carbon to its metabolic pathways. Thus, Z. mobilis has been seen as a microorganism of great potential for the bioconversion industry and a better understanding of the mechanisms used by it to control its gene expression can help in the development of new genetically manipulated strains, with high capacity of industrial production. Autoinducer 2 (or AI-2) is one of the molecules used by bacteria to trigger the Quorum Sensing (QS) response, which activates the expression of genes involved in a series of alternative mechanisms when cells reach high population densities (including bioluminescence, motility, biofilm formation, stress resistance, pathogenicity factors, among others). Unlike most autoinducers, AI-2 can induce QS responses in both Gramnegative and Gram-positive bacteria. In this way, this molecule presents itself as a trans-specific communication system, capable of affecting even bacteria that cannot produce this autoinducer. In this work, we demonstrate that the ethanologenic Gram-negative bacterium Z. mobilis (nonAI-2 producing) responds to exogenous AI-2, modulating the expression of genes involved in mechanisms typically associated with QS in other bacteria such as motility, DNA repair and nitrogen fixation. Furthermore, AI-2-induced metabolism of Z. mobilis cells seems to favor ethanol production over biomass accumulation, probably as an adaptation to the high energy demand of N2 fixation. From an environmental point of view, this strategy may be linked to survival mechanisms in highly competitive environments where Z. mobilis activates nitrogen fixation to survive in the scarce media of this molecule and becomes more efficient in the glucose-ethanol production relationship. With these findings, new possibilities are opened to use AI-2 during the industrial production of second-generation ethanol, as a way of increasing N2 fixation by these bacteria without compromising ethanol production.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Roberto Nunes Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Santo André, 2021. A bactéria Gram-negativa Zymomonas mobilis possui diversas características que a tornam atrativa para a produção industrial de diversos bioprodutos, incluindo o bioetanol. Por exemplo, Z. mobilis pode ser cultivada tanto em condições aeróbicas como anaeróbicas, é capaz de converter glicose em etanol com maior eficiência do que a levedura Saccharomyces cerevisiae e tolera concentrações mais elevadas deste álcool, durante o processo de fermentação. No entanto, essa bactéria pode ser geneticamente modificada para produzir outros tipos de biocombustíveis e produtos de alto valor agregado, como o isobutanol, além de outros álcoois de cadeia longa (Long Chain Alcohols, ou LCAs), que possuem maior densidade energética do que o etanol. O presente projeto visa empregar uma abordagem de manipulação genética, originalmente desenvolvida em Escherichia coli, para construir uma linhagem de Z. mobilis modificada, que poderá ser posteriormente utilizada para a produção de álcoois de cadeia longa. Para tanto, dois genes exógenos foram clonados em Z. mobilis: uma 2-cetoácido descarboxilase de amplo espectro (gene kivd, de Lactococcus lactis), capaz de converter 2-cetoácidos em aldeídos e uma álcool desidrogenase de amplo espectro (gene adh2 de S. cerevisiae), que reduz esses aldeídos aos seus respectivos álcoois. Essa nova cepa de Z. mobilis, denominada ZmLCA1, poderá ser utilizada em abordagens de engenharia metabólica, visando a produção de isobutanol e outros LCAs. Além disso, dada a alta toxicidade do isobutanol, esforços foram feitos para a obtenção de uma cepa de Z. mobilis com maior resistência a este LCA, com o auxílio de uma abordagem de evolução dirigida, baseada no uso de cultura contínua, em um biorreator. The Gram-negative bacterium Zymomonas mobilis has several characteristics that make it attractive for the industrial production of different bioproducts, including bioethanol. For example, Z. mobilis can be grown in both aerobic and anaerobic conditions, is capable of converting glucose to ethanol more efficiently than the yeast Saccharomyces cerevisiae and tolerates higher concentrations of this alcohol during the fermentation process. However, this bacterium can be genetically modified to produce other types of biofuels and value-added products, such as isobutanol and other long-chain alcohols (LCAs), which have a higher energy density than ethanol. The current project aims to employ a genetic manipulation approach, originally developed in Escherichia coli, to construct a modified Z. mobilis strain that can be further utilized for the production of long chain alcohols. For that, two exogenous genes were cloned into Z. mobilis: a broad-spectrum 2-keto acid decarboxylase (kivd gene, from Lactococcus lactis), capable of converting 2-keto acids into aldehydes and a broad-spectrum alcohol dehydrogenase (adh2 gene from S. cerevisiae), which reduces these aldehydes to their respective alcohols. This new Z. mobilis strain, called ZmLCA1, can hopefully be used in metabolic engineering approaches, aimed at the production of isobutanol and other LCAs. Moreover, given the high toxicity of isobutanol, efforts were made to obtain a Z. mobilis strain with increased resistance to this LCA, with the aid of a directed evolution approach, based on the use of continuous culturing, in a bioreactor.

Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa responsável pela doença do cancro cítrico em uma grande variedade de plantas cítricas, causando grandes perdas econômicas. Xac sobrevive como epífita nas superfícies foliares e causa a doença após a penetração e crescimento dentro do parênquima mesofílico de plantas suscetíveis. Como uma bactéria associada a plantas, Xac precisa se adaptar às condições ambientais em constante mudança. Fatores sigma alternativos da família extracitoplásmica (ECF) estão envolvidos na regulação da expressão gênica em resposta ao estresse ambiental. O genoma de Xac306 codifica 9 fatores sigmas ECF, o que provavelmente reflete seu estilo de vida e sugere um papel importante desta família de reguladores transcricionais na adaptação de Xac. O objetivo deste estudo é caracterizar a função de um fator sigma ECF encontrado no genoma de Xac, denominado sigF. Para isso, foram obtidas duas linhagens com níveis alterados de sigF: uma linhagem mutante (?sigF) por deleção em fase do gene e uma linhagem com cópia extra do gene em vetor multicópia, o que promove a super-expressão deste sigma. Ensaios de virulência em hospedeiro suscetível demonstraram que sigF não é necessário para a virulência em Xac. A sensibilidade da linhagem ?sigF a diferentes tipos de estresse ambiental também foi analisada, incluindo estresse oxidativo, por radiação UV, deficiência de ferro e tratamento com o agente quelante de metais ácido fítico, não sendo observadas diferenças na viabilidade quando comparada com a linhagem selvagem. Além disso, as linhagens com níveis alterados de sigF não apresentaram alterações na capacidade de formar biofilmes e aderir às folhas da planta. Curiosamente, observamos que SigF é essencial para a sobrevivência de Xac a predação pela ameba de vida livre Dictyostelium discoideum. Resultados de ensaios de RT-PCR quantitativo e RNA-Seq demonstram que a super-expressão de uma versão que mimetiza um estado fosforilado de SigF causa indução da expressão de genes que codificam componentes de um sistema de secreção do tipo VI (SSVI) de Xac,que também tem papel essencial na sobrevivência a D.discoideum. Ensaios preliminares de fosforilação in vitro pela incubação de SigF purificada com a proteína quinase PknB, codificada por um gene localizado em provável operon com sigF, reforçam o modelo proposto, no qual SigF é regulado em nível pós-traducional por fosforilação. Além disto, nossos resultados demonstram que SigF regula positivamente a expressão do SSVI de Xac Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is a Gram-negative bacterium responsible for citrus canker disease in a wide variety of citrus plants, causing major economic losses. Xac survives as epiphyte on leaf surfaces and causes the disease after penetration and growth inside mesophyll parenchyma of susceptible plants. As a plant-associated bacterium, Xac needs to adapt to constantly changing environmental conditions. Alternative sigma factors of the extracytoplasmic family (ECF) are involved in the regulation of gene expression in response to environmental stress. The genome of Xac strain 306 encodes 9 sigma factors of the ECF family, which probably reflects its lifestyle and suggests an important role of this family of transcriptional regulators in Xac adaptation. The aim of this study is to characterize the function of one ECF sigma factor found in Xac genome, named sigF. For that, we have constructed a sigF mutant strain (?sigF) by in frame deletion of the gene and an overexpression strain, which contains an extra copy of sigF in a multicopy plasmid. Results from virulence assays in a susceptible host have shown that sigF is not required for Xac virulence. We've also tested sensitivity of the ?sigF strain to distinct types of environmental stress, including oxidative stress, UV radiation, iron deprivation and treatment with the metal chelating agent phytic acid and no difference in viability was observed when compared to the wild type strain, indicating the SigF is not required under these conditions. In addition, we have not observed differences in biofilm formation and adhesion to plant leaves caused by deletion or overexpression of sigF. Interestingly, our results show that SigF is required for Xac survival to predation by the amoeba Dictiostelium discoideum. In addition, results from qRT-PCR analysis and RNA-seq experiments have shown that overexpression of a SigF phospho-mimicking mutant version promotes induction of genes from a Xac type VI secretion system required for survival to D. discoideum. Prelimary in vitro phosphorylation assays using purified SigF and PknB Ser/thr kinase encoded in the same operon as sigF corroborates with a model in which SigF is post-translational regulated by phosphorylation. Our results also suggest that SigF positively regulates Xac SSVI Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/19720-6

Resistance to antibiotics is a global health problem. Activation of the SOS response, and the subsequent elevation in mutagenesis, contributes to the appearance of resistance mutations. Among currently used drugs, quinolones are the most potent inducers of the SOS response. In the present study, we show that amikacin inhibits ciprofloxacin-mediated SOS induction and mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa., This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brazil (FAPESP; grant 2014/15982-6), and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil (CNPq; grant 407259/2013-9). E.Y.V. was funded by a postdoctoral fellowship from CNPq (grant 151264/2014-7). J.B. was supported by Plan Nacional de I+D+i and Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministerio de Economía y Competitividad, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD12/0015), cofinanced by the European Regional Development Fund (ERDF) “A way to achieve Europe” and grant FIS PI13/00063.