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Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária. No âmbito da presente dissertação iremos abordar 3 doenças representativas dos casos, em animais geriátricos, observados no período de estágio no Centro Veterinário de Santo Tirso. Disfunção Cognitiva canina, Hiperadrenocorticismo e Tumores Intracranianos. Por isso realizámos uma abordagem em capítulos distintos com a respectiva apresentação e discussão dos casos clínicos observados. In this thesis we will discuss three clinical entities, representative of the diseases that affected geriatric dogs during the period of internship at the Centro Veterinário de Santo Tirso. Canine Cognitive Dysfunction, Hyperadrenocorticism and Intracranial Tumors. Therefore we performed an approach in separate chapters with the respective presentation and discussion of the clinical cases observed.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Os tumores mamários caninos (TMC) constituem a lesão neoplásica mais comum na cadela. O estudo dos TMC e importante não só em medicina veterinária, mas também como modelo comparativo no estudo de cancro da mama na mulher. A angiogénese é um evento chave em oncologia, essencial para a progressão e mestastização das neoplasias. Presume-se que a aquisição, por parte do tumor, do fenótipo angiogénico seja o resultado do balanço entre factores pró e anti-angiogénicos presentes no micro ambiente tumoral. O factor de crescimento vascular do endotélio (VEGF) é considerado o factor angiogénico mais potente e ubiquitário, capaz de estimular a permeabilidade vascular, a densidade de microvascularização e por conseguinte a angiogénese tumoral. A ciclooxigenase 2 (COX-2) é uma enzima que pode ser induzida por vários estímulos, com um papel chave na síntese de prostaglandinas. Nos últimos anos, estudos realizados em medicina humana, têm-lhe atribuído potencial angiogénico. A angiogénese é classicamente quantificada através da contagem do número de neovasos (densidade de microvascularização - DMV). A imunomarcação de marcadores endoteliais, tais como a molécula CD31, tem sido utilizada para a determinação da DMV. O objectivo deste trabalho foi estudar o papel do VEGF e da COX-2 na angiogénese mamária canina, de forma a clarificar o seu potencial como alvos terapêuticos. Recorreu-se à imunohistoquímica para a análise da expressão de VEGF, COX-2 e CD31 em 70 nódulos mamários caninos (42 malignos e 28 benignos). Analisou-se a expressão de VEGF, COX-2 e CD31 nos TMC, avaliou-se a relação entre o VEGF, a COX-2 e a DMV e pesquisou-se a associação de cada um dos factores estudados com características clinico-patológicas (tipo histológico, tamanho do tumor, presença de crescimento infiltrativo, presença de necrose tumoral, índice mitótico e grau nuclear). A expressão de VEGF (p < 0,001) e COX-2 (p < 0,001) foi significativamente superior nos tumores malignos relativamente aos benignos, assim como a DMV (p < 0,001). Nos tumores malignos, observou-se uma associação estatisticamente significativa entre a expressão de VEGF e a DMV (p < 0,001), entre a expressão de COX-2 e a DMV (p = 0,026) e entre a expressão de COX-2 e do VEGF (p = 0,008). Verificou-se uma diferença significativa na DMV entre o grupo de tumores malignos VEGF-/COX-2- (grupo A) com o grupo VEGF+/COX-2+ (grupo C) (p = 0,001) e entre o grupo VEGF-/COX-2- (grupo A) com o grupo VEGF-/COX-2+ ou VRGF+/COX-2- (grupo B) (p = 0,014). Adicionalmente, a DMV associou-se com o tipo histológico (p = 0,019), o crescimento infiltrativo (p < 0,001), a necrose tumoral (p = 0,009), o índice mitótico (p = 0,026), e o grau nuclear (p < 0,001). A expressão de VEGF mostrou associação com o crescimento infiltrativo (p = 0,014), a necrose tumoral (p = 0,048) e o grau nuclear (p < 0,001) e a expressão de COX-2 com o crescimento infiltrativo (p = 0,026) e o índice mitótico (p = 0,028), nos TMC malignos. Os nossos resultados sugerem que o VEGF é um importante factor angiogénico em TMC. Segundo os nossos resultados, é sugerido pela primeira vez em canídeos, que a enzima COX-2 pode estar envolvida na regulação da angiogénese nos TMC, possivelmente através da indução do VEGF. A COX-2 e o VEGF poderão assim constituir um alvo terapêutico promissor na inibição da angiogénese mamária canina. Canine mammary tumors (TMC) are the most common neoplastic lesions in the female dog. The study of TMC is very important not only in veterinary medicine but also as a comparative model in the study of women´s breast cancer. Angiogenesis is a key event in oncology, it is essential for the progression and metastization of tumors. The acquisition of an angiogenic phenotype by the tumor is the result of the balance between pro and anti angiogenic factors present in the tumor microenvironment. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the most potent and ubiquitous angiogenic factor. It can stimulate vascular permeability, microvascular density and consequently tumor angiogenesis. Ciclooxygenase 2 (COX-2) is an enzyme that can be induced through several stimuli and has a key role in the synthesis of prostaglandins. In recent years, it has been recognized a potential angiogenic role of COX-2 in human medicine. Angiogenesis is classically quantified by the counting of new vessels (microvascularization density - DMV). Immunolabeling of endothelial marks, like CD31, has been used for DMV determination. The aim of this work focused on the study of the role of VEGF and COX-2 in mammary canine angiogenesis so as to clarify their potential as therapeutic targets. We used an immunohistochemistry method to analyzed the expression of VEGF, COX-2 and CD31 in 70 canine mammary nodes (42 malignant and 28 benign). We analyzed the expression of VEGF, COX-2 and CD31 in TMC, the relation between VEGF, COX-2 and CD31 and the association of each one of these factors with clinicopathological characteristics (histological type, tumor size, presence of infiltrative growth, presence of tumor necrosis, mitotic index and nuclear grade). VEGF (p < 0,001), COX-2 (p < 0,001) expression and DMV (p < 0,001) was significantly higher in malignant whit respect benign tumors. In malignant tumors, it was observed a statistically significant association between the expression of VEGF and DMV (p < 0,001), COX-2 and DMV (p = 0,026) and also between VEGF and COX-2 expression (p = 0,008). There was verified a significant difference in DMV between the group of VEGF-/COX-2- (group A) malignant tumors with VEGF+/COX-2+ group (group C) (p = 0,001) and between VEGF-/COX-2- group (group A) with VEGF-/COX-2+ or VRGF+/COX-2- group (group B) (p = 0,014). Additionally, in malignant tumours, DMV was associated with histological type (p = 0,019), infiltrative growth (p < 0,001), tumor necrosis (p = 0,009), mitotic index (p = 0,026), and nuclear grade (p < 0,001). VEGF expression tested positively for association with infiltrative growth (p = 0,014), tumor necrosis (p = 0,048) and nuclear grade (p < 0,001) and COX-2 expression with infiltrative growth (p = 0,026) and mitotic index (p = 0,028). Our results suggest that VEGF is an important angiogenic factor in TMC. According to our results, it is suggested for the first time in canines, a role of COX-2 enzyme in TMC angiogenesis regulation, possibly by the induction of VEGF. So, VEGF and COX-2 may constitute a promissory therapeutic target in canine mammary angiogenesis inhibition.

Dissertação de Mestrado em Ciências Veterinárias Os tumores mamários estão entre os neoplasmas mais comuns nas cadelas inteiras. Apesar da intensa investigação clínico-patológica, pouco se conhece acerca do prognóstico e da etiologia destes tumores. Deste modo, o objectivo do nosso estudo foi determinar o índice de proliferação (IP) e o infiltrado de linfócitos T, em 57 tumores mamários caninos (21 benignos e 36 malignos), pela detecção imunohistoquimica dos antigénios Ki-67 e CD3 respectivamente. Os nossos resultados revelaram uma associação estatística significativa do Ki-67 intratumoral com diversas variáveis clínico-patológicas que reflectem a agressividade do tumor e com a sobrevida total dos animais. Apesar dos linfócitos T CD3+ de todas as áreas de contagem se mostrarem associados a características de maior malignidade tumoral, apenas os linfócitos T CD3+ da glândula mamária não-tumoral anexa ao tumor revelaram associação estatística significativa com a sobrevida total. Assim, neste estudo, o Ki-67 do tumor e os linfócitos T CD3+ da mama anexa evidenciaram valor prognóstico. Mammary tumors are among the most common neoplasms in intact female dog. Despite of the intensive clinico-pathological investigation, very little is known about the prognosis and etiology of these tumors. This way, the objective of our study was to determine the proliferation index (PI) and the T-lymphocytes infiltrate, in 57 canine mammary tumors (21 benign and 36 malign), by immunohistochemical detection of Ki-67 and CD3 antigens respectively. Our results revealed a significant statistic association of the intratumoral Ki-67 with several clinico-pathologic characteristics that reflect the tumor aggressiveness and with overall survival of animals. In spite of CD3+ T-lymphocytes of all counting areas show an association with characteristics of high tumoral malignancy, just CD3+ T-lymphocytes in adnexal non-tumoral mammary gland revealed a significant statistic association with overall survival. So, in this study, the Ki-67 of the tumor and the CD3+ T-lymphocytes in adnexal nontumoral mammary gland evidenced prognostic value.

Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O objectivo do presente estudo foi investigar a expressão imunohistoquímica das ciclooxigenases 1 e 2 nas neoplasias melanocíticas dos canídeos. Assim, 40 tumores melanocíticos (29 cutâneos, 9 orais e 2 oculares), incluindo 9 benignos (melanocitomas) e 31 malignos (melanomas), foram analisados. A expressão da Cox-1 foi observada na quase totalidade dos casos, enquanto a expressão da Cox-2 esteve ausente nos tumores benignos. Nos tumores cutâneos, a expressão a Cox-2 foi significativamente mais elevada nas lesões malignas do que nas benignas (p=0,047). Nos melanomas oculares, a expressão desta proteína ocorreu em 50% dos casos. Nos melanomas orais, todos os casos apresentaram positividade para a Cox-2. Pudémos também observar que a expressão da Cox-1 e Cox-2 revelava uma associação estatisticamente significativa com algumas características clinicopatológicas, tais como, a raça, idade, tamanho, IM, tipo celular, necrose e pigmentação intratumorais. Os nossos resultados sugerem que a proteína Cox-2 poderá ser um importante marcador imunohistoquímico no diagnóstico dos tumores melanocíticos do cão, na distinção entre melanocitomas e melanomas cutâneos de baixa agressividade. A utilização de AINEs, especialmente contra a Cox-2, poderá revelar-se útil na terapia adjuvante do melanoma canino. The aim of this study was to investigate Cox-1 and Cox-2 immunohistochemical expression in canine melanocytic neoplasia. Therefore, 40 melanocytic tumors (29 cutaneous, 9 oral and 2 ocular), including 9 benign (melanocytoma) and 31 malignant (melanoma), were investigated. Cox-1 expression was observed in almost all cases, while Cox-2 expression was absent in the benign ones. In cutaneous tumors, the expression of Cox-2 was significantly higher in malignant than in benign lesions (p=0,047). In ocular melanoma, Cox-2 expression occurred in 50% of cases. In oral melanomas, all cases were positive for Cox-2 expression. We could also observe that Cox-1 and Cox-2 expression were significantly associated with some clinic-pathologic features, such as the breed, age, size, mitotic index, cellular type intratumoral necrosis and pigmentation. In conclusion, our results suggest that the Cox-2 protein might be an important immunohistochemical marker for distinguishing melanocytoma from low aggressive cutaneous melanoma. Besides, the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs, especially Cox-2 inhibitors, may have a useful role to play in the adjuvant therapy of canine melanoma.

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária O histiocitoma cutâneo canino é um tumor histiocítico benigno, com origem nas células de Langerhans. Geralmente, ocorre como uma lesão solitária, frequente em animais jovens, não metastiza e sofre, na grande maioria das vezes, regressão espontânea. Com o objectivo de contribuir para a compreensão do processo de regressão do histiocitoma, foram analisados 166 tumores classificados como histiocitoma cutâneo canino, recolhidos dos arquivos do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. De cada um deles, foram registados os dados referentes ao animal (idade, sexo e raça) e os dados referentes ao tumor (localização e tamanho) tendo sido feita, posteriormente, uma avaliação das lesões na coloração de rotina com hematoxilina-eosina, relativamente aos parâmetros histopatológicos definidos, nomeadamente padrão de crescimento, ulceração, infiltração inflamatória linfóide, grau de pleomorfismo nuclear, índice mitótico, estroma, necrose, células multinucleadas, foliculite/furunculose e vasculite. Baseado no grau de infiltração linfóide, foram classificados em 4 grupos tumorais, representando diferentes estádios da regressão tumoral. Para elucidar um pouco mais acerca dos mecanismos implicados na imunidade anti-tumoral, foram pesquisados, através da técnica de imunohistoquímica, linfócitos T e linfócitos B, usando, como marcadores, o CD3 e o CD79+, respectivamente. Na série de neoplasias estudada o histiocitoma cutâneo canino constituiu um tumor cutâneo solitário, encontrado com maior frequência em animais com menos de 2 anos de idade, de várias raças e cuja localização preferencial se situou ao nível da cabeça e extremidades distais dos membros. As características apresentadas revelaram que o HCC é um tumor benigno, que, apesar de ser bastante proliferativo, não apresenta um fenótipo invasor. A regressão nos histiocitomas esteve relacionada com a ulceração (p=0,023), o índice mitótico (p

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A Doença do Trato Urinário Inferior Felino (DTUIF) engloba um conjunto de doenças que afeta o trato urinário inferior dos gatos. Esta doença está associada a uma diversidade de entidades nosológicas, fatores de risco, sinais clínicos e tratamentos. Os objetivos desta dissertação visam compreender a influência de vários fatores no desencadear da doença, descrever o leque de sinais clínicos apresentados pelos animais e definir e acompanhar os meios de diagnóstico, os seus resultados e o tratamento e prevenção realizados durante o período de estágio. Durante o estágio foram acompanhados 31 animais com sinais de DTUIF que compareceram à consulta no Hospital Veterinário de Trás-os-Montes no período de 31 de agosto de 2015 a 24 de março de 2016. Destes, existe uma predominância de animais do sexo masculino, sem raça definida, sedentários, que habitam exclusivamente no interior e são alimentados com ração seca. A média de idades foi de 6,3 anos e a de peso de 4,3 kg. A maioria dos gatos convivia com outros animais e apenas interagia com os seus proprietários à noite ou fins de semana. É ainda de referir que alguns deles foram sujeitos a situações de stresse anteriores ao episódio de DTUIF. A hematúria, disúria e polaquiúria foram os sinais clínicos mais frequentes, assim como a periúria e o aumento do tempo de permanência na caixa de areia. Dos animais em estudo, 10 manifestavam recidivas e 12 apresentaram-se à consulta obstruídos e com sinais de obstrução como prostração, anorexia e vómitos. Na análise de urina, as alterações mais observadas foram a presença de proteinúria, hematúria e uma densidade urinária igual ou superior a 1050. No exame do sedimento urinário grande parte dos animais apresentou piúria, hematúria e cristalúria de estruvite. O diagnóstico definitivo não foi conseguido em 29% dos casos, sendo a cistite idiopática felina o diagnóstico mais comum (42%), seguida de urolitíase (19%), infeção do trato urinário (6%) e alterações comportamentais (3%). A maioria dos animais foi tratada com antibiótico e anti-inflamatório não esteroide e a todos foi aconselhado o tratamento dietético. O internamento foi necessário em 14 casos e, destes, 12 foram algaliados. O tratamento cirúrgico foi efetuado apenas uma vez. A doença evoluiu favoravelmente na maioria dos animais, porém, 23% apresentaram recidivas. Estes resultados estão de acordo com os diversos estudos publicados acerca da DTUIF e esta é um diagnóstico diferencial importante a ter em conta na presença dos sinais clínicos supracitados. The Feline Lower Urinary Tract Disease (FLUTD) covers a group of diseases which affect the feline lower urinary tract. This disease is associated to a diversity of nosological entities, risk factors, clinical signs and treatments. The purpose of this essay is to understand the influence of several factors in the appearing of the disease, describe the range of the clinical signs observed in the animals, and define as well as go along with the diagnosis methods, the results and the treatments and prevention carried out during the internship. This study concerns 31 animals that were observed with FLUTD signs during the consultations in the veterinary hospital “Hospital Veterinário de Trás-os-Montes” from August 31st 2015 to March 24th 2016. Among these animals, most were male with no defined breed, they were sedentary and living exclusively indoors, as well as fed with dry nutrition. Their average age was 6.3 years and their average weight was 4.3 kg. Most of the cats lived together with other animals and interacted with their owners only at night at the weekend. Besides, some had had situations of stress, prior to the FLUTD episode. The haematuria, dysuria and pollakiuria were the most frequent clinical signs, as well as the periruria and the increase in the time which was spent in the litter box. Among the animals in study, 10 were with recurrences, and 12 came to consultation obstructed and with obstruction signs such as prostration, anorexia and vomits. In the urine exam, the most frequent alterations observed were the presence of proteinuria, haematuria and a urine specific gravity equal or superior of 1050. In the sediment exam most of the animals have pyuria, haematuria and crystalluria of struvite. The complete diagnosis was not achieved in 29% of the cases, making the feline idiopathic cystitis the most frequently found (42%), followed by urolithiasis (19%), urinary tract infection (6%) and behavioral disorders (3%). Most of the animals were treated with antibiotic and nonsteroidal anti-inflammatory and a diet treatment was advised to all. Hospitalization was necessary in 14 cases, of which 12 had to use a urinary catheter. Surgery occurred only once. The disease evolved satisfactorily in most animals, nonetheless 23% with recurrences. These results conform to the several studies on FLUTD so far published, and this is a differential diagnosis that ought to be taken into consideration when the clinical signs previously mentioned are observed.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias A disciplina de oncologia veterinária tem assistido a enormes progressos nos últimos anos e a doença oncológica constitui hoje a principal causa de morte de animais de estimação seniores. Novos e sofisticados tratamentos estão hoje disponíveis no tratamento da doença oncológica fruto de avanços tecnológicos e da alteração de atitudes dos proprietários de animais domésticos que cada vez mais os encaram como membros da família exigindo assim o melhor tratamento disponível e com fortes preocupações relativas à qualidade de vida dos mesmos. O papel da enzima COX tem vindo a ser demonstrado de uma forma crescente na carcinogénese tanto em pessoas como em animais domésticos sendo um importante fator de prognóstico em vária neoplasias e potencialmente um alvo terapêutico. O objetivo deste estudo consistiu em analisar as expectativas de proprietários de animais de companhia com doença oncológica relativamente a serviços veterinários e avaliar se elas difeririam da população geral de donos de animais de companhia. Nesse sentido foi utilizada a metodologia SERVQUAL, um instrumento popularmente utilizado em marketing de serviços, para avaliar expectativas e perceções de consumidores e, assim, quantificar indiretamente a satisfação desses mesmos consumidores. De facto, esta metodologia é comumente utilizada em serviços de saúde quer como ferramenta de gestão, quer como ferramenta de investigação científica. Através da análise de inquéritos SERVQUAL distribuídos a proprietários de animais de companhia submetidos a tratamentos oncológicos e tratamentos não oncológicos concluiu-se que o primeiro grupo possuía expetativas específicas sobre o que constituiria um serviço veterinário ideal atribuindo maior importância a questões relacionadas com a ´segurança´ as quais não foram correspondidas pela equipa veterinária que por sua vez atribuíram maior importância a questões relacionadas com a tangibilidade dos serviços. Esta melhor compreensão das necessidades dos donos de animais com cancro permite melhor ajustar os serviços veterinários gerando maiores satisfações e melhores “compliances” e resultados dos tratamentos. A COX-2 é uma enzima diretamente implicada em diversas etapas da carcinogénese tais como a iniciação, a promoção, a invasão, a inibição da apoptose e a metastização. Os anti-inflamatórios com as suas propriedades de inibição da COX-2 são potencialmente candidatos óbvios a serem incluídos em terapêuticas de cancro providenciando analgesia e consequente melhoria da qualidade de vida (QoL) e, simultaneamente, atividade anticancerígena. Neste trabalho são revistas as ações da COX-2 nas diversas etapas chave da carcinogénese e é apresentada uma revisão sistemática sobre o valor prognóstico das COX em diversas neoplasias malignas do cão e do gato. Através da análise da literatura constatou-se que a expressão de COX-2 está associada a uma diminuição da sobrevida total no melanoma canino, no osteossarcoma canino e nos tumores mamários da cadela, mas não nos mastocitomas, carcinomas da próstata e carcinomas nasais. Esta revisão permitiu também constatar a escassez de estudos complementares para cada tipo de neoplasia e ausência de estudos para diversos grupos de neoplasias comuns, assim como identificar algumas falhas metodológicas em vários estudos potencialmente conduzindo a riscos de “bias”. De seguida investigámos os mecanismos de ação da COX-2 em 2 grupos de neoplasias importantes em cães: mastocitomas e melanomas- onde demonstrámos a associação da expressão da COX-2 com variáveis clinico-patológicas de agressividade elucidando o papel da COX-2 na carcinogénese destas 2 neoplasias apontando para a contribuição na angiogénese e alteração no microambiente inflamatório peri-tumoral no caso dos melanomas e proliferação e angiogénese nos mastocitomas. Embora a bibliografia publicada não tenha não tenha associado a COX-2 a um prognóstico negativo nos mastocitomas caninos, o nosso trabalho encontrou uma associação entre a intensidade da expressão de COX-2 e a menor sobrevida total em cães com mastocitomas. Finalmente descrevemos um estudo observacional onde a ação de um inibidor COX-2 específico- firocoxib- utilizado sozinho, ou combinado num esquema metronómico com clorambucil, foi avaliada num conjunto de 30 neoplasias em estádio avançado constatando-se atividade clínica com registo de 1 remissão completa e 2 remissões parciais, com um bom perfil de segurança e com melhorias significativas dos scores de QoL. Em conclusão, demonstrámos as especificidades das expectativas dos donos de animais de companhia e a importância dos clínicos se ajustarem às suas necessidades de forma a melhor garantir o cumprimento dos planos de tratamento. Identificámos a COX-2 como um importante fator de prognóstico em várias neoplasias malignas caninas e identificámos a utilidade potencial do uso de inibidores COX-2 no tratamento e melhoria da qualidade de vida de animais com neoplasias em estádio clínico avançado. A expressão de COX-2 poderá de futuro ser usada na clínica como marcador de previsão de agressividade em neoplasias de prognóstico incerto tais como mastocitomas de grau intermédio e o uso de inibidores COX-2 no tratamento de diversas neoplasias caninas deverá ser equacionado e avaliado em ensaios clínicos randomizados avaliando como resultados finais a resposta clínica ou a melhoria da qualidade de vida dos animais. Veterinary oncology field has experienced huge progresses in recent years and oncologic disease constitutes today the leading cause of death among senior pets. New and sophisticated therapies are readily available today for the treatment of oncologic disease resulting from technologic advances and from an attitude shift of pet owners that now regard them as members of the family and so demand the best medical care available and with special concern on Quality of Life issues. COX-2 enzyme role in carcinogenesis has been increasingly demonstrated both in people as well as in animals being an important prognostic factor in several neoplasia and potentially constituting a therapeutic target. The goal of this work consisted in analysing pet owner’s expectations towards veterinary services and evaluate if they differ from general pet owner population. For that we used the SERVQUAL methodology, a popular marketing instrument used to evaluate consumer’s expectations and perceptions allowing to indirectly estimate service satisfaction. In fact this methodology is already routinely used in health care either as a management or research tool. Through SERVQUAL questionnaires distributed to pet owners of animals with oncologic disease and non-oncologic disease we concluded that the former had different expectations regarding an optimum veterinary care service giving extra importance to items related with assurance which were not recognized by the veterinary staff who in turn gave higher importance to questions related to the tangible dimension. This better understanding of the needs of pet owners with cancer will allow for better adjustment of veterinary services offer making way to better client satisfaction, better treatment compliance rates and better outcomes of treatments. COX-2 is an enzyme directly implicated in several hallmarks of carcinogenesis such as initiation, promotion, invasion, apoptosis inhibition and metastization. NSAIDs with its COX-2 inhibitory properties are obvious potential candidates to be included in cancer therapy providing analgesia with consequent improve in QoL and at the same time having anti-cancer activity. In this work we reviewed COX-2 role in several key steps of carcinogenesis and we performed a systematic review on the prognostic value of COX in several malignant neoplasias in the dog and cat. Through review of the literature we observed that COX-2 is associated with an overall decrease in survival in canine melanoma, canine osteosarcoma and canine mammary tumours, but not in canine mast cell tumours, prostatic carcinoma and nasal carcinoma. This systematic review also allowed to highlight the scarcity of complementary prognostic studies for each type of neoplasia and the absence of any study in particular important groups of neoplasias and also permitted to identify methodologic limitations of published studies potentially leading to increased risk of bias. Next we investigated mechanisms of action of COX-2 in 2 important neoplasias in dogs: mast cell tumours and melanomas. Here we showed the association between COX-2 expression and several clinic-pathological variables of aggressiveness enlightening the role of COX-2 in these 2 cancers: acting on angiogenesis and peritumoural inflammatory microenvironment modification in melanomas and proliferation and angiogenesis in mast cell tumours. Although published literature hadn´t found association between COX-2 expression and diminished OS in canine mast cell tumours our work did find such association when taking in account COX-2 intensity of expression. Finally we described an observational study where the action of firocoxib (a COX-2 specific inhibitor) used alone or combined with chlorambucil in a metronomic regimen, was evaluated in 30 end stage various types of canine neoplasia. Clinical response was observed and we recorded 1 complete remission and 2 partial remissions with a good safety profile and with significant improvements in QoL scores of patients. In conclusion we demonstrated the specific needs and expectations of owners of pets with oncologic disease and the importance for the clinicians to make adjustments in order to meet those demands and achieve client satisfaction and compliance of treatment plans. We identified COX-2 as an important prognostic factor in several neoplasias and the potential role of COX-2 inhibitors in the treatment of these malignancies or as palliative care to improve QoL in end stage disease. COX-2 expression could in the future be used to help ascertain the clinical behaviour of neoplasias of uncertain prognostic such as intermediate grade mast cell tumours and the use of COX-2 inhibitors in the treatment of canine malignancies should be contemplated and evaluated throw randomized clinical trials considering as final results clinical activity or improvements in QoL.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias A inflamação faz parte dos principais “hallmarks” associados ao cancro e tem um papel relevante na carcinogénese mamária, relacionando-se com a agressividade tumoral e pior prognóstico. Nos tumores mamários dos canídeos (TMC) os estudos que se debruçam sobre o efeito das células imunitárias no prognóstico são escassos. Neste contexto, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de fomentar o conhecimento sobre o papel das vias de sinalização compartilhadas pelo infiltrado de linfócitos T/macrófagos e importantes biomarcadores tumorais na progressão, agressividade e prognóstico destes tumores. A imunossupressão associada ao infiltrado de linfócitos T no tumor tem sido explicada pela capacidade inibitória das células T reguladoras (Treg) que impedem as atividades citotóxicas anti-tumorais. Com base nestas evidências, caracterizámos por imunohistoquímica as células Treg intratumorais (FoxP3+), bem como algumas citoquinas relacionadas com elas: TGFβ e IL-35. Os nossos resultados demonstraram que a maior imunorreactividade para o FoxP3 está presente em tumores com fenótipos mais agressivos: elevado grau histológico de malignidade (GHM), presença de embolos intravasculares e metástases nos linfonodos. Adicionalmente, mostrámos que as células Treg FoxP3+ intratumorais estão associadas com uma menor sobrevida total (ST), por análise univariada e multivariada. As células Treg secretam citoquinas inibidoras (TGFβ e IL-35), induzindo a tolerância aos tumores. Os nossos resultados sugerem uma associação entre o TGFβ e parâmetros de agressividade tumoral, refletindo o seu envolvimento na transformação maligna. Demonstraram também uma correlação positiva entre o FoxP3 intratumoral, os níveis de TGFβ, VEGF e CD31. Além disso, tumores com abundante TGFβ e com elevada expressão simultânea de TGFβ/FoxP3, FoxP3/VEGF, TGFβ/VEGF foram associados ao menor tempo de ST e a classe de tumores TGFβ/FoxP3 elevados revelou-se como um fator independente de mau prognóstico na análise multivariada. A IL-35 é uma citoquina secretada pelas células Treg que inibe a proliferação e função das células T. Demonstrámos que a sobre-expressão da IL-35 está associada com o estádio clínico mais avançado e com um prognóstico desfavorável na análise univariada e multivariada. Foi possível constatar, pela 1ª vez nos TMC, o valor prognóstico independente das células FoxP3+ Treg e da classe de tumores TGFβ/FoxP3 elevados. A IL-35 evidenciou-se ainda como um novo biomarcador capaz de prever a evolução clínica dos TMC. No seguimento deste trabalho, realizámos um amplo estudo que incidiu sobre as vias de sinalização compartilhadas pelo infiltrado de linfócitos T/macrófagos e importantes biomarcadores tumorais no microambiente dos TMC. Com esse propósito estudámos biomarcadores celulares importantes na carcinogénese mamária (COX-2, EGFR e c-kit), que estão frequentemente sobre-expressos ou mutados nos TMC. Constatámos uma associação significativa da imunoexpressão elevada da COX-2 com os linfócitos T CD3+ e macrófagos MAC387. Tumores com elevada expressão de COX-2/CD3 e COX-2/MAC estão associados com variáveis de agressividade tumoral e menor ST. Demonstrámos ainda que a expressão simultânea de COX-2+/EGFR+ está associada com maior número de células T CD3+ intratumorais e foi observada uma associação significativa e uma correlação positiva entre os linfócitos T CD3+ e a expressão de c-kit. Tumores com alta expressão de c-kit apresentaram maior número de células T CD3+ estando associados a um GHM elevado, presença de êmbolos intravasculares, metástases nos linfonodos e menor ST. Os resultados demonstram que as vias de sinalização que envolvem a COX-2, o EGFR e o c-kit são importantes, não só para a remodelação do microambiente do tumor mamário, mas também como alvos para a terapia imunológica anti-tumoral. Para complementar o trabalho, foi realizada uma experiência de co-cultura in vitro onde se pretendia demonstrar a potencial participação bidirecional das células tumorais e células imunitárias na regulação da COX-2. Os resultados mostraram que a co-cultura entre a linha celular de carcinoma mamário de cão Sh1b e as células mononucleares de sangue periférico de cão (PBMCs) induziram uma tendência para a sobre-expressão de COX-2 nas células cancerígenas. Por sua vez, a expressão de COX-2 pelos PBMCs, entre eles predominantemente macrófagos CD68+, foi significativamente atenuada pela cocultura com Sh1b. Em conformidade, a co-cultura com CD68+ THP1 diferenciada (dTHP1) provocou um aumento da produção intracelular de COX-2 pelas células Sh1b. A expressão intracelular de COX-2 pela dTHP1 diminuiu quando estas células foram tratadas com meio condicionado das células Sh1b. Estes resultados representam um avanço significativo na compreensão do papel da COX-2 na remodelação do microambiente tumoral nos TMC, nomeadamente através da imunomodulação dos macrófagos associados ao tumor. Globalmente, o presente trabalho demonstrou que, à semelhança do cancro de mama da mulher, também nos TMC as células inflamatórias no microambiente do tumor são capazes de orquestrar programas facilitadores da progressão tumoral. Cancer related inflammation is part of the major cancer hallmarks and has an important role in mammary carcinogenesis being involved in tumor aggressiveness and poor clinical outcome. In dogs only few studies have yet concentrated on the influence of immune cells in clinical outcome of dog mammary tumor patients. In this context, the present work was conducted with the main aim of up-to-date knowledge about the roles of the intertwined signaling pathways shared by T-lymphocytic/macrophage infiltrates and important tissue biomarkers in canine mammary tumors (CMT) progression, aggression and prognosis. Immunosuppression associated with tumor infiltrating T-lymphocytes (TILs) has been explained by the compartment of regulatory T-cells (Treg) that inhibit anti-tumor cytotoxic activities. Based on these evidences, first, we assessed, by immunohistochemistry, the characterization of intratumoral Treg cells, as well as some cytokines related by them: TGFβ and IL-35. Our results demonstrated that FoxP3 was present in tumors with more aggressive phenotypes: high histological grade of malignancy (HGM), presence of neoplastic intravascular emboli and presence of lymph node metastasis. Additionally, also showed that intratumoral FoxP3+ Treg cells were associated with shorter overall survival (OS), both in univariate and multivariate analysis. Tregs can secrete inhibitory cytokines (TGFβ and IL-35), inducing tumors tolerance. Present work suggests a link between TGFβ and parameters of tumor aggressiveness, reflecting its involvement in CMT malignant transformation. Our data demonstrated also a positive correlation between intratumoral FoxP3, TGFβ levels, VEGF and CD31. Moreover tumors with abundant TGFβ and with concurrent high expression of TGFβ/FoxP3, FoxP3/VEGF, TGFβ/VEGF were associated with shorter OS time and the TGFβ/FoxP3 tumors class retained the association with worse survival in multivariate analysis, arising as an independent predictor of poor prognosis. IL-35 is a Treg cellsecreted cytokine that inhibits T-cells proliferation and function and to the best of our knowledge, this is the first study that investigates the role of IL-35 in CMT development and clinical outcome. Our results showed that IL-35 overexpression was significantly associated with advancement of tumor stage and unfavorable prognosis by univariate and multivariate survival analysis. Interestingly our findings indicate, for the first time in dog mammary tumors, the independent prognostic value of FoxP3+ Treg cells and TGFβ/FoxP3 tumors class. Additionally the IL-35 seems to be a new biomarker to predict the CMT clinical outcome. For a more comprehensive approach about the role of immune cells in dog mammary carcinogenesis, we perform a wide study focused on the intertwined signaling pathways shared by T-lymphocytic/macrophage infiltrates and important tissue biomarkers in mammary tumor microenvironment. We focused on relevant cell biomarkers in mammary carcinogenesis, the COX-2, EGFR and c-kit which are often overexpressed or mutated in this type of tumor. Present data demonstrated a significant association of high COX-2 immunoexpression with CD3+ T-lymphocytes and MAC387 macrophages. Tumors with concurrent high COX-2/CD3 and high COX-2/MAC expression were associated with variables of tumor aggressiveness and shorter OS. Current results also demonstrated that the concurrent COX-2+/EGFR+ expression was associated with higher numbers of intratumoral CD3+ T-cells. Furthermore a significant association and a positive correlation between CD3+ T-lymphocytes and c-kit expression were observed. Tumors with high c-kit expression showed higher counts of CD3+ T-cells and were associated with high HGM, presence of neoplastic intravascular emboli, presence of lymph node metastasis, angiogenesis and shorter OS. The findings indicate that COX-2, EGFR and c-kit pathways are important not only for the remodeling of mammary tumor microenvironment but also could be a very important targets for tumor immunological therapy. Finally, in an in vitro co-culturing experiment, was our aim to prove the potential bidirectional crosstalk between tumor cells and immune cells on COX-2 regulation. Our data showed that co-culturing of canine mammary carcinoma cell line Sh1b and canine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) induced a trend of COX-2 overexpression in mammary cancer cells. In turn, COX-2 expression by PBMCs, among them predominantly CD68+ macrophages, was significantly attenuated by co-culture with Sh1b. In accordance, co-culture with CD68+ differentiated THP1 (dTHP1) prompted an intracellular production of COX-2 in Sh1b cells. The intracellular COX-2 expression from dTHP1 decreased when they were treated with conditioned medium from cultured Sh1b cells. Present results represents a significant advance on understanding the possible role of COX-2 in inducing a cancer tolerogenic microenvironment in CMT namely through a cancer associated macrophages immunomodulation. Overall present work demonstrated that, similarly to human breast cancer, also in CMT the inflammatory responses in mammary cancer sites are able to orchestrate hallmark-facilitating programs in tumor microenvironment. FCT (“Fundação para a Ciência e a Tecnologia”) and POPH-QREN/FSE (“Programa Operacional Potencial Humano-Quadro de Referência Estratégico Nacional/Fundo Social Europeu”)

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O carcinoma de células escamosas (SCC) é um dos tumores malignos mais comuns da pele dos gatos. A incidência é maior em gatos com pêlo de cor clara, falta de pigmento e áreas de pêlo escasso ou sem pêlo, e as orelhas, pálpebras, plano nasal e têmporas são as áreas mais afetadas, sendo mais comum nos gatos mais velhos. A exposição solar crónica é considerada o fator indutor da carcinogénese: induz alterações actínicas na pele que evoluem para lesões pré-neoplásicas, carcinoma in situ e SCC invasivo. O diagnóstico definitivo é feito por biópsia. Como a taxa de metastização do SCC do plano nasal é muito baixa, e dado o seu caráter localmente invasivo, o principal objetivo do tratamento é o controlo local do tumor. Várias modalidades de tratamento são utilizadas no maneio deste tumor, mas com resultados pouco satisfatórios. A radioterapia externa tem sido usada nos últimos anos com melhores resultados nos tempos de recidiva e sobrevida global. A braquiterapia de alta dosagem (HDR) é um tratamento de radioterapia de contacto, com um curto período de tratamento global e um efeito poupador dos tecidos não neoplásicos. Devido à falta de literatura sobre braquiterapia HDR no tratamento deste tumor, este estudo retrospetivo foi realizado para descobrir se existiam variáveis individuais e do tumor que pudessem ser fatores de prognóstico para a sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global (OS). Os dados recolhidos são referentes a 58 gatos com SCC do plano nasal tratados com braquiterapia HDR, e incluem: género, estado reprodutivo, raça, idade, número de lesões, localização e tamanho do tumor, extensão do tumor para além do plano nasal, ulceração, metástases ganglionares e pulmonares, qualquer tratamento prévio, resposta à braquiterapia HDR, recidiva e sobrevida global. A dose total de radiação foi 30 Gy, administrada em cinco frações de 6 Gy, durante 3 a 4 dias. Resposta completa foi alcançada em 72% (n=36) dos gatos, resposta parcial em 26% (n=13) e 2% (n=1) não responderam. A média dos tempos de PFS e OS foram 316 e 835 dias, respetivamente. O sexo dos gatos tratados com braquiterapia HDR afetou o tempo de OS (p=0,045): os machos viveram menos tempo. O tamanho do tumor mostrou um efeito significativo na resposta ao tratamento (p=0,015) e na OS (p=0,001): gatos com tumores iguais ou menores que 2 cm responderam melhor ao tratamento e viveram mais tempo. Os gatos sem progressão tumoral para o lábio superior viveram mais tempo (p=0,015). Os gatos que receberam outro tratamento antes da braquiterapia HDR apresentaram tempos de PFS menores. Finalmente, a resposta do tumor à braquiterapia HDR estava estatisticamente associada à PFS (p=0,038) e OS (p