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Mestrado em Biologia Molecular e Celular Microglial cells are the resident immune cells of central nervous system (CNS) and the major players in neuroinflammation. These cells are also responsible for surveilling the neuronal microenvironment, and upon injury to the CNS they change their morphology and molecular profile and become activated. Activated status is associated with microglia proliferation, migration to injury foci, increased phagocytic capacity, production and release of reactive oxygen species (ROS), cytokines (pro- or anti-inflammatory) and reactive nitrogen species. Microglia activation is crucial for tissue repair in the healthy brain. However, their chronic activation or deregulation might contribute for the pathophysiology of neurodegenerative diseases. A better understanding of the mechanisms underlying microglial cell activation is important for defining targets and develop appropriate therapeutic strategies to control the chronic activation of microglia. It has been observed an increase in profilin (Pfn) mRNA in microglial cells in the rat hippocampus after unilateral ablation of its major extrinsic input, the entorhinal cortex. This observation suggested that Pfn might be involved in microglia activation. Pfn1 is an actin binding protein that controls assembly and disassembly of actin filaments and is important for several cellular processes, including, motility, cell proliferation and survival. Here, we studied the role of Pfn1 in microglial cell function. For that, we used primary cortical microglial cell cultures and microglial cell lines in which we knocked down Pfn1 expression and assessed the activation status of microglia, based on classical activation markers, such as: phagocytosis, glutamate release, reactive oxygen species (ROS), pro- and anti-inflammatory cytokines. We demonstrated that Pfn1 (i) is more active in hypoxia-challenged microglia, (ii) modulates microglia pro- and anti-inflammatory signatures and (iii) plays a critical role in ROS generation in microglia. Altogether, we conclude that Pfn1 is a key protein for microglia homeostasis, playing an essential role in their activation, regardless the polarization into a pro or anti-inflammatory signature. As células da microglia são células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel importante em processos neuroinflamatórios. Estas células são responsáveis por monitorizar o parênquima neuronal, sendo capazes de responder rapidamente a danos no SNC. Após ativação, a microglia altera a sua morfologia e o seu perfil de expressão de proteínas. O processo de ativação induz a proliferação, migração para a foco da lesão, aumento da capacidade fagocítica, bem como produção e libertação de espécies reativas de oxigénio (EROs), espécies reativas de azoto e citocinas (pro- e anti-inflamatórias). A ativação da microglia é essencial para a reparação de tecidos e a manutenção da homeostasia do SNC. No entanto, a ativação crónica ou a sua desregulação podem contribuir para a patofisiologia de doenças neurodegenerativas. Assim sendo, o estudo dos mecanismos subjacentes à ativação das células da microglia é importante para ajudar a definir e desenvolver estratégias terapêuticas apropriadas para prevenir a sua ativação crónica. Um estudo anterior reportou o aumento dos níveis de RNAm da profilina (Pfn) em células da microglia no hipocampus de ratos após lesão unilateral no córtex entorrinal, sugerindo que a Pfn poderá estar envolvida no processo de ativação da microglia. A Pfn1 é uma proteína de ligação à actina que regula a polimerização do citoesqueleto de actina, sendo importante em diversos processos celulares, incluindo motilidade, proliferação e sobrevivência. Neste trabalho, nós estudamos o papel da Pfn1 na função da microglia. Para tal, utilizamos linhas celulares e células primárias de microglias corticais de rato nas quais reduzimos a expressão da Pfn1 e avaliamos o seu estado de ativação com base em marcadores clássicos de ativação, tais como: fagocitose, libertação de glutamato, produção e libertação de EROs e citocinas pro- e anti-inflamatórias. Nós demonstramos que a Pfn1 (i) se encontra mais ativa após estímulo da microglia por hipoxia, (ii) modula as assinaturas pro- e anti-inflamatória da microglia e (iii) desempenha um papel importante na produção de EROs pela microglia. Nesse estudo concluímos que a Pfn1 é uma proteína importante para o funcionamento da microglia, desempenhando um papel essencial na ativação da microglia, independentemente da polarização pró ou anti-inflamatória.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-05-31T10:09:08Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3668217 bytes, checksum: 4ff28c6c5599a46f168532f4c0c78195 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-31T10:09:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3668217 bytes, checksum: 4ff28c6c5599a46f168532f4c0c78195 (MD5) Previous issue date: 2015-07-31

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Daisy Tavares (daisytavares@ua.pt) on 2015-01-29T16:23:21Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2372062 bytes, checksum: 61f4bdf1a001d4fdce3ba6c31cb09b34 (MD5) Made available in DSpace on 2015-01-29T16:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2372062 bytes, checksum: 61f4bdf1a001d4fdce3ba6c31cb09b34 (MD5) Previous issue date: 2014

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Obesity is one of the leading causes of health care issues all over the world. A large slice of the worldwide population develops co-morbidities as a consequence of this condition, such as type 2 diabetes mellitus (T2DM), atherosclerosis, fatty liver, cardiovascular diseases and even some cancers, conditions that are associated with reduced life expectancy. The inefficiency of current therapies that aim to treat obesity leads to further investigation on novel therapeutic targets for this condition, including modulation of white adipose tissue (WAT). In WAT, glucose and lipid metabolism converge into triglyceride/ glycerol + free fatty acid (TG/ (GL + FFA)) cycle, which is considered a futile cycle since it doesn’t generate products while consuming energy substrates. The decreased activity of this cycle in obesity, decreases substrates oxidation and increases free fatty acids (FFA) storage in WAT. If coupled to increased mitochondrial β-oxidation, modulation of TG/ (GL+FFA) cycling provides an attractive therapeutic target to stimulate fat mobilization and prevent WAT dysfunction. Currently there are no known strategies that simultaneously stimulate both these processes. Chenodeoxycholic acid (CDCA) is a bile acid known for its anti-obesity effects; however the mechanism of action is still controversial. CDCA activates both peroxisome proliferator activating receptor (PPAR) α and PPARγ, regulators of the transcription of key metabolic genes involved in the TG/ ( GL+FFA) cycle, mitochondrial oxidative capacity and FFA oxidation. As such, we hypothesized that CDCA mediates the coupling of futile cycles with energy expenditure in WAT, increasing simultaneously futile acid activity and mitochondrial substrates oxidation. This work focused on evaluating the metabolic alterations of TG/ (GL+FFA) cycle, in culture 3T3-L1 cells exposed to CDCA. Specifically, we addressed if CDCA supplementation alters the TG/ (GL+FFA) cycle activity, if this was related to improved metabolic status and if mitochondrial metabolism was involved. Cultured 3T3-L1 cells exposed to CDCA exhibit decreased lipid accumulation and an increase in uncoupling protein-1 (UCP-1) content, which in turn leads to a decrease in reactive oxygen species (ROS) generation. CDCA also leads to an increase in glyceroneogenesis, suggesting an increase activity in TG/ (GL+FFA) cycle activity. Indeed, these results show that administration of CDCA seems to be an attractive therapy to obesity and T2DM. However, a question still remains, what leads to a reduction in triglycerides (TG) accumulation? Based on our results CDCA up-regulates genes involved in β-oxidation and mitochondrial biogenesis, but there are no differences in fatty acid oxidation between control and cell exposed to CDCA. A possible explanation is that lipids are being exported to the medium. However this is an in vitro study, it would be interesting understand the destination of this lipids in vivo. Finally the possible occurrence of metabolic compartmentalization opens new perspectives in futures works. A obesidade é um dos principais problemas de saúde pública a nível mundial. A grande maioria da população obesa desenvolve patologias associadas que consequentemente levam à diminuição da esperança média de vida. Estas incluem diabetes tipo 2 (T2DM), aterosclerose, esteatose hepática, doenças cardiovasculares e ainda alguns tipos de cancro, Dado que as estratégias atuais são ainda pouco eficazes, no que se refere ao tratamento da obesidade, é urgente que se investiguem novas terapias, nomeadamente a modulação do tecido adiposo branco (WAT). No WAT, as vias metabólicas da glicose e dos lípidos convergem no ciclo dos glicerolípidos/ácidos gordos livres (TG/ (GL+FFA)), sendo este considerado um ciclo fútil dado que não gera produtos enquanto consome substratos energéticos. A diminuição da atividade deste ciclo em situações de obesidade e diabetes diminui a oxidação de substratos e aumenta o armazenamento de ácidos gordos (FFA) no WAT. Assim, a estimulação deste ciclo fútil surge como um potencial alvo terapêutico. Porém, a oxidação de substratos implica a estimulação simultânea do ciclo fútil e da função mitocondrial sendo que, até à data, não existe um mecanismo capaz de acoplar estes processos. O ácido quenodesoxicólico (CDCA) é um ácido biliar conhecido pelos seus efeitos anti-obesidade, no entanto, o seu mecanismo de ação é ainda controverso. O CDCA activa dois reguladores da transcrição de genes metabólicos envolvidos no ciclo TG/ (GL+FFA), na capacidade oxidativa mitocondrial e na β-oxidação, o PPARα e o PPARγ. Assim, a nossa hipótese propõe que o CDCA medeia o acoplamento do ciclo fútil com o gasto energético no WAT, aumentando simultaneamente as taxas de atividade do ciclo fútil e de oxidação mitocondrial de substratos. Este trabalho foca-se na avaliação das alterações metabólicas no ciclo TG/ (GL+FFA), na linha celular 3T3-L1, induzidas pelo CDCA. Especificamente, avaliou-se se a exposição ao CDCA altera a atividade deste ciclo, se essa alteração está relacionada com uma melhoria no perfil metabólico e ainda se o metabolismo mitocondrial está envolvido. As células expostas ao CDCA demonstraram uma diminuição na acumulação de lípidos e um aumento no conteúdo de proteína desacopladora-1 (UCP-1), o que por sua vez diminui a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Adicionalmente, a exposição ao CDCA induziu um aumento na gliceroneógenese, sugerindo, assim, um aumento na atividade do ciclo TG/ (GL+FFA). Dessa forma, a administração de CDCA parece ser uma estratégia terapêutica atrativa no combate à obesidade e à T2DM. No entanto, uma questão mantém-se, o que leva à redução da acumulação dos triglicerídeos (TG)? Com base nos resultados obtidos, o CDCA aumenta a expressão dos genes envolvidos na β-oxidação e na biogénese mitocondrial, mas não existem diferenças na oxidação dos FFA entre o controlo e as células expostas ao CDCA. Uma possível explicação é que os lípidos estejam a ser exportados para o meio. No entanto, este é um estudo in vitro, logo seria interessante perceber o destino destes lípidos in vivo. Finalmente a possível ocorrência de compartimentalização metabólica abre novas perspectivas para trabalhos futuros.

Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, sob orientação dos Professores Doutores Carlos Manuel Marques Palmeira, Anabela Pinto Rolo e João António Nave Laranjinha, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Mitochondria are key players in the maintenance of cellular homeostasis, as they provide the energy required for the cellular processes. As such, disruption in mitochondrial homeostasis is closely associated with disease state, caused by subtle alterations in the function of tissues or by major defects, which might lead to death. Therefore, regulation of mitochondrial homeostasis is extremely important for the cell, and is dependent on the regulation of mitochondrial mass through its production (biogenesis). Indeed, physiologic stimuli can activate signaling pathways that coordinate the communication between the nuclear and mitochondrial genomes to produce efficient mitochondria, and adapt the metabolism of the cell. Sirtuin1 (SIRT1) is a metabolic sensor that has been shown to be associated with several metabolic and age-related diseases, which are also correlated with disruption of mitochondrial homeostasis. SIRT1 has been shown to regulate mitochondrial biogenesis by activating the master regulator of mitochondrial biogenesis, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha (PGC-1α), however the role of SIRT1 in mitochondrial biology in vivo remains yet to be studied, due to lack of appropriated animal models. As so, this work aimed to investigate the role of SIRT1 in mitochondrial biology, as well as its potential involvement in the mitochondrial-related beneficial effects of two natural compounds with therapeutic potential, resveratrol and berberine. Using an adult-inducible whole body SIRT1 knockout mouse, the work in this thesis showed that SIRT1 has a dual role in the regulation of mitochondrial metabolism. On one hand, in conditions of low nutrient supply, SIRT1 activates PGC-1α and thereby induces mitochondrial biogenesis. On the other hand, in this thesis is presented for the first time, that in conditions of normal nutrient supply SIRT1 regulates mitochondrial DNA and the expression of mitochondrial-encoded genes through regulation of mitochondrial transcription factor A (TFAM) promoter. This mechanism is PGC-1α independent and mediated by a hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF1α) and myelocytomatosis viral oncogene homolog” (c-Myc) pathway. Indeed, loss of SIRT1 leads to HIF1α stabilization and consequently to an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrialencoded genes that culminates in mitochondrial dysfunction. In addition, its shown that this PGC-1α independent pathway is also relevant for the development of age-related mitochondrial dysfunction. Indeed, here its shown that increasing SIRT1 activity in old mice reverses mitochondrial dysfunction, promotes functional communication between nuclear and mitochondrial-encoded genes as well as reverses the age-induced HIF1α stabilization. Lastly, here is also analysed the role of SIRT1 in the effects of both resveratrol and berberine in the maintenance of mitochondrial homeostasis. Resveratrol and berberine are natural compounds that have been demonstrated to protect from metabolic disturbances frequently associated with decline in mitochondrial function. Importantly, and in accordance with the pivotal role of SIRT1 in mitochondrial biology, both resveratrol and berberine were unable to preserve mitochondrial biogenesis and function from either high fat diet or hyperglycemic conditions in the absence of SIRT1. Giving further support to this, overexpression of SIRT1 in vivo showed an increase in mitochondrial function and biogenesis in the skeletal muscle. Together, these results show that increasing SIRT1 leads to increase mitochondrial biogenesis and consequently to more efficient mitochondria and represents an advantage in conditions of mitochondrial overload, such as high nutrient supply. Importantly, both resveratrol and berberine were previously shown to activate another metabolic sensor, the AMPactivated kinase (AMPK). AMPK and SIRT1 have many common targets as well as overlapping effects in the cell, therefore the epistasis of SIRT1 and AMPK have been hard to dissect. Here its shown not only that SIRT1 overexpression is sufficient to activate AMPK in the skeletal muscle, but also that SIRT1 is required for the ability of resveratrol and berberine to activate AMPK at moderated doses. Together the work presented in this thesis, show for the first time the role of SIRT1 in mitochondrial biology in vivo, as well as the importance of SIRT1 for the biological effects of resveratrol and berberine. In addition, this work also unravels a new pathway, regulated by SIRT1 and independent of PGC-1α, that regulates mitochondrial homeostasis and plays an important role in the development of age-related mitochondrial dysfunction. As such, the work presented in this thesis supports the idea that activation of SIRT1 is an important therapeutic strategy for the treatment of age and metabolic-related disorders where mitochondrial homeostasis is disturbed. As mitocôndrias são consideradas as centrais energéticas da célula, e desempenham um papel central na manutenção da homeostasia celular, uma vez que são elas que produzem a energia necessária para a execução dos processos celulares. Desta forma, distúrbios na homeostasia mitocondrial estão intimamente associados a estados de doença, causados por alterações subtis na função de cada órgão, sendo que alterações mais dramáticas podem culminar em morte. Assim sendo, a regulação da homeostasia mitocondrial é em última análise extremamente importante para a manutenção do equilíbrio celular. Tal está dependente da regulação da massa mitocondrial (biogénese). Estímulos fisiológicos diversos ativam vias de sinalização que coordenam a comunicação entre os genomas nuclear e mitocondrial, permitindo a formação de mitocôndrias eficientes. A Sirtuina 1 (SIRT1) é um sensor metabólico que tem sido implicado no desenvolvimento de patologias metabólicas e relacionadas com a idade, as quais também se relacionam com perturbações no equilíbrio mitocondrial. A SIRT1 modula a biogénese mitocondrial mediante a ativação do principal regulador deste processo, o co-activador do receptor activado por proliferadores de peroxissoma gamma 1 alfa (PGC-1α). No entanto, o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial in vivo permanece ainda por estudar, devido à falta de modelos animais adequados. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo investigar o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial, bem como o seu possível envolvimento nos efeitos benéficos mitocondriais de dois compostos naturais com potencial terapêutico, o resveratrol e a berberina. Estudos conduzidos em murganhos em que o knockout para a SIRT1 é induzido na idade adulta, demostram um papel duplo da SIRT1 na regulação do metabolismo mitocondrial. Por um lado, nesta tese é demonstrado que, em condições de reduzida disponibilidade de nutrientes, a SIRT1 ativa o PGC-1α e, assim, induz a biogénese mitocondrial. Por outro lado, é também demonstrado pela primeira vez que, em condições normais de disponibilidade de nutrientes, a SIRT1 regula o ADN mitocondrial e a expressão de genes codificados pelo ADN mitocondrial, através da regulação do promotor do factor de transcrição mitocondrial A (TFAM). Este mecanismo é independente da ativação do PGC-1α, sendo regulado por uma via de sinalização mediada pelo factor de transcrição induzível por hipóxia 1 alfa (HIF1α) e pelo protooncogene “myelocytomatosis viral oncogene homolog” (c–Myc). De fato, a perda de SIRT1 leva à estabilização do HIF1α e, consequentemente, a um desequilíbrio entre a expressão de genes codificados pelos genomas nuclear e mitocondrial, culminando em disfunção mitocondrial. Adicionalmente, é também demonstrado nesta tese que esta via independente de PGC-1α parece ser relevante para a disfunção mitocondrial associada ao envelhecimento. De facto, os resultados aqui apresentados, demostram que o aumento da atividade da SIRT1 em murganhos idosos consegue reverter a disfunção mitocondrial, promovendo a comunicação funcional entre os genomas nuclear e mitocondrial, bem como reverte a estabilização do HIF1α causada pelo envelhecimento. Por último, é também aqui analisado o papel da SIRT1 nos efeitos do resveratrol e da berberina na manutenção da homeostasia mitocondrial. O resveratrol e a berberina são compostos naturais protetores em situações de distúrbio metabólico, frequentemente associados ao declínio da função mitocondrial. De facto, e em conformidade com o papel central da SIRT1 na biologia mitocondrial, tanto o resveratrol como a berberina, na ausência de SIRT1, não têm a capacidade de preservar a biogénese e função mitocondriais do dano causado por uma dieta rica em gordura ou por condições de hiperglicémia. Da mesma forma, a sobreexpressão de SIRT1 in vivo, resulta num aumento da biogénese e função mitocondriais no músculo esquelético. Estes resultados demostram que o aumento da SIRT1 leva a um aumento da biogénese mitocondrial e consequentemente a mitocôndrias mais eficientes, o que é benéfico por exemplo em condições de sobrecarga de nutrientes, evitando assim o dano mitocondrial existente nestas situações e consequentemente mantendo a homeostasia celular. Foi previamente demonstrado que o resveratrol e a berberina conseguem ativar outro sensor metabólico, a cinase activada por AMP (AMPK). Atendendo a que AMPK e SIRT1 partilham alvos moleculares, os seus efeitos celulares muitas vezes sobrepõemse, dificultando a clarificação da epistasia entre SIRT1 e AMPK. Neste trabalho, é não só demonstrado que a sobrexpressão da SIRT1 é suficiente para activar a AMPK no músculo esquelético, como também que a SIRT1 é necessária para a activação da AMPK em condições de tratamento com doses moderadas de resveratrol e de berberina. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta tese, demonstra, pela primeira vez, o papel da SIRT1 na biologia mitocondrial in vivo, bem como a importância da SIRT1 para os efeitos biológicos do resveratrol e da berberina. Além disso, este estudo identifica também uma nova via, regulada pela SIRT1 e independente do PGC-1α, que modula a homeostasia mitocondrial e desempenha um papel importante no desenvolvimento da disfunção mitocondrial associada ao envelhecimento. Desta forma, os resultados apresentados nesta tese sustentam a ativação da SIRT1 como uma importante estratégia para o tratamento de doenças relacionadas com o envelhecimento e distúrbios metabólicos, em que existam desequilíbrios na função mitocondrial.

Mestrado em Biologia Aplicada As células estaminais embrionárias são caracterizadas pela sua capacidade de auto-renovação bem como pelo seu potencial de diferenciação em pluripotência. Estudos recentes demonstraram que as células estaminais pluripotentes possuem um baixo número de mitocôndrias e baixos níveis fosforilação oxidativa, utilizando preferencialmente a glicólise como fonte principal de ATP. Esta característica é partilhada com algumas células cancerígenas. O 3-bromopiruvato é um agente alquililante com efeitos antitumorais em vários modelos de tumores. Assim, o objectivo deste trabalho foi estudar o efeito do 3-bromopiruvato em células estaminais embrionárias de murganho. Para isso, foram usados estudos in vitro em células estaminais embrionárias de murganho (mESCs) para avaliar o efeito deste composto na pluripotência (através de marcadores como o Nanog e o Oct-4 e a fosfatase alcalina), na viabilidade e na actividade metabólica celular. Foi estudada a expressão das enzimas glicolíticas e a detecção do lactato extracelular bem como a actividade mitocondrial através da determinação do potencial membranar mitocondrial. Foram ainda quantificados os conteúdos em nucleótidos de adenosinas. Neste estudo, mostrou-se que o estado indiferenciado das células estaminais foi afectado sem no entanto perderem a viabilidade. Além disso, a glicólise e a mitocôndria pareceram também não ser afectadas com o tratamento de 3-bromopiruvato. Assim, apesar de afectar a pluripotência, o 3-bromopiruvato não afectou o metabolismo destas células pelo menos nos parâmetros analisados. Serão necessárias mais experiências para complementar este estudo de modo a perceber o efeito global do 3-bromopiruvato no metabolismo e pluripotência das células estaminais embrionárias de murganho. Embryonic stem cells are characterized by their ability for self-renewal and their differentiation potential in pluripotency. Recent studies demonstrated that undifferentiated pluripotent stem cells display a low number of mitochondria and lower levels of oxidative phosphorylation, and instead preferentially use glycolysis as a major source of ATP. This feature is shared with some cancer cells. 3-bromopyruvate is an alkylating agent with antitumor effects in several models of animal tumors. Thus, the aim of this work was to study the effect of 3-bromopyruvate in mouse embryonic stem cells. Therefore, in vitro studies using mouse embryonic stem cells (mESCs) were performed to assess the effect of this compound in pluripotency (by markers such as Nanog and Oct-4 and alkaline phosphatase), viability and metabolic activity of the cells. In metabolism it was studied the expression of glycolytic enzymes and the detection of extracellular lactate as well the mitochondrial activity by the detection of mitochondrial membrane potential. It was also studied and quantified the contents of adenosines nucleotides. In this study, it was shown that the undifferentiated state of stem cells decreased without losing viability of the cells. Also, glycolysis and mitochondria were not affected by the treatment. Thus, although it affected pluripotency, 3-bromopyruvate did not affect the metabolism of these cells at least in the parameters analysed. Importantly, many questions remain to be answered, so, additional experiments will be necessary to complement this work to better understand the global effect of 3-bromopyruvate in the metabolism and pluripotency of mouse embryonic stem cells.

Tese de doutoramento em Biologia, especialidade de Biologia Celular apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Universidade de Coimbra Non-alcoholic fatty liver diseases (NAFLD) are associated with obesity and type II diabetes, which are rapidly increasing worldwide due to a fat rich diet and lack of exercise. Fatty liver is characterized by the accumulation of fat in the cytoplasm of hepatocytes derived from adipocytes, intestinal absorption or hepatic lipogenesis. Clinical data has shown that fatty livers are more susceptible to ischemia/ reperfusion (I/R) injury, leading to diminished liver function. Different hypothesis, such as impaired ATP synthesis, microcirculation, Kupffer cell dysfunction and increased leukocytical adhesion have been proposed for the increased susceptibility of fatty organs to ischemic injury. Fatty degeneration, which induces a series of alterations in mitochondria, renders these organelles intrinsically more susceptible to I/R injury. Impairment of oxidative phosphorylation and induction of the mitochondrial permeability transition (MPT) are critical determinants for mitochondrial dysfunction induced by prolonged periods of ischemia followed by reperfusion. Regarding this, and taking into account the increased incidence of this pathology, we aimed to protect fatty livers from I/R damage. Ischemic preconditioning (IPC) is a phenomenon in which brief periods of ischemia make tissues resistant to injury resulting from prolonged ischemia and reperfusion. Thus, it became crucial to define the functioning mechanisms of preconditioning (PC) to allow drug targeting in a pharmacological treatment in fatty livers, as a strategy to reduce I/R injury observed in transplantation and hepatic resections. The first strategy presented demonstrates that selective blocking of A1Rs with DPCPX abolished the protection achieved by ischemic preconditioning, and A1R agonist CCPA reproduced the beneficial effects. This fact confirms the participation of this receptor in protection induced by IPC in lean livers. This involves preservation of OXPHOS efficiency and increase resistance to MPT onset. Induction of the MPT by I/R leads to cell death by uncoupling oxidative phosphorylation, inducing mitochondrial swelling and collapsing mitochondrial membrane potential, thus blocking cellular ATP formation. IPC induces the increase of HSP70 that may further protect mitochondria and prevent the MPT, thus maintaining the ability to generate ATP and recover from I/R insult. We demonstrate that modulation of the MPT is 8 0 achieved in preconditioning (ischemic and pharmacological) in a GSK- 3β-dependent manner, which is essential to achieve protection in I/R. GSK-3β inhibition prevents impairment of hepatic mitochondrial function and depletion of cellular ATP. Pharmacological preconditioning with indirubin-3’-oxime, an inhibitor of GSK-3β, in conditions of hepatic I/R, protects the liver by maintaining mitochondrial calcium homeostasis, thus preserving mitochondrial function and hepatic energetic balance. I/R induces translocation of GSK-3β from the cytosol to the mitochondria, increasing mitochondrial GSK-3β activity. Indirubin-3’-oxime preserves the level of inhibition of GSK-3β activity on mitochondria, by preserving the mitochondrial pool of phospho- Ser9-GSK-3β, that is decreased in I/R. Although fatty livers exhibit an underlying state of mitochondrial dysfunction that enhances damage after I/R, treatment with indirubin- 3’-oxime was also able to preserve the efficiency of mitochondrial function and prevent I/R damage in fatty livers. We demonstrated that active GSK-3β (in I/R situation) promotes an enhancement of CypD phosphorylation, resulting in increased binding of CypD to the ANT, sensitizing mitochondria to calcium-induced MPT. Therefore, indirubin- 3’-oxime has great therapeutic potential in the clinical setting of hepatic ischemia/reperfusion, acting as pharmacological preconditioning in lean and fatty livers. The last protective strategy highlights the importance of MPT modulation against I/R injury in fatty livers, involving the preventive axis SIRT3-CypD-MPT. Obesity decreases the cellular NAD+/NADH ratio, thereby contributing to a decrease in SIRT3 activity, thus increasing the acetylation of mitochondrial proteins and decreasing mitochondrial efficiency. We demonstrated that the increase in CypD acetylation in I/R animals was accompanied by an inhibition of SIRT3 activity. Conversely, adding NAD+ to fatty livers prior to I/R significantly increases SIRT3 activity and decreases CypD acetylation, activity and binding to ANT, increasing the threshold to MPT induction. NAD+ modulates mitochondrial function and preserves oxidative phosphorylation, being protective against injury in a model of hepatic warm I/R in fatty livers. As doenças do fígado gordo não-alcoólicas (NAFLD) estão associadas à obesidade diabetes tipo II, estão a aumentar rapidamente em todo o mundo devido a uma dieta rica em gorduras e falta de exercício. Um fígado gordo é caracterizado pela acumulação de gordura no citoplasma de hepatócitos, derivada de adipócitos, da absorção intestinal ou da lipogénese hepática. Os dados clínicos mostram que os fígados gordos são mais suscetíveis à lesão por isquemia/reperfusão (I/R), levando à diminuição da função hepática. Diferentes hipóteses, tais como síntese de ATP debilitada, microcirculação alterada, disfunção das células de Kupffer e aumento da adesão leucocitária têm sido propostas para o aumento da susceptibilidade de órgãos gordos à lesão isquémica. Este tipo de degeneração causada pela acumulação de gordura, induz uma série de alterações na mitocôndria, tornando estes organelos mais suscetíveis à lesão por I/R. Diminuição da eficiência fosforilativa e indução da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) são determinantes críticos para a disfunção mitocondrial induzida por períodos prolongados de isquémia seguidos de reperfusão. Tendo em conta o aumento da incidência desta patologia, o nosso objetivo é aumentar a resistência dos fígados gordos aos danos por I/R. Pré-condicionamento isquémico (IPC) é um fenómeno em que breves períodos de isquemia tornam os tecidos resistentes à lesão decorrente de isquemia e reperfusão prolongadas. Assim, tornou-se crucial definir os mecanismos subjacentes ao pré-condicionamento (PC) para permitir a identificação de alvos para drogas num tratamento farmacológico em fígados gordos como uma estratégia para reduzir a lesão por I/R observada no transplante e ressecções hepáticas. A primeira estratégia apresentada demonstra que o bloqueio seletivo de A1Rs com DPCPX aboliu a proteção obtida pelo précondicionamento isquémico, enquanto que um agonista de A1R, o CCPA, reproduziu os seus efeitos benéficos. Este fato confirma a participação deste receptor na proteção induzida pelo IPC em fígados magros. Isto envolve a preservação da eficiência fosforilativa e aumenta a resistência ao MPT. A indução da MPT por I/R leva a morte celular por desacoplamento da fosforilação oxidativa, induzindo entumescimento mitocondrial e o colapso do potencial de membrana mitocondrial, bloqueando assim a 10 0 formação de ATP. O IPC induz o aumento de HSP70 protegendo da indução do MPT, mantendo assim a capacidade para gerar ATP e recuperar do insulto por I/R. Demonstrámos que a modulação da MPT é alcançada em pré-condicionamento (isquémico e farmacológico) via modulação da GSK-3β. A inibição de GSK-3β previne a disfunção mitocondrial e depleção do ATP celular. Pré-condicionamento farmacológico com indirubina-3’- oxima, um inibidor de GSK-3β, em condições de I/R hepática, protege o fígado através da manutenção da homeostase do cálcio mitocondrial, preservando assim a função mitocondrial e o equilíbrio energético hepático. A I/R induz a translocação de GSK-3β do citosol para a mitocondria, aumentando a actividade da GSK-3β mitocondrial. A indirubina-3’-oxima preserva o nível de inibição da actividade da GSK-3β nas mitocondrias, preservando o “pool” mitocondrial de fosfo-Ser9-GSK-3β, que diminuí em I/R. Embora os fígados gordos exibam um estado subjacente de disfunção mitocondrial que aumenta os danos depois de I/R, o tratamento com indirubina-3’-oxima também foi capaz de preservar a eficiência da função mitocondrial e prevenir os danos da I/R em fígados gordos. Demonstrámos que a GSK-3β ativa (em situação de I/R) promove um aumento da fosforilação da CypD, resultando num aumento da ligação entre CypD e ANT, sensibilizando as mitocondrias à MPT induzida pelo cálcio. Portanto, a indirubina-3’-oxima tem um grande potencial terapêutico no estado clínico de isquemia/reperfusão hepática, atuando como précondicionamento farmacológico em fígados magros e gordos. A última estratégia de proteção destaca a importância da modulação da MPT contra a lesão da I/R em fígados gordos, envolvendo o eixo preventivo SIRT3-CypD-MPT. A obesidade diminui a o conteudo de NAD+ disponivel, contribuindo assim para uma diminuição na actividade da SIRT3,o que aumenta a acetilação de proteínas mitocondriais e diminui a eficiência mitocondrial. Demonstrámos que o aumento da acetilação da CypD em animais em situação de I/R foi acompanhada por uma inibição da actividade da SIRT3. Por outro lado, a adição de NAD+ a fígados gordos antes da I/R aumenta significativamente a actividade da SIRT3 e diminui a acetilação, actividade e ligação entre a ANT e CypD, aumentando a restência ao MPT. O NAD+ modula a função mitocondrial e preserva a fosforilação oxidativa, sendo protectivo contra danos num modelo de I/R hepática, em fígados gordos.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. A obesidade é considerada como uma doença de alto risco e crónica, tendo a sua incidência atingido níveis alarmantes tanto em pessoas adultas como em crianças em todo o Mundo. A obesidade aumenta a susceptibilidade para o desenvolvimento de outras patologias associadas a esta condição como o desenvolvimento de diabetes, hipertensão, doenças cardiovasculares, entre outras. Deste modo, existe uma necessidade constante pela descoberta de tratamentos eficazes de modo a evitar as consequências das doenças relativas a esta condição que preocupa toda a população em geral sendo já considerada como uma epidemia. Os tecidos que apresentam uma actividade metabólica elevada, como é o caso do músculo esquelético, várias doenças encontram-se associadas à disfunção mitocondrial. Assim, uma dieta rica em gordura origina um aumento do uptake de ácidos gordos contribuindo assim para a acumulação de lípidos, aumento do fluxo oxidativo mitocondrial, produção de espécies reactivas de oxigénio e por fim o desenvolvimento de resistência à insulina. Uma característica importante da obesidade é a resistência à insulina que consiste numa diminuição da resposta dos tecidos periféricos à insulina. O desenvolvimento desta condição envolve uma disfunção mitocondrial acrescida de uma diminuição do conteúdo de DNA mitocondrial, redução de coactivador 1α do receptor activado por proliferadores do peroxisoma gama (PGC-1α), deficiências na fosforilação oxidativa e diminuição da síntese de ATP. Consequentemente, a estimulação da biogénese mitocondrial pode diminuir ou até mesmo evitar o desenvolvimento de síndrome metabólico por aumento da actividade mitocondrial protegendo a célula contra o aumento de fluxo de substratos para a cadeia transportadora de electrões. Este trabalho teve por objectivo avaliar se o tratamento com Berberina modula a biogénese mitocondrial do músculo esquelético em modelos de obesidade induzida por dieta rica em gordura. A Berberina é um produto natural que apresenta propriedades antidiabéticas. Neste trabalho foi verificado que este composto diminui o peso corporal e recupera a disfunção mitocondrial no músculo esquelético, em animais alimentados durante 16 semanas com dieta rica em gordura. Adicionalmente, o tratamento com Berberina estimulou a actividade de proteína cinase activada por AMP (AMPK), o que originou um aumento da capacidade oxidativa mitocondrial, do conteúdo em proteínas envolvidas na biogénese e função mitocondriais. As mitocôndrias de músculo esquelético de animais Sprague-Dawley alimentados com dieta rica em gordura durante 16 semanas (animais HFD) apresentaram decréscimo significativo do potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ), desenvolvido após energização relativamente aos animais controlo (Capítulo III – 3.4.1). A despolarização foi também inferior em relação aos animais controlo, estando a repolarização também afectada. Nos animais Berberina, foi observado superior ΔΨ, despolarização e também derepolarização após o tratamento de 4 semanas com Berberina (Capítulo III – 3.4.1), comparativamente aos animais HFD, sendo muito semelhante ao valor obtido para os animais controlo. Os estados 3 e 4 respiratórios nas mitocôndrias de animais HFD foram estatisticamente inferiores relativamente aos animais controlo (Capítulo III – 3.4.2). Nos animais que receberam tratamento oral com Berberina (animais Berberina), estes parâmetros foram superiores em relação aos animais HFD, sendo semelhantes aos obtidos para os animais controlo (Capítulo III – 3.4.2). A respiração estimulada por FCCP nos animais HFD foi estatisticamente inferior relativamente aos animais controlo (Capítulo III – 3.4.2), sugerindo alterações ao nível da cadeia transportadora de electrões. Nos animais Berberina, este parâmetro foi superior em relação aos animais HFD. O índice de controlo respiratório (ICR) foi significativamente inferior nos animais HFD comparativamente aos animais controlo (Capítulo III – 3.4.2), enquanto que nos animais Berberina foi superior relativamente aos animais HFD. Paralelamente, a “lag phase” foi superior nas mitocôndrias de animais HFD em relação aos animais controlo e inferior nos animais Berberina comparativamente aos animais HFD, sendo semelhante à dos animais controlo (Capítulo III – 3.4.1). Estas observações sugerem que nos animais HFD ocorreu uma diminuição da eficiência do sistema fosforilativo relativamente aos animais controlo, enquanto que nos animais Berberina há uma recuperação da eficiência por parte do sistema fosforilativo. Os animais HFD apresentaram maior susceptibilidade à indução da permeabilidade transitória mitocondrial (PTM) (Capítulo III – 3.4.3) relativamente aos animais controlo e Berberina. Adicionalmente, os animais HFD apresentaram uma redução no conteúdo em proteína cinase activada por AMP (AMPK), p-AMPK, PGC-1α, citocromo c oxidase subunidade I (COX I), citocromo c oxidase subunidade IV (COX IV), factor de transcrição mitocondrial A (TFAM) e ATP sintetase (Capítulo III – 3.4.4) relativamente aos animais controlo enquanto que, nos animais Berberina, o conteúdo destas proteínas foi superior em relação aos animais HFD, sendo muito próximo do observado nos animais controlo. De acordo com estes resultados, os efeitos da Berberina parecem envolver um mecanismo que aumenta a função e número mitocondriais podendo, deste modo, atenuar a disfunção mitocondrial que se verifica nas condições de síndrome metabólico e diabetes mellitus tipo 2. Concluindo, este composto pode possibilitar o desenvolvimento de novas aplicações farmacológicas em pacientes obesos e diabéticos e também de estratégias que poderão modular a biogénese mitocondrial e assim melhorar o tratamento de doenças metabólicas. Obesity is considered a chronic high risk disease, having its prevalence reached alarming levels, both in adults as well as in children, all over the world. Obesity increases the susceptibility to the development of other pathologies such as diabetes, hypertension, and cardiovascular diseases, amongst others. As so, there is a constant necessity for the discovery of effective treatments as to avoid the consequences of the diseases associated with this condition. One of the main organs affected by this pathology is the skeletal muscle, since this organ presents a high metabolic activity, being on the main consumers of glucose. Due to this fact, mitochondrial activity is of vital importance to the skeletal muscle, so several pathologies that directly affect this organ are associated with mitochondrial dysfunction. As so, a fat rich diet causes an increase in the fatty acid uptake, leading to the accumulation of lipids, increased mitochondrial oxidative flow, reactive oxygen species production and finally the development of insulin resistance. An important characteristic of obesity, insulin resistance is the result of a decrease in the response of peripheral tissues to insulin. The onset of this condition involves mitochondrial dysfunction: decreased mitochondrial DNA and PGC-1α content, oxidative phosphorylation deficiencies and decreased ATP synthesis. As a result, the stimulation of the mitochondrial biogenesis can decrease or even avoid the development of the metabolic syndrome via an increase in mitochondrial activity, protecting the cell against the increase in the substrate flow through the electron transport chain. This work had the objective of evaluation if treatment with Berberine, a natural product that presents antidiabetic properties, modulates mitochondria biogenesis in the skeletal muscle of animals fed a high-fat diet. This work demonstrates that this compound decreases the overall body weight and recovers mitochondrial function in skeletal muscle of animals fed a high-fat diet for 16 weeks. Also, treatment with Berberine stimulated AMPK activity, which generated an increase in mitochondrial oxidative capacity and in proteins involved in mitochondrial biogenesis and function. Mitochondria isolated from skeletal muscle of Sprague-Dawley animals fed a high-fat diet for 16 weeks (HFD) exhibited statistically significant decrease in mitochondrial transmembrane potential (ΔΨ), induced by energization with succinate (Chapter III – 3.4.1). Mitochondrial depolarization and repolarization were also decreased in HFD animals, when compared to control animals. In the treated group, mitochondrial membrane potential, depolarization and repolarization were increased after 4 weeks of administration of Berberine (Chapter III- 3.4.1), comparatively to HFD mitochondria. No differences were observed between mitochondria isolated from Berberine and control animals. State 3 and 4 respiration were statistically decreased in mitochondria from HFD animals when compared to mitochondria from both groups HFD and Berberine (Chapter III- 3.4.2). FCCP-stimulated oxygen consumption was statistically decreased in mitochondria fromHFD animals comparatively to the control group (Chapter III- 3.4.2), suggesting alterations at the level of the electron transport chain. Berberine administration prevented this impairment. Respiratory control ratio and the lag phase were statistically decreased in mitochondria from both control and Berberine groups (Chapter III- 3.4.2 and 3.4.1). These observations suggest that in the HFD animals there was an impairment of the phosphorylative system, comparatively to control animals. On the other hand, in the animals treated with Berberine there was a recovery of the efficiency of the phosphorylative system. Mitochondria from HFD animals also exhibited increased susceptibility to the induction of the mitochondrial permeability transition (MPT), when compared to mitochondria from both control and Berberine groups. (Chapter III – 3.4.3). Additionally, in animals fed a high-fat diet for 16 weeks, comparatively to control animals, there was a decrease in the content of the following proteins: AMPK, p-AMPK, PGC-1α, cytochrome oxidase subunit I (COX I), cytochrome oxidase subunit IV, mitochondrial transcription factor A (TFAM) and ATPsynthase (Chapter III – 3.4.4). In animals treated with Berberine there was a recovery since the content in these proteins was similar to control animals and higher than HFD animals. Taking into account these results, it is suggested that Berberine action involves a mechanism of increased number and mitochondrial function. This will probably attenuate the mitochondrial dysfunction associated to metabolic syndrome and diabetes type 2. In conclusion, Berberine is a promising therapeutic agent to be used in the development of pharmacological strategies in obese and diabetic patients, with the goal of modulation of mitochondrial biogenesis and prevention of the damage involved in metabolic diseases.

Tese de doutoramento em Biociências, no ramo de especialização em Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra In the modern world, one of the main issues that mankind tries to control and improve, concerning its well-being, is health. In the last decades, several progresses have been achieved in order to improve health and also to increase overall lifespan. However, modern lifestyle also brought changes that continuously threaten health. In an “industrial” world, environmental pollution increased largely, and its effects are reflected deeply in disease development rates and incidence percentages. Human exposure to pollutants can occur via various pathways, including inhalation of contaminated air and dust, ingestion of contaminated water and food, dermal exposure to chemical or contaminated products, or fetal exposure during pregnancy. Dibenzofuran (DBF) is a “dioxin-like” chemical that is known to be toxic. This pollutant has been identified in tobacco smoke and listed as a pollutant of concern due to its persistence in the environment and potential for bioaccumulation; its exposure has been reported to cause reproductive injury, endocrine disruption and respiratory damage. Nevertheless and although the lung is a primary site of exposure for many inhaled chemical contaminants, studies about pollutants-induced toxic effects in lung function are scarce. In this work we tested the toxic effects of DBF in vitro in isolated mitochondria, organelles that play a central role in cell life and death. Mitochondria were isolated from lung, primary target organ of exposure to pollutants through inhalation, and from the liver, the main organ responsible for accumulating and metabolize xenobiotics. In the lung mitochondria, DBF caused a decrease in the mitochondrial phosphorylative efficiency and interfered with the mitochondria permeability transition (MPT) induction. Liver mitochondrial function was also impaired by DBF, which caused increased phosphorylative lag phase, reduced mitochondrial state 3 respiration, as well as disturbance of the calcium loading capacity and MPT. Moreover, we identified an interaction of DBF with the adenine nucleotide translocase (ANT), a mitochondrial component that is involved in both the phosphorylative system and in MPT induction. Exposure of lung epithelial cells A549 to the pollutant caused a reduction in cell proliferation, associated with a decreased mitochondrial activity (lower MTT reduction and reduced oxygen consumption rate) and impairment of ATP production. DBF exposure triggered autophagy in A549 cells probably as a cytoprotective mechanism. In summary, our results indicate that mitochondria are probably a target in DBF-induced toxicity. A decrease in the mitochondrial phosphorylative efficiency elicited by Dibenzofuran, with subsequent decrease in ATP content, are damaging results from exposure to Dibenzofuran; also inhibition of lung cell proliferation and mitochondrial activity, as well as autophagy triggering seem to be critical events in DBF-induced function impairment. Yet, further studies focused on understanding the upstream molecular mechanisms, by which metabolic pathways are deregulated, may ultimately help to develop therapeutic strategies and to prevent diseases related to pollutants exposure. No mundo moderno de hoje, um dos principais aspectos que o Homem tenta controlar e melhorar, no que respeita ao seu bem-estar, é a sua saúde. Nas últimas décadas, vários progressos foram feitos de forma a conseguir melhorar a saúde e também aumentar a esperança media de vida. No entanto, o estilo de vida moderno trouxe também algumas mudanças que constantemente ameaçam a saúde. Numa sociedade dita “industrial”, a poluição ambiental aumentou grandemente; em consequência disso os seus efeitos refletem-se largamente nas taxas de desenvolvimento de doenças e percentagens de incidência. A exposição humana a poluentes ambientais pode ocorrer por diversas vias, nomeadamente inalação de ar contaminado e de poeiras, ingestão de comida e água contaminadas, exposição por contacto dérmico com químicos ou produtos contaminados, ou ainda exposição fetal durante a gravidez. O Dibenzofurano (DBF) é um composto químico semelhante a dioxinas, conhecido por ser tóxico. Este poluente foi identificado no fumo de tabaco e listado como um poluente preocupante devido às suas características de persistência no ambiente e potencial para bioacumulação. Foi já reportado que a exposição a DBF prejudica a reprodução, causa disrupção endócrina e dano respiratório. Contudo, e apesar de o pulmão ser um órgão primário de exposição a vários contaminantes químicos inalados, são ainda escassos os estudos sobre os efeitos tóxicos induzidos por poluentes na função pulmonar. Neste trabalho foram testados os efeitos tóxicos do DBF in vitro, utilizando mitocôndrias isoladas, desempenhando estes organelos um papel central na vida e morte celular. As mitocôndrias foram isoladas a partir de pulmão, órgão alvo da exposição a poluentes por inalação, e a partir de fígado, o principal órgão responsável por acumular e metabolizar compostos xenobióticos. Nas mitocôndrias de pulmão, a exposição a DBF causou uma redução na eficiência da fosforilação mitocondrial e interferiu com a indução de permeabilidade transitória mitocondrial (MPT). A função mitocondrial no fígado também foi inibida pela exposição a DBF, que causou um aumento da lag phase fosforilativa, redução do estado 3 da respiração mitocondrial, bem como um distúrbio na capacidade de retenção de cálcio pelas mitocôndrias e na indução de MPT. Além destes efeitos, foi identificada uma interação do DBF com o translocator de nucleótidos de adenina (ANT), um componente mitocondrial que está envolvido tanto no sistema fosforilativo como na indução de MPT. A exposição de células epiteliais pulmonares (células A549) ao poluente causou uma redução da proliferação celular, associada a um decréscimo na atividade mitocondrial (diminuição na redução de MTT e na taxa de consumo de oxigénio) e a uma diminuição da produção de ATP. A exposição a DBF despoletou nas células A549 mecanismos de autofagia, provavelmente como um mecanismo de proteção celular em resposta ao dano causado. Em síntese, os resultados indicam que a mitocôndria é provavelmente um alvo envolvido na toxicidade causada pela exposição a DBF. Um decréscimo da eficiência fosforilativa mitocondrial causado pelo DBF, com consequente decréscimo na quantidade de ATP, são efeitos danosos da exposição a este poluente. Também a inibição da proliferação de células pulmonares e da atividade mitocondrial, assim como a indução de autofagia, parecem ser fenómenos causados pela exposição a DBF e consequente dano. Porém, estudos adicionais focados na compreensão dos mecanismos moleculares que levam à desregulação de vias metabólicas são necessários, podendo contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e para a prevenção de doenças relacionadas com a exposição a poluentes.