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Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease which affects 47 million people worldwide, being the most prominent type of dementia. The etiology of the disease is unknown but genetic evidence from the familial form of the disease indicates that the amyloid precursor protein (APP) plays a key role in the pathology. Importantly, APP is the substrate in the proteolytic reaction producing Aβ peptides which compose the amyloid plaques, one of the main pathological hallmarks in AD brain. In addition, APP is ubiquitously expressed by neurons where it interacts with multiple presynaptic proteins but the role of these interactions is elusive.The aim of my thesis was to study the physiological and pathological functions of APP related to its location at the presynapse. First, we studied the consequences on presynaptic mechanisms of the genetic deletion of presenilin, the catalytic subunit of γ-secretase, the intramembrane protease which cleaves APP. We observed that in absence of presenilin, APP accumulates in axons. By combining optogenetic to electrophysiology, we assessed synaptic transmission and plasticity in the CA3 region of the hippocampus. The presynaptic facilitation, the increase in synaptic vesicle release during repetitive stimulation, was altered whereas the basal neurotransmission was not. The impairment of presynaptic mechanisms was due to the accumulation of APP Cter, which decreases the abundancy of synaptotagmin-7, a calcium sensor essential for facilitation. Using a similar approach, we investigated the consequences of the genetic deletion of APP itself and observed again an impairment of presynaptic facilitation. Together, these results demonstrate the importance of APP homeostasis in presynaptic plasticity.I then investigated possible alterations of APP, other than the amyloid peptides, in the AD brain. I discovered that APP dramatically accumulates together with presynaptic proteins around dense-core amyloid plaques in human AD brain. In addition, the Nter domain, but not the Cter domain of APP is enriched in the core of amyloid plaques uncovering a potential pathological role of the secreted APP Nter in dense-core plaques. Ultrastructural analysis of APP accumulations reveals abundant multivesicular bodies containing presynaptic vesicle proteins and autophagosomal built-up of APP. Finally, we observed that outside the APP accumulations, presynaptic proteins were downregulated, in the neuropil area of the outer molecular layer of the dentate gyrus. Altogether, the data I collected during my thesis supports a role of presynaptic APP in physiology and in AD pathology and highlights APP accumulations as a pathological site where presynaptic proteins are mis-distributed., La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui touche 47 millions de personnes dans le monde et représente le type de démence le plus répandu. L'étiologie de la maladie est inconnue mais les preuves génétiques de la forme familiale de la maladie indiquent que la protéine précurseur amyloïde (APP) joue un rôle clé dans la pathologie. L'APP est le substrat de la réaction protéolytique produisant des peptides Aβ qui composent les plaques amyloïdes, l'une des principales caractéristiques pathologiques du cerveau atteint de la MA. De plus, l'APP est exprimée de manière ubiquitaire par les neurones où elle interagit avec plusieurs protéines présynaptiques, mais le rôle de ces interactions est inconnu.Le but de ma thèse était d'étudier les fonctions physiologiques et pathologiques de l'APP liées à sa localisation présynaptique. D’abord, nous avons étudié les conséquences sur les mécanismes présynaptiques de la délétion génétique de la préséniline, la sous-unité catalytique de la γ-sécrétase, la protéase intramembranaire qui clive l'APP. Nous avons observé qu'en l'absence de préséniline, l'APP s'accumule dans les axones. En combinant l'optogénétique à l'électrophysiologie, nous avons évalué la transmission synaptique et la plasticité dans la région CA3 de l'hippocampe. La facilitation présynaptique, l'augmentation de la libération de vésicules synaptiques pendant la stimulation répétitive était réduite alors que la neurotransmission basale ne l'était pas. L'altération des mécanismes présynaptiques était due à l'accumulation d'APP Cter qui diminue l'abondance de synaptotagmine-7, une protéine essentielle à la facilitation. En utilisant une approche similaire, nous avons étudié les conséquences de la suppression génétique de l'APP elle-même et observé à nouveau une altération de la facilitation présynaptique. Dans leur ensemble, ces résultats démontrent l'importance de l'homéostasie de l’APP dans la plasticité présynaptique.J'ai ensuite étudié les altérations possibles de l'APP, en plus des peptides amyloïdes, dans le cerveau de la MA. J'ai découvert que l'APP s'accumule abondamment avec des protéines présynaptiques autour des plaques amyloïdes à noyau dense dans le cerveau humain atteint de la MA. De plus, le domaine Nter, mais pas le domaine Cter de l'APP, est enrichi dans le noyau des plaques amyloïdes révélant un rôle pathologique potentiel de l'APP Nter sécrété dans les plaques à noyau dense. L'analyse ultrastructurale des accumulations de l'APP révèle d'abondants corps multivesiculaires contenant des protéines des vésicules présynaptiques et une accumulation d'APP dans les autophagosomes. Enfin, nous avons observé qu'en dehors des accumulations APP, l’abondance des protéines présynaptiques étaient réduite, dans le neuropile de la couche moléculaire externe du gyrus denté. Dans l'ensemble, les données que j'ai collectées au cours de ma thèse soutiennent un rôle présynaptique de l'APP en physiologie et en pathologie dans la MA et mettent en évidence les accumulations d'APP comme un site pathologique où les protéines présynaptiques sont mal distribuées.

Data accumulated over the two last decades have demonstrated that astrocytes play key roles in the regulation of synaptic transmission and plasticity. This is due to their capability to detect and regulate synaptic transmission by expressing receptors and releasing gliotransmitters, respectively. However, astrocytes become reactive in pathological condition such as Alzheimer’s disease, and neuronal activity regulation by these glial cells is likely to be altered.The main objective of this thesis is to study the role of astrocytes as integrators and modulators of synaptic transmission under both physiological and pathological conditions.First, we have shown that a single astrocyte is able to detect and in turn up-regulate basal synaptic transmission at individual synapses in juvenile rats. Whether this upregulation is still present in adults and whether it is affected by the synaptic activity occurring at neighboring synapses present within the same astroglial domain is unknown. Using STED imaging on fixed tissue and electrophysiological recordings on acute hippocampal slices of adult male rats we here show that the upregulation pathway previously described in juvenile rats is also present in adults. Indeed, as in juvenile, astrocytes detect basal glutamatergic transmission at individual synapses through mGluR5 and in turn upregulate it by releasing purines and activating presynaptic A2A receptors. More importantly, our data suggest strongly that an individual astrocyte is able to adapt its purine-mediated regulation of glutamatergic transmission as a function of the number of synapses activated in its domain. When the number of afferent inputs activated is small, astrocytes facilitate synaptic efficacy through a purine-mediated process. Interestingly, this process is no longer present when a higher number of afferences is activated, suggesting the astrocytes integrate the incoming information and adapt its response in terms of purine release.Second, studies on Alzheimer’s disease models have reported changes in several astrocyte functions such as its ability to regulate synaptic transmission. However, the contribution of astrocytic reactivity in this pathology remains largely unknown and debated as the reported changes in these studies can have beneficial, deleterious or even mixed effects on neurons. Indeed, reactive astrocytes display a morphological, molecular and functional heterogeneity that could explain their controversial effects in this pathology. To understand how astrocyte reactivity contributes to Alzheimer's disease and to find therapeutic pathways, it is crucial to develop a new strategy that efficiently modulates all types of reactive astrocytes. Here, we used cell type-specific approaches in vivo and identified the JAK2/STAT3 pathway, as necessary and sufficient for the induction and maintenance of astrocyte reactivity. Modulation of this cascade by viral gene transfer in mouse astrocytes efficiently controlled several morphological and molecular features of reactivity. Inhibition of this pathway in mouse models of Alzheimer's disease improved key pathological hallmarks by reducing amyloid deposition and improving spatial learning. Combining this viral gene transfer with electrophysiological recordings, we specifically showed in our lab that reducing astrocyte reactivity by inhibiting JAK2/STAT3 cascade in astrocytes restores synaptic transmission and plasticity deficits observed in a 3xTg mouse model of Alzheimer's disease. In conclusion, the JAK2/STAT3 cascade operates as a master regulator of astrocyte reactivity in vivo. Its inhibition offers new therapeutic opportunities for Alzheimer's disease., Les données accumulées au cours des deux dernières décennies ont montré que l’astrocyte joue un rôle clé dans la régulation de la transmission synaptique. Cela est dû à sa capacité à détecter, via des récepteurs, et réguler, via la libération de gliotransmetteurs, la transmission synaptique. Cependant, les astrocytes deviennent réactifs dans des conditions pathologiques comme la maladie d’Alzheimer et la régulation de l’activité neuronale par ces cellules est susceptible d’être altérée.L'objectif principal de cette thèse est d'étudier le rôle de l‘astrocyte en tant qu'intégrateur et modulateur de la transmission synaptique dans des conditions physiologique et pathologique.Premièrement, nous avons montré qu’un astrocyte est capable de détecter et d’augmenter la transmission synaptique de base au niveau d’une synapse chez des rats jeunes. On ignore si cette régulation est toujours présente chez les adultes et si elle est affectée par l'activité synaptique des synapses voisines présentes dans le même domaine astrocytaire. En utilisant l’imagerie STED et des enregistrements électrophysiologiques sur des tranches d’hippocampes de rats adultes, nous montrons ici que la voie de régulation décrite précédemment est également présente chez les adultes. En effet, les astrocytes détectent la transmission glutamatergique de base au niveau de synapses individuelles par le biais des mGluR5 et l’augmente en libérant des purines qui activent les récepteurs présynaptiques A2A. Plus important encore, nos données suggèrent fortement qu'un astrocyte est capable d'adapter sa régulation de la transmission glutamatergique en fonction du nombre de synapses activées dans son domaine. Lorsque le nombre d’afférences activées est faible, les astrocytes facilitent l'efficacité synaptique par un mécanisme dépendant des purines. Fait intéressant, ce processus n’est plus présent lorsqu’un plus grand nombre d’afférences est activé, ce qui suggère que les astrocytes sont capables d’intégrer différemment les informations entrantes et d’adapter leur réponse en termes de libération de purine.Deuxièmement, des études sur des modèles de la maladie d’Alzheimer ont rapporté que plusieurs fonctions astrocytaires, comme leur capacité à réguler la transmission synaptique, étaient perturbées. Cependant, la contribution de la réactivité astrocytaire dans cette pathologie reste méconnue et débattue du fait que les modifications rapportées dans ces études peuvent être bénéfiques et/ou néfastes pour les neurones. En effet, les astrocytes réactifs présentent une hétérogénéité morphologique, moléculaire et fonctionnelle qui peut expliquer leurs effets controversés dans cette pathologie. Pour comprendre comment la réactivité astrocytaire contribue à la maladie d'Alzheimer et trouver des voies thérapeutiques, il est essentiel de développer une nouvelle stratégie qui module efficacement tous les types d'astrocytes réactifs. Ici, nous avons utilisé des approches in vivo visant spécifiquement les astrocytes et identifié la voie JAK2/STAT3, comme étant nécessaire et suffisante pour l'induction et le maintien de la réactivité astrocytaire. La modulation de cette cascade par approche virale contrôle efficacement plusieurs caractéristiques morphologiques et moléculaires de la réactivité. De plus, son inhibition chez des modèles murins de la maladie d'Alzheimer améliore des caractéristiques pathologiques clés en réduisant les dépôts amyloïdes et en améliorant l'apprentissage spatial. En combinant l’approche virale avec des enregistrements électrophysiologiques, notre équipe a montré que réduire la réactivité astrocytaire en inhibant la voie JAK2/STAT3 rétablit les déficits de transmission synaptique et de plasticité observés chez un modèle 3xTg de la maladie d'Alzheimer. En conclusion, la cascade JAK2/STAT3 est un régulateur principal de la réactivité astrocytaire in vivo. Son inhibition offre de nouvelles opportunités thérapeutiques pour la maladie d'Alzheimer.

Clathrin-mediated endocytosis (CME), the formation of clathrin-coated vesicles (CCV) from the plasma membrane, is an essential process in eukaryotic cells. During CME, the GTPase dynamin is recruited to the neck of nascent CCV where it oligomerizes into helical filaments. Conformational changes induced by the hydrolysis of GTP catalyze the scission of the vesicle neck. This process has been studied in detail with in vitro reconstitution on membrane tubules but it needs to be established in living cells, where interactions between dynamin and other proteins such as amphiphysin are critical. Live cell total internal reflection fluorescence (TIRF) imaging with the pulsed pH (ppH) assay allows the detection of CCV formation with high spatial (~100 nm) and temporal (2 s) resolutions. It has revealed that dynamin is recruited to maturing clathrin-coated pits (CCP) in two phases with a peak at the time of scission but the parameters of its recruitment in living cells remain unclear. To determine these parameters, we have performed live cell imaging of dynamin recruitment at collective and single molecule levels during acute perturbations of its function. My PhD results showed that dynamin is recruited to the plasma membrane, diffuses outside of CCP and is trapped at CCP. Furthermore, we determined with mutated dynamins that (1) the PRD domain of dynamin is crucial for its recruitment at CCP; (2) the PH domain is important for vesicular scission but not for recruitment to CCP or to the plasma membrane. Finally, I observed that dynamin exchanges with an extra-CCP pool at all times: this would allow for its further recruitment by addition of new binding sites and its ability to narrow the vesicle neck after GTP hydrolysis. Altogether, these data suggest that in CCP dynamin molecules (1) are constantly exchanged; (2) diffuse at similar rates throughout the entire process of vesicle formation, from maturation until scission; and (3) that dynamin’s GTPase activity contributes to CCP maturation and scission., L'endocytose dépendante de la clathrine (EDC), c’est-à-dire la formation de vésicules recouvertes de clathrine (VRC) à partir de la membrane plasmique, est un processus essentiel dans les cellules eucaryotes. Au cours de l’EDC, la GTPase dynamine est recrutée au cou de la VRC naissante où elle s'oligomérise en hélice. Les changements de conformation induits par l'hydrolyse du GTP catalysent la scission du cou vésiculaire. Ce processus a été étudié en détail par reconstitution in vitro sur des tubules membranaires, mais il doit être établi dans des cellules vivantes, où les interactions de la dynamine avec d'autres protéines comme l'amphiphysine sont critiques. L'imagerie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) avec le protocole pH pulsé (ppH) sur cellules vivantes permet la détection de la formation de VRC avec une résolution spatiale (~100 nm) et temporelle (2 s) élevée. Ce protocole a révélé que la dynamine présente un recrutement biphasique aux puits recouverts de clathrine (PRC) en maturation avec un pic au moment de la scission mais les paramètres de son recrutement dans les cellules vivantes restent peu clairs. Pour déterminer ces paramètres, j’ai utilisé des techniques d’imagerie sur cellules vivantes pour étudier le recrutement de la dynamine à l’échelle globale et à l’échelle de la molécule unique lors de perturbations aiguës de sa fonction. Mes résultats de thèse ont montré que la dynamine est recrutée à la membrane plasmique, diffuse à l'extérieur des PRC et y est transitoirement piégée. De plus, j’ai déterminé avec des dynamines mutées (1) que le domaine PRD de la dynamine est crucial pour son recrutement aux PRC ; (2) que le domaine PH est important pour la scission vésiculaire mais par pour son recrutement aux PRC ou à la membrane plasmique. Enfin, j’ai observé que la dynamine s'échange en permanence avec un pool extra-PRC, ce qui permettrait son recrutement ultérieur par l'ajout de nouveaux sites de liaison et sa capacité à rétrécir le cou des vésicules suite à l’hydrolyse du GTP. En conclusion, ces données suggèrent qu’aux PRC, les molécules de dynamine (1) sont constamment échangées ; (2) diffusent à des taux similaires tout au long du processus de formation, maturation et scission des vésicules; et (3) l'activité GTPase de la dynamine contribue à la maturation et à la scission des VRC.

Synaptic vesicles (SVs) are essential for neurotransmission, and more efforts are needed for better understanding their neurotransmitter content, release kinetics, distribution and mobility. SVs are not only clustered in presynaptic boutons, but also dynamically shared among multiple en passant presynaptic boutons, a phenomenon named SV super‐pool. Previous work from our laboratory suggested that the Vesicular GLUtamate Transporter 1 (VGLUT1) may play a role in regulating SV super-­pool size beyond loading glutamate into SV. My Ph.D project is focused on SVs mobility in axons. Firstly, I generated a VGLUT1mEos2 knock-in (KI) mouse line, which provides extended possibilities to study the SV trafficking and characterize SV super‐pool. Secondly, I engaged in a thorough VGLUT1 structure‐function analysis. I identified that VGLUT1 tends to cluster SVs in the presynaptic boutons and reduce SVs exchange with the super‐pool via the second poly‐proline motif of its C­‐terminus. Overall, my Ph.D work contributes to the knowledge of the role of VGLUT1 in regulating SVs mobility and provides new tools for the further investigations on SV super-­pool physiology., Les vésicules synaptiques (VSs) sont essentielles pour la neurotransmission. Les recherches actuelles se focalisent sur la caractérisation de leur contenu en neurotransmetteurs, leur cinétique de libération, leur distribution et leur mobilité. Les VS ne sont pas présentes exclusievement en paquet dans les boutons présynaptiques mais sont echangées de façon dynamique avec le reste de l’axone dans un super-contingent (super-pool). Notre laboratoire a précédement montré que le transporteur vésiculaire de glutamate de type 1 (VGLUT1) jouerait un rôle dans la régulation du super-pool. Mon projet de thèse se focalise sur la mobilité des VS dans les axones. En premier lieu, j’ai généré une souris gain de fonction VGLUT1mEos2 afin d'étudier la mobilité des VSs et de mieux caractériser le super-pool. Ensuite j’ai engagé une étude des relation entre la structure de VGLUT1 et ses fonctions afin d’identifier les signatures moléculaires responsable de la régulation de la taille du super-pool. J’ai identifié le second motif poly-proline à l’extremité C-terminale de VGLUT1 comme étant nécessaire et suffisante pour induire une diminution de la taille du super-pool des VSs. Pour conclure mes travaux de thèse ont contribué à la compréhension du rôle de VGLUT1 dans la régulation de la mobilité des VSs et à fournir les outils nécessaires pour de futures investigations concernant la physiologie du super-pool.

Initially encoded in the hippocampus, new declarative memories are thought to become progressively dependent on a broadly distributed cortical network as they mature and consolidate over time. Although we have a good understanding of the mechanisms underlying the formation of new memories in the hippocampus, little is known about the cellular and molecular mechanisms by which recently acquired information is transformed into remote memories at the cortical level. The N-­‐methyl-­‐D-­‐aspartate receptor (NMDAR) is widely known to be a key player in many aspects of long-­‐term experience-­‐dependent synaptic changes underlying associative memory processes. Based on their distinct biophysical properties, we postulated that the activity-­‐dependent surface dynamics of the two predominant GluN2 subunits (GluN2A and GluN2B) of NMDARs present in the adult neocortex could provide a metaplastic control of synaptic plasticity supporting the progressive embedding and stabilization of long-­‐lasting associative memories within cortical networks during memory consolidation. By combining, in adult rats, behavioral, biochemical, pharmacological and innovative strategies consisting in manipulating trafficking of NMDAR subunits at the cell membrane, our results identify a cortical switch in the synaptic GluN2-­‐containing NMDAR composition which drives the progressive embedding and stabilization of long-­‐lasting memories within cortical networks. We first established that cortical GluN2B-­‐containing NMDARs and their specific interactions with the synaptic signaling CaMKII protein are preferentially recruited upon encoding of associative olfactory memories to enable neuronal allocation, the process via which a new memory trace is thought to be allocated to a given neuronal network. As these memories are progressively processed and embedded into cortical networks, we observed a learning-­‐induced surface redistribution of cortical GluN2B-­‐containing NMDARs outwards or inwards synapses which respectively drives the progressive stabilization and subsequent forgetting of remote memories over time. Finally, increasing the strength, upon encoding, of the initial memory leads to a faster increase of the cortical GluN2A/GluN2B synaptic ratio and accelerates the kinetics of hippocampal-­‐cortical interactions, which translated into a faster stabilization of memories within cortical networks. Taken together, our results provide evidence that GluN2B-­‐NMDAR surface trafficking controls the fate of remote memories (i.e. stabilization versus forgetting), shedding light on a novel mechanism used by the brain to organize recent and remote memories., Initialement encodés dans l’hippocampe, les nouveaux souvenirs déclaratifs deviennent progressivement dépendants d’un réseau distribué de neurones corticaux au cours de leur maturation dans le temps. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-­‐tendant la consolidation et le stockage à long terme de ces nouveaux souvenirs au sein des réseaux corticaux restent à élucider. Les récepteurs N-­‐méthyl-­‐D-­‐aspartate (RNMDA) jouent un rôle essentiel dans l’induction et la régulation des changements synaptiques sous-­‐tendant les processus mnésiques de type associatifs. Sur la base de leurs propriétés biophysiques respectives, nous avons formulé l’hypothèse que la redistribution synaptique des deux formes principales de sous-­‐unités GluN2 exprimées dans le néocortex adulte (GluN2A and GluN2B), pourrait constituer un mécanisme de régulation de la plasticité synaptique supportant l’intégration et la stabilisation progressive des souvenirs au niveau cortical au cours du processus de consolidation mnésique. En combinant, chez le rat adulte, une approche comportementale, biochimique, pharmacologique et des stratégies innovantes consistant à manipuler le trafic de sous-­‐unités des RNMDA à la surface synaptique, nos résultats mettent en évidence un changement cortical dans la composition synaptique en sous unités GluN2, lequel régule la stabilisation progressive de la mémoire à long terme au sein des réseaux corticaux. Nous avons d'abord établi que les RNMDA contenant la sous-­‐unité GluN2B, via leur interaction spécifique avec une protéine clé de la signalisation synaptique, la CaMKII, sont préférentiellement recrutés lors de la phase d’encodage pour permettre l’allocation des nouveaux souvenirs olfactifs associatifs dans un réseau de neurones corticaux spécifique. Au cours du processus de consolidation, nous avons révélé que la redistribution des RNMDA corticaux contenant les sous-­‐unités GluN2B vers l’extérieur ou l’intérieur de l’espace synaptique suite à l’apprentissage, contrôle respectivement la stabilisation de la mémoire à long terme et son oubli au cours du temps. Enfin, renforcer l’acquisition initiale conduit à une augmentation plus rapide du ratio post-­‐synaptique GluN2A/GluN2B et accélère la cinétique du dialogue hippocampo-­‐cortical, ce qui se traduit par une stabilisation accélérée des souvenirs au sein des réseaux corticaux. Pris dans leur ensemble, nos travaux montrent que le trafic des GluN2B-­‐RNMDA corticaux représente un mécanisme cellulaire majeur conditionnant le devenir des traces mnésiques (i.e. stabilisation versus oubli) et apporte un éclairage nouveau sur la façon dont le cerveau organise les souvenirs récents et anciens.

Complex and dynamic protein-protein interactions are the core of protein-based networks in cells. At excitatory synapses, the postsynaptic density (PSD) is a typical example of protein-based network whose nanoscale structure and composition determines the cellular function. For instance, the dynamic regulation of PSD composition and glutamate receptors movements into or out of the PSD are the base of current molecular theories of learning and memory. In this context, during my PhD, I focused on a class of protein-protein interactions mediated by PDZ domains. Indeed, over the last decade, numerous studies have shown the critical implication of PDZ domain-mediated interactions from the PSD95 scaffolding protein family in the synaptic targeting and anchoring of glutamate receptors. However, in part due to the lack of adapted tools, the molecular mechanisms that dynamically govern their respective synaptic retention remain poorly understood. In order to investigate these PDZ domain-mediated interactions, I developed several selection strategies by phage-display based on the fibronectin type III (FN3) scaffold in order to either target the PDZ domain-binding motifs of the receptors complexes (e.g., stargazin for AMPARs and GluN2A for NMDARs) or the PDZ domains themselves. Using a multidisciplinary approach, my main objectives were to engineer small synthetic antibodies that will allow us to acutely and specifically disrupt or stabilize these protein complexes, as well as monitor endogenous interactions., Les interactions protéine-protéine (IPPs), complexes et dynamiques, sont le cœur des réseaux protéiques cellulaires. Au niveau des synapses excitatrices, la densité post-synaptique (PSD) est un exemple typique de réseau protéique dont la structure et la composition à l’échelle nanoscopique détermine la fonction cellulaire. Ainsi, la régulation dynamique de la composition de la PSD et des mouvements des récepteurs au glutamate dans ou hors de la PSD constitue la base des théories moléculaires actuelles sur l’apprentissage et la mémoire. Dans ce contexte, durant ma thèse, j’ai étudié une classe d’IPPs faisant intervenir les domaines PDZ. En effet, durant ces dernières années, de nombreuses études ont démontré l’implication de ces interactions impliquant les domaines PDZ de la famille de PSD95 dans le ciblage synaptique et l’ancrage des récepteurs au glutamate. Cependant, en partie dû au manque d’outils adaptés, les mécanismes moléculaires sous-jacents qui contrôlent de façon dynamique leur rétention à la synapse restent mal compris. Dans le but d’étudier ces interactions impliquant des domaines PDZ, j’ai développé plusieurs stratégies de sélection par phage display basées sur l’utilisation du dixième domaine de type III de la fibronectine humaine (10Fn3) dans le but de cibler les motifs d’interaction aux domaines PDZ des récepteurs (Stargazin pour les rAMPA et GluN2A pour les rNMDA) ou les domaines PDZ eux-mêmes. En utilisant une approche multidisciplinaire, mes objectifs principaux ont été de concevoir de petits anticorps synthétiques qui nous permettront de rompre ou de stabiliser spécifiquement ces complexes protéiques, ainsi que d’observer les interactions endogènes.

Clathrin mediated endocytosis (CME) is a fundamental process of all eukaryotic cells. At the level of the plasma membrane, it is characterized by the formation of deep invaginations resulting in the creation of small vesicles after membrane scission by dynamin. In the central nervous system, it is involved in the expression of synaptic long term depression, a proposed cellular correlate of learning and memory. The complex morphology of neurons and the precise timing of neuronal firing suggest that endocytosis may be spatially and temporally regulated in those cells. The aim of the work presented here was to develop new tools to visualize and perturb CME in order to study such regulation. The first tool to be characterized was pHuji, a genetically encoded red pH-sensor. I used it in combination with an existing green pHsensor to demonstrate that in NIH-3T3 cells, the β2-adrenergic receptor was internalized in a subset of vesicles containing the constitutively endocytosed transferrin receptor. The second tool is a new imaging method that allowed me to monitor the endocytic activity of optically stable clathrin coated structures in hippocampal neurons. I was thus able to visualize for the first time the kinetics of internalization of AMPA-type glutamate receptors under plasticity inducing conditions. Finally, I set up an assay combining imaging and cell dialysis in order to develop a specific peptide-based inhibitor of CME. Using dimeric peptides, I found that the interplay between dynamin and its binding partners relies on multimeric interactions. Altogether, this work provides a toolbox to decipher the mechanisms of vesicle formation with high spatial and temporal resolution., L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est un processus fondamental des cellules eucaryotes. Elle se caractérise par la formation d’invaginations à la membrane plasmique aboutissant à la création de petites vésicules par l’action de la dynamine. Dans le cerveau, elle est impliquée dans la dépression synaptique à long terme, un corrélat cellulaire de la mémoire. La morphologie complexe des neurones et le contrôle précis du code neuronal suggèrent qu’elle puisse être régulée spatialement et temporellement dans ces cellules. Le but de mon travail a été de développer de nouveaux outils pour visualiser et perturber l’EDC afin d’étudier ce type de régulation. Le premier de ces outils est pHuji, un senseur de pH rouge génétiquement encodable. Je l’ai utilisé avec un senseur de pH vert existant pour montrer que dans les cellules NIH- 3T3, le récepteur β2-adrénergique est internalisé dans une sous-population de vésicules contenant le récepteur à la transferrine constitutivement endocyté. Le deuxième est une nouvelle méthode d’imagerie permettant de visualiser l’activité d’endocytose de structures recouvertes de clathrine optiquement stables dans des neurones d’hippocampe. J’ai ainsi pu suivre pour la première fois la cinétique d’internalisation de récepteurs au glutamate de type AMPA dans des conditions de plasticité. Enfin, j'ai élaboré un test combinant imagerie et patch-clamp afin de développer un bloqueur peptidique spécifique de l'EDC. En utilisant des peptides dimériques, j’ai montré que la dynamine se lie à ses partenaires via des interactions multimériques. En conclusion, ce travail propose une boite à outils permettant d’élucider les mécanismes de l’EDC avec une grande résolution spatiale et temporelle.

Planar cell polarity (PCP) signaling is an evolutionary conserved pathway known to play a crucial role in the establishment of tissue polarity via a regulation of cytoskeleton dynamics. PCP signaling is essential during critical developmental stages, such as gastrulation or neurulation, to shape tissues and organs, and disruption of core PCP genes in mammals leads to severe malformations and neonatal death. Van Gogh-like 2 (vangl2) is one of the core PCP genes coding for a transmembrane protein, and its mutation leads to a failure of the neural tube closure in mammals, including humans. It has also been suggested that Vangl2 plays a role in axonal guidance, dendritic arborization of hippocampal neurons and dendritic spines number. I showed that Vangl2 protein is enriched in the hippocampus in the adult stage, precisely in the dentate gyrus (DG) and CA3 stratum lucidum subregions. These subregions have been proposed to sustain two cognitive processes involved in memory functions: pattern separation and pattern completion. Pattern separation allows the encoding of similar or overlapping inputs in distinct neuronal representations, allowing formation of new memory without interference of a previous similar encountered event. Pattern completion is described as the ability to guide the recall of an entire memory using partial sensory cues. Recent studies suggest a critical role for the maturation of adult-born granule neurons of the DG in the balance that may exist between pattern completion and pattern separation. Although the mechanisms of both cognitive processes are still debated, the connectivity between DG and CA3 appears to be essential. I thereby tested the hypothesis that in absence of Vangl2 in the brain, these two processes would be affected. I generated several conditional mutant mice in order to excise vangl2 gene in specific areas of the hippocampus, and tested them in behavioral paradigms requiring pattern separation or pattern completion processes. My data support my hypothesis that Vangl2 in the DG is essential for a balance between pattern separation and pattern completion, through the regulation of the maturation of DG neurons., La polarité cellulaire planaire (PCP) est une voie de signalisation conservée au fil de l’évolution et qui joue un rôle crucial dans l’établissement de la polarité des cellules et tissues en régulant la dynamique du cytosquelette. De nombreuses études ont démontré l’implication de la PCP dans les mécanismes développementaux importants comme la gastrulation ou la neurulation chez les mammifères, et la mutation des gènes centraux qui composent la PCP mène à de sévères malformations de nombreux organes, et par conséquent une mort néonatale. Van Gogh-like 2 (vangl2) est un des gènes centraux de la PCP et code pour une protéine transmembranaire de la voie de la PCP, et sa mutation conduit à une absence de fermeture de la gouttière neurale et la mort à la naissance chez les mammifères, y compris l'homme. Certaines études suggèrent que Vangl2 jouerait un rôle dans le guidage axonal, mais aussi l’arborisation dendritique des neurones de l’hippocampe et le nombre des épines dendritiques.Dans ce travail, je montre que Vangl2 est enrichi dans l’hippocampe adulte de souris, et plus précisément dans le gyrus denté (DG) et le stratum lucidum du CA3. De nombreuses études suggèrent que le réseau formé par ces sous-structures sous-tend des processus cognitifs spécifiques impliqués dans l’encodage et le rappel de la mémoire : le pattern separation et le pattern completion. Le pattern separation est un processus d’encodage d’informations similaires en représentations différentes, permettant la formation de souvenirs distincts malgré les similitudes entre les évènements. Le processus de pattern completion permet, à partir de stimuli partiels, de se remémorer un souvenir dans son intégralité. De récentes études suggèrent que la maturation des nouveaux neurones issus de la neurogenèse adulte dans le DG joue un rôle critique dans le maintien d'une balance qui existerait entre ces deux processus cognitifs. Bien que les mécanismes qui sous-tendent les deux processus soient encore mal compris, la connectivité du DG et du CA3 semble essentielle.J’ai ainsi formulé et testé l'hypothèse selon laquelle l'absence d'expression de Vangl2 affecterait ces processus mnésiques. Pour ceci, j'ai généré plusieurs mutants murins n'exprimant pas le gène vangl2 dans différentes régions du cerveau, que j'ai ensuite testé dans des paradigmes comportementaux requérant l’utilisation des processus de pattern separation et de pattern completion. Mes résultats suggèrent que Vangl2 dans le DG est essentiel dans le maintien d'une balance existante entre les deux processus, en régulant la maturation des neurones du DG.

N-Methyl-D-Aspartate glutamate receptors (NMDAR) are key actors of excitatory synaptic transmission, synaptic plasticity and higher brain functions such as memory formation and learning. As a consequence, NMDAR dysfunctions are associated to pathological states and high investments have been made to develop modulators of NMDAR activity for clinical applications. While some NMDAR antagonists such as ketamine (anesthetic, antidepressant) or memantine (prescribed as a treatment for Alzheimer’s disease) have proven of great medical value, their clinical use is often limited by severe adverse effects (e.g. psychotic-like states induced by ketamine) and several questions regarding their action mode - including why some antagonists exhibit psychoactive properties when others do not - remain unanswered. Accumulating evidence suggests that beyond their channel function, physiological and pathological NMDAR signaling may involve non-canonical pathways independent from ion flux. Using a combination of epifluorescence, FRET-FLIM, biochemistry and single molecule localization microscopy approaches, we investigated the impact of competitive (D-AP5, CPP) and uncompetitive (MK-801, ketamine, memantine) NMDAR antagonists on the properties, redistribution and subsynaptic organization of surface NMDAR and their cytosolic partners in hippocampal neurons. We found that while all antagonists produce comparable inhibition of NMDAR ionotropic activity, exposure to the psychotomimetic blockers MK-801 and ketamine selectively triggers changes in the conformation of NMDAR. Interestingly, these conformational rearrangements were associated with a decreased surface diffusion and an increased residency time of receptors at synapses, suggesting MK-801 and ketamine binding possibly enhance NMDAR synaptic anchoring. Although drug exposure (1h) did not change the overall receptor abundance at excitatory synapses, super-resolution imaging revealed profound and antagonist-specific nanoscale reorganizations of synaptic NMDAR clusters, with exposure to the competitive antagonist D-AP5 causing a reduction in the size and an increase in the density of receptor nanodomains while inhibition by the uncompetitive psychotomimetic blockers MK-801 and ketamine triggered an enlargement of receptor nanodomains, and exposure to memantine prompted the fragmentation of these nanodomains. Moreover, we found that MK-801 and ketamine selectively enhanced the mobility of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) within dendritic spines through an action mode that relies on the direct interaction between both partners, suggesting that drug-induced receptor redistributions may impact the intracellular dynamics and organization of downstream signaling partners of NMDAR. Altogether, our results provide evidence that besides inhibition of ion fluxes through the receptors, competitive and uncompetitive antagonists have a different impact on NMDAR surface dynamics and subsynaptic organization, and suggest that the psychoactive blockers MK-801 and ketamine may act on receptor function through non-canonical rearrangements in the organization of NMDAR signaling complexes.; Les récepteurs du glutamate N-méthyl-D-aspartate (RNMDA) sont des acteurs clés de la transmission synaptique excitatrice, de la plasticité synaptique et des fonctions cérébrales supérieures telles que la formation de la mémoire et l'apprentissage. En conséquence, les dysfonctionnements NMDAR sont associés à des maladies neuropsychiatriques sévères et des investissements importants ont été réalisés pour développer des modulateurs de l'activité NMDAR en vue d’applications cliniques. Si certains antagonistes des RNMDA comme la kétamine (anesthésique, antidépresseur) ou la mémantine (prescrite dans le traitement de la maladie d'Alzheimer) se sont avérés d'une grande valeur médicale, leur utilisation clinique est souvent limitée par des effets indésirables graves (ex.: états psychotiques induits par la kétamine) et plusieurs questions concernant leur mode d'action - y compris pourquoi certains antagonistes présentent des propriétés psychoactives alors que d'autres non - restent sans réponse. De nombreuses données suggèrent qu'au-delà de leur fonction de canal, la signalisation RNMDA physiologique et pathologique peuvent impliquer des voies non canoniques indépendantes du flux ionique. En utilisant une combinaison d'approches d'épifluorescence, de FRET-FLIM, de biochimie et de microscopie de localisation de molécule unique, nous avons étudié l'impact des antagonistes RNMDA compétitifs (D-AP5, CPP) et non-compétitifs (MK-801, kétamine, mémantine) sur les propriétés, la redistribution et l’organisation nanométrique des RNMDA de surface et de leurs partenaires cytosoliques dans les neurones d'hippocampe. Nous avons constaté que si tous les antagonistes produisent une inhibition comparable de l'activité ionotrope des récepteurs, l'exposition aux bloqueurs psychomimétiques MK-801 et kétamine déclenche sélectivement des changements de conformation des RNMDA. Ces réarrangements conformationnels sont associés à une diminution de la diffusion de surface et à une augmentation du temps de résidence des récepteurs aux synapses, suggérant que le MK-801 et la kétamine accroissent l'ancrage synaptique des RNMDA. Bien que l'exposition aux drogues (1h) ne modifie pas l'abondance globale des récepteurs aux synapses, l'imagerie de super-résolution révèle des réorganisations nanométriques profondes et antagoniste-spécifiques des clusters de RNMDA synaptiques, une exposition à l'antagoniste compétitif D-AP5 entraînant une réduction de la taille et une augmentation de la densité des nanodomaines de récepteurs tandis que l'inhibition par les bloqueurs psychotomimétiques non compétitifs MK-801 et kétamine déclenche un élargissement des nanodomaines récepteurs, et que l'exposition à la mémantine provoque la fragmentation de ces nanodomaines. De plus, nous avons constaté que le MK-801 et la kétamine augmentent de manière sélective la mobilité de la protéine kinase Ca2+/calmoduline-dépendante (CaMKII) dans les épines dendritiques via un mode d'action qui repose sur l'interaction directe entre les deux partenaires, suggérant que les redistributions des récepteurs induites par les antagonistes pourraient avoir un impact sur la dynamique intracellulaire et l'organisation des partenaires de signalisation en aval des RNMDA. Dans l'ensemble, nos résultats montrent qu'en plus de l'inhibition des flux ioniques à travers les récepteurs, les antagonistes compétitifs et non compétitifs ont un impact différent sur la dynamique de surface et l'organisation sous-synaptique des NMDAR, et suggèrent que les bloqueurs psychoactifs MK-801 et kétamine peuvent agir sur la fonction des récepteurs via des réarrangements non-canoniques de l'organisation des complexes de signalisation RNMDA.

The brain is made up of billions of nerve cells, or neurons. Neurons communicate with each other through functionally distinct structures - the axon and the dendrite - which are able to release and receive an electrical or chemical signal from a pre- to a post-synaptic compartment, respectively. We focused our study on hippocampal neurons synapses, which ultimately underlie high-order brain functions, such as learning and memory. In particular, we studied the development and maintenance of dendritic spines, whose changes in morphology are intimately correlated with synaptic plasticity, or the ability to respond to synaptic activity. Dendritic spines originate from motile dendritic filopodia, which mature into spines following axonal contact. The filopodia-to-spine transition involves a plethora of molecular actors, including glutamate receptors, scaffold proteins and the actin cytoskeleton, able to receive, transmit and integrate the pre-synaptic signal. The spatial and temporal coordination of all these molecular components throughout the formation and maturation of a synapse remains, however, unclear. Scribble1 (Scrib1) is planar cell polarity protein (PCP) classically implicated in the homeostasis of epithelial tissues and tumour growth. In the mammalian brain, Scrib1 is a critical scaffold protein in brain development and function. The main goal of this work was, therefore, to investigate the molecular mechanisms underlying Scrib1 role in synapse formation and maintenance. In a first part, we depict the importance of Scrib1 PDZ-dependent interactions on glutamate receptors trafficking as well as bidirectional plasticity signalling pathway underying spatial memory. In a second part, we focus on the functional consequences of a recently identified autism spectrum disorder (ASD) mutation of Scrib1 on neuronal morpholgy and function. We demonstrated that Scrib1 regulates dendritic arborization as well as spine formation and functional maintenance via an actin-dependent mechanism, whose disruption might underlie the ASD phenotype. Taken altogether, this thesis highlights the PCP protein Scrib1 as key scaffold protein in brain development and function, playing a plethora of roles from the subcelular to the cognitive level., Le cerveau contient environ cent milliards de cellules nerveuses, ou neurones. Ces neurones communiquent entre eux par des structures fonctionnellement distinctes – l’axone et la dendrite – capables d’émettre et recevoir des signaux électriques ou chimiques à partir d’un compartiment présynaptique vers un compartiment, dit post-synaptique. Nous avons focalisé notre étude sur les synapses des neurones hippocampiques, qu’on estime responsables de fonctions cérébrales dites supérieures, comme la mémoire et l’apprentissage. Plus particulièrement, on s’est intéressé au développement et au maintien des épines dendritiques, dont les changements morphologiques sont intimement liés à la plasticité synaptique, autrement dit, capacité de réponse à l’activité synaptique. Les épines dendritiques ont pour origine les filopodes qui évoluent en épines lors du contact axonal. La transition entre filopode et épine implique une myriade de molécules, dont des récepteurs glutamatergiques, des protéines d’échafaudage et du cytosquelette d’actine capables de recevoir, transmettre et intégrer le signal présynaptique. Cependant, la coordination spatiale et temporelle de tous ces composants moléculaires au long de la formation et maturation d’une synapse reste largement méconnue.Scribble1 (Scrib1) est une protéine de polarité cellulaire (PCP) classiquement impliquée dans l’homéostasie de tissues épithéliaux ainsi que dans la croissance et progression des tumeurs. Scrib1 est aussi une protéine d’échafaudage critique pour le développement et le bon fonctionnement du cerveau. L’objectif de cette étude a donc été d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à un rôle potentiel de Scrib1 dans la formation et le maintien des synapses. Dans un premier temps, on a décrit l’importance d’interactions dépendantes des domaines PDZ sur le trafic des récepteurs glutamatergiques ainsi que sur la voie de signalisation de plasticité synaptique sous-jacente à la mémoire spatiale. Dans un second temps, nous avons évalué les conséquences fonctionnelles d’une mutation de Scrib1 récemment identifiée chez un patient humain atteint des troubles du spectre autistique (TSA) dans la morphologie et fonction des neurones. On a démontré que Scrib1 régule l’arborisation dendritique ainsi que la formation et le maintien fonctionnel des épines dendritiques via un mécanisme dépendent du cytosquelette d’actine. Le dérèglement de ces mécanismes pourrait être à l’origine du phénotype TSA. L’ensemble de ce travail met en évidence que Scrib1, protéine d’échafaudage clé dans le développement et la fonction du cerveau, joue une multitude de rôle du niveau subcellulaire au niveau cognitif.