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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evolution der plastidären RNA-Edierung und dem evolutionären Hintergrund der komplexen Plastide in Peridinin-haltigen Dinoflagellaten. Das Plastidengenom des Lebermooses P. endiviifolia wurde vollständig sequenziert (120554 bp) und C zu U Edierung konnte an 54 Stellen nachgewiesen werden. Aufgrund der relativ geringen Anzahl an Edierungen stützt dies einen sekundären Verlust der RNA-Edierung in dem Lebermoos M. polymorpha. Weiterhin sind die Edierungsstellen in P. endiviifolia auf einen Sequenzkontext mit geringerer Mutationsrate konzentriert. Dadurch erfüllen sie die Kriterien für das Modell der Entstehung der RNA-Edierung nach Tillich (Tillich et al., 2006). Ein RNA-Edierungssystem entwickelte sich um Mutationen der DNA auf RNA Ebene zu kurieren. Rückmutationen, teilweise begünstigt durch Zeiten dynamischer Sequenzevolution, führten zu den heute beobachtbaren Editotypen bzw. zum Verlust der Edierung in M. polymorpha. Außerdem wurde die plastidäre Genomreduktion der Peridinin-haltigen Dinoflagellaten untersucht. Mittels Transposonmutagenese konnten minicircles aus A. carterae isoliert werden, die unter anderem eine Stammspezifität der core-Region verdeutlichen. Die minicircles zeigen eine ausgesprochene Varianz und ihre möglichen Funktionen, unter anderem als mögliches Gen-shuttle, werden diskutiert. Im Zuge der Betrachtung des plastidären Proteinimports zeigte sich, dass die Transitpeptide Nukleus-codierter Plastidenproteine der Peridinin-haltigen Dinoflagellaten und Chromisten, entgegen bisherigen in vitro Daten, keinen Import in die primäre Plastide von Landpflanzen vermitteln können und die sogenannten Klasse I Transitpeptide weitere potentielle Zielsteuerungsinformationen enthalten (TPL2), welche die nötigen Informationen für eine Assoziation mit einer primären Plastide tragen. Proteine dieser Klasse weisen häufig eine größere Homologie zu ‚grünen Genen‘ auf, was auf einen Ursprung aus einem potentiellen horizontalen Gentransfer schließen lässt. Zusätzlich konnte durch elektronenmikroskopische Studien bestätigt werden, dass Proteine mit Klasse I Transitpeptid nicht sensitiv für eine Inhibition mit Brefeldin A sind und somit einen vom Golgi-Apparat unabhängigen Transportweg in die komplexe Plastide zu nutzen scheinen. Diese Klasse zeigt also Besonderheiten im plastidären Proteinimport, womöglich resultierend aus einem abweichenden evolutionären Ursprung., Topics of this thesis are the evolution of RNA-editing in plastids of land plants and the evolutionary background of the complex plastid in peridinin-containing dinoflagellates. The plastid genome of P. endiviifolia was completely sequenced (120554 bp) and transcripts of protein-coding genes showed only C to U RNA-editing at 54 sites. The relatively low number of editing sites supports the secondary loss of RNA-editing in M. polymorpha and, furthermore, editing sites are predominantly found in a sequence context known for low re-mutation rates. For this reason RNA-editing in P. endiviifolia meets the criteria for the evolution of chloroplast RNA-editing in land plants stated by Tillich (Tillich et al., 2006). RNA-editing was established to cure DNA mutations, which occurred in the plastid genomes of the first land plants, on the level of RNA. Re-mutations, eventually fostered by times of accelerated evolution rates, can cure these mutations on DNA level and thereby lead to the editotypes we observe today or even to a complete loss of RNA-editing as in M. polymorpha. Another topic was the plastidial genome reduction and the protein import in the complex plastid of peridinin-containing dinoflagellates. The method of transposon mutagenesis was used to isolate minicircles of A. carterae, which revealed that the core region of minicircles is at least subspecies-specific. Minicircles are extraordinary variant and their possible roles, as for example gene-shuttle, are discussed. Studies of protein import showed, that, in contrast to previous in vitro data, transit peptides of nucleus-encoded plastid proteins of peridinin-containing dinoflagellates and cromists were not able to mediate import into the primary plastid of land plants in vivo. For so called class I transit peptides potential additional targeting sequences were identified, named TPL2, which contained the necessary targeting information for directing proteins towards the primary plastid of land plants as it is known from proteins of the outer envelope membrane. Furthermore, class I proteins seem to have a phylogenetic bias towards the ‘green line’ of plastids indicating a possible origin via horizontal gene transfer. Finally, electron microscopy showed the insensitivity of class I protein transport to inhibition with Brefeldin A suggesting an alternative transport route for this class of transit peptides, most probably directly from the ER to the complex plastid. Therefore, proteins with class I transit peptide show specific transport mechanism for protein import into the plastid, potentially as a result of particular evolutionary origin.

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) ist der Erreger der bakteriellen Fleckenkrankheit in Tomaten (Solanum lycopersicum) und Paprika (Capsicum annuum). Bei Xanthomonas handelt es sich um ein biotrophes Pathogen, das auf lebende Wirtszellen angewiesen ist. Die Krankheit äußert sich in Blättern durch wassergefüllte Läsionen und Hypertrophie der Mesophyllzellen. Während der Besiedlung einer Pflanze injiziert Xanthomonas campestris pv. vesicatoria mehr als 30 Effektorproteine über das Typ III-Sekretionssystem in das Zytosol der Pflanzenzelle. Dort können Effektoren die Krankheit fördern, indem sie einerseits den Stoffwechsel des Wirtes zu ihren Gunsten umlenken und andererseits indem sie die Abwehrantworten des Wirtes inhibieren. Hierbei spricht man von einer kompatiblen Interaktion. Allerdings können Pflanzen auch einige Effektoren durch spezialisierte Resistenzproteine erkennen und zur Eindämmung des Bakterien- wachstums eine hypersensitive Reaktion (HR), gefolgt von lokalem Zelltod, induzieren. Hierbei handelt es sich um die Effektor-vermittelte Immunität (ETI: effector triggered immunity) und eine inkompatible Interaktion. Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Effektorprotein XopJ aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria funktionell weiter charakterisiert werden. Bei XopJ handelt es sich um einen Typ III-Effektor der YopJ-Familie, die sowohl in tier- als auch in pflanzenpathogenen Bakterien verbreitet ist. Transiente Expression eines XopJ-GFP-Fusionsproteins zeigte eine Lokalisierung des Effektors an der Plasmamembran der Pflanzenzelle. Mutationsanalysen legten weiterhin nahe, dass diese Lokalisierung durch eine Myristoylierung und wahrscheinlich auch durch eine Palmitoylierung am N-Terminus des Proteins vermittelt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass XopJ die Sekretion eines GFP-Reporterproteins (secGFP) in den Apoplasten hemmt und darüber hinaus die durch PAMPs (pathogen-associated molecular pattern) ausgelöste Ablagerung von Kallose an der Zellwand unterdrückt. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass XopJ Teile der Zellwand-assoziierten basalen Abwehr in Pflanzen unterdrücken kann. Diese Virulenzfunktionen waren sowohl von einer intakten katalytischen Triade des Effektors, als auch von einem funktionalen Myristoylierungssignal abhängig. Unter Einsatz des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems wurde RPT6 als ein möglicher Interaktionspartner von XopJ in Pflanzen identifiziert. Die Interaktion zwischen XopJ und RPT6 konnte auch in planta sowohl durch Koimmunpräzipitations- als auch durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementationsexperimente bestätigt werden. RPT6 ist Bestandteil der regulatorischen 19 S-Untereinheit des 26 S-Proteasoms in Eukaryoten. Die Messung der Proteasomaktivität in transient XopJ-exprimierenden Blättern zeigte, dass die Interaktion des Effektors mit RPT6 zu einer Hemmung der Proteasomaktivität und zur Akkumulation ubiquitinierter Proteine in der Pflanzenzelle führt. Dieser Effekt war wiederum abhängig von einer intakten katalytischen Triade und der Myristoylierung des Effektors. Durch Verwendung einer Xcv xopJ-Verlustmutante konnte gezeigt werden, dass XopJ wahrscheinlich für die Reduzierung der Proteasomaktivität während einer kompatiblen Interaktion mit Paprika verantwortlich ist. Diese Daten deuteten darauf hin, dass XopJ möglicherweise durch Verminderung der Proteasomaktivität Abwehrreaktionen der Pflanze unterdrückt und impliziert eine Rolle des Proteasoms in der basalen Abwehr von Pflanzen. Um die Wirkungsweise von XopJ biochemisch zu untersuchen, wurde in E. coli exprimiertes XopJ auf eine mögliche Acetyltransferaseaktivität hin getestet. Allerdings konnten diese Experimente eine enzymatische Aktivität von XopJ bisher nicht belegen, obwohl die Mutation eines in den möglichen katalytischen Mechanismus involvierten Lysinrestes im XopJ-Polypeptid die Interaktion mit RPT6 und auch den Hemmeffekt auf das Proteasom unterbindet. Insofern bleibt die biochemische Funktion von XopJ im Moment noch unklar. Die Behandlung von XopJ-exprimierenden Blättern von Nicotiana benthamiana mit Salicylsäure (SA) führte zur Auslösung einer HR. Herunterregulierung von Komponenten der R-Protein-vermittelten Reaktion mittels Virus-induzierter Gen-Stilllegung (VIGS) legen die Beteiligung eines R-Proteins an der Auslösung der HR nahe. Außerdem wurde die Rolle einiger Komponenten des SA-Signaltransduktionsweges bei der Auslösung der HR nach XopJ-Expression untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die HR unabhängig von NPR1, RAR1 und EDS1 war. In EDS1-herunterregulierten Pflanzen wurde eine HR auch in Abwesenheit von SA ausgelöst. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) is the causative agent of bacterial spot disease in tomato (Lycopersicum esculentum) and pepper (Capsicum annuum). Xanthomonas is a biotrophic pathogen and therefore it depends on living host cells. Water-soaked lesions and hypertrophy of mesophyll cells are the characteristics of this disease. During infection Xcv injects, via its type III secretion system, more than 30 effector proteins into the cytosol of plant cells. Once inside the cell, effectors can promote infection by redirecting the host’s metabolism to their own favour and by inhibiting the immune responses. This is called a compatible interaction. However, plants are able to recognize some effectors via specialised resistance proteins that leads to hypersensitive response (HR) and thus to the induction of a local cell death – consequently restricting bacterial growth. This effector-triggered immunity (ETI) is called an incompatible interaction. In this work, the effector protein XopJ from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria could be further functionally characterised. XopJ is a type III effector of the YopJ family. This family is prevalent in animal as well as in plant pathogenic bacteria. Transient expression of XopJ-GFP fusions showed a localisation of the effector at the plasma membrane of plant cells. Mutational analyses indicated that the localisation is mediated by myristoylation and, most likely, by palmitoylation at the N terminus of the protein. Furthermore, it could be shown that XopJ inhibits the secretion of a GFP reporter protein (secGFP) to the apoplast. In addition to that, the XopJ effector also suppressed PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced deposition of callose at the cell wall. These results suggested that XopJ can prevent cell wall-associated basal defence in plants. These virulence functions were dependent on an intact catalytic triad and on a functional myristoylation motif. Using the yeast-two hybrid system, RPT6 was identified as a putative interaction partner of XopJ in plants. This interaction could also be confirmed in planta by co-immunoprecipitations and bimolecular fluorescence complementation experiments. RPT6 is a component of the 19 S subunit of the 26 S proteasome in eukaryotes. Measurement of the proteasome activity in leaves that transiently expressed XopJ showed that the interaction between effector and RPT6 leads to an inhibition of the proteasome activity and accumulation of ubiquitinated proteins in plant cells. Again, this effect was dependent on the intact catalytic triad and the myristoylation of the effector. By using a Xcv xopJ deletion mutant, it was shown that XopJ is probably responsible for the attenuation of proteasome activity during compatible interaction with pepper. These data indicate that XopJ possibly suppresses the plant’s defence reactions by reduction of the proteasomal activity, implicating that the proteasome becomes important during basal defence of plants. In order to biochemically investigate the mode of action of XopJ, the effector was expressed in E. coli and tested for possible acetyltransferase activity. Although the mutation of a lysine residue, located in the XopJ polypeptide and possibly involved in a catalytic mechanism, eliminates the interaction of the effector with RPT6 and suppresses the inhibition of the proteasome activity, these experiments could not substantiate an enzymatic activity of XopJ. Thus, the biochemical activity still remains obscure. The treatment of XopJ-expressing Nicotiana benthamiana leaves with salicylic acid (SA) triggered a HR. Silencing components of the R protein-mediated reaction via virus induced gene silencing (VIGS) suggested that a R protein is involved in the HR activation. In addition, the role of some components of SA signalling were analysed in the activation of the HR subsequent to XopJ expression thereby showing the independence between HR and NPR1, RAR1, and EDS1. Even in the absence of SA, the HR was triggered in EDS1-silenced plants.

Ausgehend von einer Studie zur phylogenetischen Verteilung der SRP-RNA in Plastiden von Niederen und Höheren pflanzlichen Organismen wurde in dieser Arbeit das Signalerkennungspartikel (SRP) des Mooses \(\textit {Physcomitrella patens}\) näher charakterisiert. Das SRP von \(\textit {P. patens}\) stellt evolutionär gesehen eine Übergangsform dar; sowohl die für Höhere Pflanzen spezifischen Proteinkomponenten (cpSRP54, cpSRP43) als auch die für das cytosolische Partikel hoch konservierte SRP-RNA Komponente sind in den Chloroplasten von \(\textit {P. patens}\) vorhanden und konnten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Die präsentierten Daten zeigen neben Protein-Protein und Protein-RNA Interaktionen der beteiligten Komponenten auch eine Analyse zur Struktur und katalytischen Funktion der \(\it Pp\)-cpSRP-RNA. Des Weiteren wurde durch Röntgenstrukturanalyse die Konformation des SRP-Rezeptors \(\it Pp\)-cpFtsY bestimmt, welcher eine - für Höhere Pflanzen typische - "geschlossene" Konformation aufweist.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die NiV-Infektion von polarisierten Epithelzellen zur Ausbildung von Synzytien führt. Diese Fusion benachbarter Zellen wird durch die basolaterale Verteilung der fusogenen NiV-Glykoproteinkomplexe hervorgerufen. Die basolaterale Lokalisation der Glykoproteine wird über Tyrosin-motive in den zytoplasmatischen Domänen des F- und G-Proteins vermittelt. Werden diese Tyrosine mutiert, werden beide Glykoproteine apikal transportiert und vermitteln keine Zell-Zell-Fusion mehr. Obwohl diese Untersuchungen in MDCK-Zellen, einer immortalisierten Nierenepithelzelllinie, durchgeführt wurden, kann man ver-muten, dass auch in den polarisierten Epithelzellen des Respirationstraktes die basolaterale Verteilung des F- und G-Proteins die Zell-Zell-Fusion vermittelt. Dadurch wird die Barriere früh in der Infektion zerstört und ein Ausbreiten der Infektion in das subepitheliale Gewebe kann stattfinden.

Epitheliale Zellen sind charakterisiert durch eine morphologische und funktionelle Unterteilung ihrer Membran in eine apikale und eine basolaterale Domäne, welche durch einen hoch-spezifischen, polarisierten Sortiervorgang von Lipiden und Proteinen aufrechterhalten wird. Im apikalen Transport kann die Vielzahl verschiedener Transportwege aufgrund der Affinität der darin transportierten Proteine zu lipid rafts in einen raft abhängigen und einen raft-unabhängigen Transport untergliedert werden. Die Trennung der beiden Transportwege in einem Post-Golgi-Kompartiment beruht auf der Ausbildung hochmolekularer Cluster, vermittelt durch das galactosebindende Lectin Galectin 3. Die Bedeutung von Galectin-3 in der apikalen Sortierung von Nicht-raft-Glykoproteinen ist eine anerkannte Tatsache und auch die molekularen Mechanismen, die zu diesem Prozess führen, werden zunehmend enträtselt. Die Identität des Sortierkompartiments jedoch ist weiterhin schleierhaft. Basierend auf der Hypothese, dass endozytiertes Galectin-3 zur Plasmamembran zurücktransportiert wird und während dieses Prozesses höchstwahrscheinlich auch das Sortierkompartiment durchquert, wurde die Aufnahme von Galectin 3 in MDCK II-Zellen studiert. Hierbei handelt es sich um einen glykanabhängigen Prozess, der zur Anreicherung dieses Lectins in angesäuerten Kompartimenten führt. Durch Kolokalisationsstudien mit fluoreszenzmarkiertem Dextran und Rab11, einem Marker für das apikale Recyclingendosom wurde nachgewiesen, dass Galectin-3 höchstwahrscheinlich in einen Recyclingweg und nicht in einen degradativen Weg einsortiert wird. Die Ergebnisse der Analyse der Endozytose von Galectin-3 stimmen zudem mit Beobachtungen überein, dass dieses Lectin in COS-Zellen in angesäuerten, Rab4-CFP-positiven Strukturen zu finden ist, sowie in MDCK-Zellen mit verschiedenen endosomalen Markerproteinen kolokalisiert. Neben dem intrazellulären Transport von Galectin-3 ist auch dessen unkonventionelle Sekretion Thema ausführlicher Diskussionen. In der hier vorgestellten Dissertation konnte gezeigt werden, dass Galectin-3 zwar in der exosomalen, nicht aber in der mikrovesikulären Fraktion des Zellkulturüberstandes von MDCK-Zellen zu finden ist. In dieser Fraktion ist Galectin-3 mit Strukturen assoziiert, deren Morphologie und Dichte sowie die Anreicherung von Markerproteinen für ihre Identität als Exosomen sprechen. Mit Hilfe von Proteinase K-Protektionsversuchen konnte zudem eine Lokalisation von Galectin-3 im Lumen der Exosomen gezeigt werden und weiterhin, dass das Auseinanderbrechen und die anschließende Frei-setzung des Inhalts dieser Strukturen nicht auf eine instabile Natur der Vesikel per se zurückzuführen ist, sondern vielmehr zelluläre Faktoren vorauszusetzen scheint. Obwohl Galectin-3 mit verschiedenen Komponenten der ESCRTs (endosomal sorting complex required for transport) in COS 7-Zellen kolokalisiert, scheint die exosomale Freisetzung von Galectin-3 in MDCK II-Zellen ein ESCRT-unabhängiger Prozess zu sein. Hinweise hierfür fanden sich in Studien mit der dominant-negativen Mutante des ESCRT-Dissassemblierungsfaktors Vps4a und RNAi-Experimenten zum knock down der ESCRT-I-Komponente Tsg101. Zusätzlich konnten Einflüsse der Mikrovesikelbildung und der Autophagie auf die exosomale Sekretion von Galectin-3 ausgeschlossen werden. Als mögliches Signal zur Sortierung in diesen unkonventionellen Sekretionsweg konnte in silico eine mutmaßliche late domain zur Interaktion mit der ESCRT-I-Komponente Tsg101 in der Aminosäuresequenz identifiziert werden, die eine essentielle Rolle in der Sekretion einer acylierten Form von Galectin-3 aus COS-Zellen spielt. Die Bedeutung dieser Domäne für die exosomale Lokalisation von Galectin-3 wurde getestet, die entsprechenden Experimente führten jedoch zu keinem eindeutigen Ergebnis. Eine Beteiligung der late domain in der Sekretion von Galectin-3 kann allerdings auch nicht ausgeschlossen werden. Schlussendlich konnte auch die molekulare Identität des in MDCK-Zellen endogen exprimierten Sialoglykoproteins gp114 als canines Homolog von CEACAM1 bestätigt werden, da beide Proteine in Bezug auf Antikörperdetektion, apikale Lokalisierung und Glykosylierung identische Charakteristika aufweisen.

Mit Hilfe von Membranproteinkomplexen werden Proteine/Peptide durch Membranen transportiert. Darunter nimmt der Tat-abhängige Weg (Twin Arginine Translocation Pathway) eine Sonderstellung ein, da er gefaltete und Co-Faktor-tragende Proteine transportiert. Er kommt sowohl in der Thylakoidmembran pflanzlicher Chloroplasten, als auch in der Cytoplasmamembran von Bakterien vor. Ziel der Arbeit war es Wechselwirkungen von Modellsubstraten für den Tat-abhängigen Transport mit Membranlipiden zu untersuchen. Adsorptionsstudien zwischen den Proteinen und Lipidmonoschichten an der Luft/Wasser-Grenzfläche mittels Filmwaagetechnik und Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS) ergaben, dass die Interaktion der Proteine mit der Monoschicht durch die Kopplung an ein spezifisches Tat-abhängiges Signalpeptid erheblich gesteigert wird. Im Gegensatz zum pflanzlichen System, in dem hauptsächlich hydrophobe Kräfte für die Interaktion verantwortlich sind, spielen im bakteriellen System auch elektrostatische Kräfte eine wesentliche Rolle.

Das chloroplastidäre SRP54 ist trotz hoher Homologie zum cytosolischen SRP54 nicht in der Lage, an die in allen cytosolischen SRPs konservierte SRP-RNA zu binden. Der Verlust der Fähigkeit des cpSRP54 aus \(\textit {Arabidopsis thaliana}\), an SRP-RNA zu binden, ist auf den Austausch von lediglich zwei Aminosäuren in der in cytosolischen SRP54-Proteinen konservierten RNA-Bindedomäne zurückzuführen. Phylogenetische Analysen zeigten, dass das mutierte SRP-RNA-Bindemotiv nicht in allen Vertretern der Grünen Linie zu finden ist. So konnte auf dem Plastom von \(\textit {Ostreococcus tauri}\) eine cpSRP-RNA identifiziert und deren Funktionalität bestätigt werden. Im Unterschied dazu konnte in \(\textit {Chlamydomonas reinhardtii}\) keine cpSRP-RNA, stattdessen aber weitere Homologe der am cpSRP-Weg beteiligten Komponenten (cpSRP54, \(\it Cr\)-43, cpFtsY) gefunden werden. Trotz hoher struktureller Ähnlichkeiten bilden hier \(\it Cr\)-43 und cpSRP54 keinen stabilen Komplex aus, sodass sich der LHCP-Transport von dem der Höheren Pflanzen unterscheidet.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der chloroplastidären Homologe Alb3 und Alb4 bei der Biogenese der Thylakoidmembran von \(\textit {Arabidopsis thaliana}\) genauer analysiert. In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob für den \(\it docking\) Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran eine direkte Interaktion der Proteine des cpSRP-Transportwegs mit der Translokase Alb3 vorliegt. Die \(\textit {in vivo}\) Interaktionsstudien zeigten eine direkte Interaktion von cpSRP43 mit Alb3. Anhand detaillierter Analysen wurden zwei Bindestellen des Alb3 für das cpSRP43 identifiziert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Bindedomäne des cpSRP43 für die Interaktion mit Alb3 eingegrenzt. In dem zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde eine direkte Interaktion und Assoziation von Alb4 mit der chloroplastidären ATP-Synthase nachgewiesen. Es zeigte sich zudem, dass Alb4 nicht mit Alb3 und cpSecY in einem stabilen Komplex vorliegt.

Über den Kerntransport von Transkriptionsfaktoren der TEAD-Familie sind bisher noch keine Untersuchungen gemacht worden. In dieser Arbeit wurde der Kernimport von Tec1, dem einzigen TEAD-Protein aus Saccharomyces cerevisiae, detailliert untersucht. In S. cerevisiae erfüllt Tec1 vielfältige Funktionen bei der Steuerung der Zellteilung und der Zelldifferenzierung. In dieser Studie wurden zwei Bereiche des Proteins identifiziert, NLS1 und NLS2 (NLS für nuclear localization signal, Kernlokalisierungssignal), die notwendig und hinreichend für die Kernlokalisierung von Tec1 sind. NLS1 liegt in der N-terminalen Hälfte des Proteins und überlappt vollständig mit der TEA-Domäne, welche DNA-Bindung vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass mehrere Aminosäuren für die Funktion der NLS1 kritisch sind und die meisten dieser Reste auch gleichzeitig bei der Bindung an TCS-Elemente (TCS für TEA consensus sequence) in der DNA eine wichtige Rolle spielen. In einem Strukturmodell liegen diese Reste in einer gemeinsamen Ebene, die folglich sowohl die Kontaktstelle für die Bindung an die DNA als auch vermutlich an Importine darstellt. Drei Aminosäuren wurden identifiziert, deren Seitenketten nicht für die DNA-Bindung entscheidend sind, deren Mutation jedoch zu einer geringeren Kernimporteffizienz führt. Demzufolge können die Funktionen DNA-Bindung und Kernlokalisierung zumindest teilweise getrennt werden. NLS2 liegt in der C-terminalen Hälfte von Tec1 und entspricht einem Bereich, der auch für die Interaktion mit anderen Proteinen, z. B. dem Trans-kriptionsfaktor Ste12, notwendig ist. Es konnte aber gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Ste12 der Kernimport von Tec1 über die NLS2 nicht beeinträchtigt ist. In der NLS2 wurden zwei benachbarte basische Reste, Lysin 318 und Arginin 319, als kritisch für die Funktion identifiziert. Weitere genetische und zellbiologische Untersuchungen ergaben, dass beide NLS-Bereiche für einen optimalen Kernimport benötigt werden. Biochemische Bindestudien ergaben zudem, dass beide NLSs mit mehreren Importinen interagieren können, wobei drei Importine beide Lokalisierungssignale erkennen, während vier Importine spezifisch für NLS1 bzw. NLS2 sind. Für Tec1 ergeben sich den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge zahlreiche Importmöglichkeiten, da es zwei NLSs enthält, die jeweils von mehreren Importinen gebunden werden können. Dies lässt darauf schließen, dass der Kernimport von Tec1 unter verschiedenen Bedingungen sichergestellt wird, unter denen dieser TEAD-Transkriptionsfaktor seine vielfältigen Funktionen wahrnehmen kann.

Epithelzellen charakterisieren sich durch die polare Organisation ihrer Zellmembran, welche sich in eine apikale und basolaterale Domäne aufteilt. Diese Struktur wird durch einen hoch spezialisierten Transport- und Sortiermechanismus aufrecht erhalten, welcher neu synthetisierte Plasmamembranproteine effizient zu ihrer korrekten Zielmembran befördert. In MDCK Zellen erfolgt der apikale Proteintransport nach Verlassen des TGN Exits über mindestens zwei verschiedene Sortiermechanismen, zum einen über einen lipid raft-abhängigen und zum anderen über einem lipid raft-unabhängigen Transportweg. Gegenstand dieser Arbeit war die Identifizierung von Proteinen, welche für den Transport apikaler Proteine essentiell sind. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte ein Mitglied der Kinesin-1 Gruppe/Familie, KIF5C, als Kinesin Motor für den apikalen Transport der raft-assoziierten Saccharase-Isomaltase, als auch der nicht-raft-assoziierten p75 identifiziert werden. KIF5C konnte mit Hilfe von Massenspektrometrie in immunisolierten post-Golgi Vesikeln, welche spezifisch apikale Proteine transportieren, nachgewiesen werden. Hierbei wurde es sowohl im raft-abhängigen Vesikeln von SI als auch im raft-unabhängigen Vesikeln von p75 und LPH direkt nach Verlassen des TGN-Exits identifiziert. Die spezifische Unterdrückung der KIF5C-Expression zeigte, dass der apikale Transport von sowohl raft-assoziierten als auch nicht-raft-assoziierten Markerproteinen signifikant reduziert wurde (Astanina and Jacob, 2010). Im zweiten Teil der Arbeit konnte ein weiteres Protein, Annexin XIIIb, mit Hilfe der Massenspektrometrie, Western Blot Analysen und konfokaler Mikroskopie im raft-unabhängigen apikalen Transport identifiziert werden. Hier konnte gezeigt werden, dass Annexin XIIIb in endosomalen Kompartimenten lokalisiert ist, welche sowohl von raft-unabhängigen als auch raft-abhängigen apikalen Proteinen nach Verlassen des TGN durchlaufen werden. Darüber hinaus führte die siRNA-vermittelte Reduktion der Annexin XIIIb-Expression zu einer Reduktion des apikalen Proteinanteils / des apikalen Proteintransportes von sowohl der raft-assoziierten SI als auch der nicht.raft-assoziierten Markerproteine p75 und LPH (Astanina et al., 2010). Zusammenfassend zeigt sich, dass beide in dieser Arbeit identifizierten Proteine, KIF5C and Annexin XIIIb, eine Rolle als endosomale Organisatoren beim apikalen Proteintransport in polaren Epithelzellen spielen. Die konfokalmikroskopischen Analysen sowie die TGN-release Experimente lassen den Rückschluss zu, dass beide Proteine direkt nach Verlassen des TGN eine Rolle im apikalen Transport raft und nicht-raft-assoziierte Proteine spielen., Epithelial cells are characterized by a polarized organization of their plasma membrane which is divided into apical and basolateral domains. This architecture is maintained by highly specific cargo sorting machinery that efficiently delivers newly synthesized polypeptides to their correct target membrane. After TGN exit apical cargo is segregated by at least two distinct sorting mechanisms into lipid-raft-dependent or lipid-raft-independent apical pathways in MDCK cells. The aim of this study was the identification of proteins which are essential for the transport of apically sorted proteins. In the first part of the current study, a member of kinesin-1 group, KIF5C, was identified as a kinesin motor for apical trafficking of sucrase-isomaltase, the marker for the raft-associated pathway, and of non-raft-associated p75. KIF5C was found by mass spectrometry in vesicle enriched fractions and on immunoisolated post-Golgi vesicles carrying apical cargo. KIF5C associates with vesicles of both raft-dependent and raft-independent pathways directly after TGN exit. The specific knockdown of KIF5C interfered the apical trafficking of both raft-associated and non-raft associated marker proteins significantly (Astanina and Jacob, 2010). In the second part, annexin XIIIb was identified in raft-independent apical trafficking by mass spectrometry, immunoblotting and confocal microscopy. Annexin XIIIb accumulated in endosomal compartments that are traversed by raft-dependent and raft-independent apical cargo after TGN release. Finally, a specific reduction of annexin XIIIb expression by RNA interference resulted in a significant decrease in the apical delivery of the raft- as well as non-raft apical markers (Astanina et al., 2010). Taken together, both proteins – KIF5C and annexin XIIIb – act as endosomal organizers of apical protein trafficking in polarized epithelial cells. Based on the confocal microscopy studies and TGN release experiments we came to the conclusion that both proteins function on the first transport steps after TGN exit and accomplish trafficking of raft-associated, as well as non-raft-associated apical cargo.

Chromalveolaten sind eine komplexe Gruppe von heterogenen Protisten. Die phototrophen Vertreter und apicomplexen Parasiten weisen ein spezielles Organell – die komplexe Plastide – auf, die ihren Ursprung in einer ehemals freilebenden Rotalge findet. Diese Arbeit trägt maßgeblich zum Verständnis der Evolution des Präproteinimports in „rote“ komplexe Plastiden bei. (1) Es konnte demonstriert werden, dass E. huxleyi ein SELMA-System exprimiert und dieses somit in Cryptophyten, Heterokontophyten, Apicomplexen und Haptophyten existiert. Es wurde gezeigt, dass heterologe Lokalisationsstudien haptophytischer Sequenzen prinzipiell in P. tricornutum möglich sind. Phylogenetische Analysen anhand von h/sCdc48 und h/sUba1 deuten auf einen Rotalgenursprung von SELMA hin. Die ERAD-Sequenzen zeigen keine Monophylie der Wirte und widersprechen demzufolge der Chromalveolaten-Hypothese. (2) Die Identifikation der Deubiquininase ptDUP unterstützt die Annahme einer mechanistischen Konservierung des Transports via SELMA. ptDUP wurde als PPC-lokalisiert und in vitro funktionell nachgewiesen. Wahrscheinlich entfernt ptDUP die Ubiquitinmodifikationen an importierten SELMA-Substraten, was vermutlich für die Reifung und den weiteren Import von Präproteinen essentiell ist. (3) Nucleus-codierte plastidäre Proteine benötigen Zielsteuerungssignale zum plastidären Import. Hier wurde gezeigt, dass dieser in Diatomeen abhängig von positiven Ladungen ist. Diese kritischen Aminosäuren müssen nicht Teil des physikalischen Transitpeptids sein, sondern können auch N-terminal im maturen Protein vorliegen. Dadurch kann dieses den eigenen Import fördern. Das Resultat hat Implikationen für die Etablierung des Gentransfers. Die Akquirierung von Import-vermittelnden Präsequenzen könnte unter jenen Voraussetzungen leichter zu bewerkstelligen sein, da die Anforderungen an Transitpeptide vermindert werden. Transitpeptide, die nur in Verbindung mit dem maturen Protein Import vermitteln, könnten so als Importsignale rekrutiert worden sein, deren Funktionalität erst durch fortwährende Mutation evolviert ist., Chromalveolates are a diverse protist group. The phototrophic chromalveolates as well as the apicomplexan parasites possess an organelle – termed the complex plastid – tracing back to an engulfed Rhodophyte. The work presented here increases the understanding of the evolution of protein import in red complex plastids. (1) The haptophyte Emiliania huxleyi expresses a SELMA system. Thus, SELMA exists in all chromalveolates with plastids surrounded by four membranes. Moreover, in vivo localization studies of haptophytic sequences in the diatom P. tricornutum are feasible. Phylogenetic analyses of h/sCdc48 and h/sUba1 indicate a red-algal origin of SELMA. ERAD sequences do not support monophyly and therefore contradict the chromalveolate hypothesis. (2) The identification of the deubiquitinase ptDUP indicates a mechanistic conservation of SELMA mediated transport. PtDUP is a PPC resident enzyme proven to be functional in vitro. Presumably, ptDUP deconjugates preproteins imported into the PPC ensuring their proper maturation or further transport steps into the complex plastid. (3) Nucleus encoded plastid proteins rely on targeting signals for import. It was shown that this is dependent on positive charge in diatoms. The crucial amino acids may not only be resident within the physical transit peptide, but also within the mature protein domain. This result has imüplications for endosymbiotic gene transfer, since the acquisition of proper targeting signals could be more efficient in these cases, because the demands for targeting signals within the presequence are lowered. Transit peptides, that are not self-sufficient, could have been recruited for imported to those genes encoding intrinsic targeting motifs. The self-sufficiency of the transit peptide domain could have been evolved in later steps by subsequent mutations.

Expressed Sequence Tag (EST) data from Ceratium horridum generated and analyzed in this thesis conform to the general parameters of dinoflagellate EST libraries. Comparison with diatom and plant transit peptides, revealed that transit peptides from peridinin-containing dinoflagellate conform to general trends for transit peptides but are relatively deficient in hydroxylated amino acids, have a slight net positive charge, and contain N-terminal basic amino acids among the most N-terminal amino acids. Like transit peptides in the alveolate Plasmodium falciparum, dinoflagellate transit peptides contain positively charged amino acids, have a depleted acidic residue content, and mostly contain one or more chaperone binding sites. The feature of dinoflagellate transit peptides that has gone unnoticed heretofore is the low overall positive charge, in addition to the significant division of charge between C- and N-termini. Despite its overwhelming prominence in dinoflagellate transit peptides, C-terminal negative charge clearly had no impact on the import competence of Amphidinium carterae targeting signals in heterologous in vivo systems. Based on results from transfections of Pisum sativum and Phaeodactylum tricornutum, targeting mediated by transit peptides is not merely dependent on net positive charge, N-terminal positive charge, or amino acid content. Therefore, it was concluded that plastid transport into plant and diatom plastids also depended on sequence-specific patterns or motifs that are not present and/or not identical to those in dinoflagellate transit peptides. Based on the partial interchangeability of topogenic signals between an alveolate and a chromist but not between an alveolate and a plant – despite high homologies in mature protein sequences – it was deduced that plastid targeting signals evolve more expediently than the mature protein domains that they intracellularly target. Analysis of the homologous intracompartmental transport of three Amphidinium carterae plastid proteins showed that differing transport routes exist for plastid proteins. While PsbO and Prk are transported by a Golgi-mediated route to the plastid, RbcL is transported directly from the ER to the plastids. In conclusion, a previously undescribed, possibly protein class-dependent, ER-mediated route seems to exist., Die in dieser Arbeit generierten und analysierten Expressed Sequence Tag (EST) Daten von Ceratium horridum entsprechen in vielen Hinsichten den allgemeinen Kriterien verglichen mit bekannten ESTs aus anderen Dinoflagellaten. Ein Vergleich von Transitpeptiden aus Dinoflagellaten mit Transitpeptiden aus Diatomeen und Pflanzen zeigte ein vergleichsweise geringeres Vorkommen hydroxylierter Aminosäuren, eine geringere positive Gesamtladung und ein vermehrtes Vorkommen basischer Aminosäuren am N-Terminus. Ähnlich zu den Transitpeptiden des Alveolaten Plasmodium falciparum, sind Transitpeptide aus Dinoflagellaten insgesamt positiv geladen, verarmt an sauren Aminosäuren und beinhalten zu größten Teilen eine Chaperonbindestelle. Die niedrige positive Gesamtladung der Transitpeptide aus Dinoflagellaten sowie eine signifikante Trennung dieser Ladung in eine negative C-terminale Hälfte und positive N-terminale Hälfte konnten als neue Besonderheiten identifiziert werden. Trotz des häufigen Vorkommens der negativen C-terminalen Ladung, hatte dieses Merkmal keine eindeutige Wirkung auf die Importkompetenz der topogenen Signale von Amphidinium carterae in heterologen in vivo Systemen. Basierend auf den Ergebnissen von Transfektionen in Pisum sativum und Phaeodactylum tricornutum, hängt die Information eines Transitpeptids weder von der positiven Gesamtladung, noch von der N-terminalen positiven Ladung oder der Aminosäurenzusammensetzung ab. Proteinimport in Plastiden von Diatomeen und Pflanzen scheint folglich von bislang unidentifizierten sequenzspezifischen Mustern oder Motifen abhängig zu sein. Eine partielle Austauschbarkeit von topogenen Signalen zwischen einem Dinoflagellaten und einem Chromisten ist trotz hoher Homologien der maturen Proteinsequenzen nicht auf Alveolaten und Pflanzen übertragbar. Somit scheinen Zielsteuerungssequenzen schneller zu evolvieren als die maturen Proteindomänen. Die Untersuchung des homologen intrakompartimentalen Transports dreier plastidärer Proteine in Amphidinium carterae zeigte Unterschiede in Bezug auf den Transportweg. Während die Proteine PsbO und Prk über einen Golgi-vermittelten Transport in die Plastide gelangen, scheint RbcL dieses Kompartiment zu umgehen und direkt über das ER in die Plastiden zu gelangen. Daher ist davon auszugehen, daß ein für Dinoflagellaten bislang unbekannter, möglicherweise proteinklassenabhängiger Transportweg existiert.

Der Proteinimport in Peroxisomen unterscheidet sich fundamental von bekannten Translokons, indem gefaltete und sogar oligomere Proteine durch die peroxisomale Membran transportiert werden. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Hypothese, nach der der lösliche Importrezeptor Pex5p nach Erkennung seiner Cargo-Proteine im Cytosol selbst zu einem zentralen Bestandteil einer "transienten Pore" wird. Sowohl die postulierte Homooligomerisierung von Pex5p als auch die Bindefähigkeit an Phospholipide konnten in vitro bestätigt werden. In vivo konnte gezeigt werden, dass Pex5p in verschiedenen heterooligomeren Komplexen an der peroxisomalen Membran vorliegt. Nach Rekonstitution dieser Komplexe in Proteoliposomen konnte mittels elektrophysiologischer Untersuchungen bewiesen werden, dass Pex5p zusammen mit dem Dockingpartner Pex14p einen Kanal in der Membran bildet, der bezüglich Größe, Dynamik und Induzierbarkeit alle Eigenschaften der gesuchten transienten Translokationspore aufweist.

Die Translokation von Proteinen aus dem Zytosol in die peroxisomale Matrix erfolgt größtenteils Pex5p-abhängig. Pex5p wird im Rahmen des Rezeptorzyklusses an der peroxisomalen Membran durch die Anbindung von Ubiquitin unterschiedlich modifiziert, was zum einen die Degradation falsch gefalteter Proteine und zum anderen die Wiederverwertung des PTS1- Rezeptors zur Folge hat. Hier wurde anhand des Modellsystems der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae die Ubiquitinylierung des Pex5p näher untersucht. Mittels Membransedimentation wurde das Konstrukt Pex5p [1-313] als kleinstes, noch die peroxisomale Membran erreichende Protein identifiziert. Weiter konnte gezeigt werden, dass Pex5p [1-313] das kleinste noch ubiquitinylierte Fragment darstellt. Nach Einbringen von Punktmutationen in das Pex5p mit dem Austausch von einzelnen Lysinen gegen Arginin zeigte die Doppelmutation der Lysine 18 und 24 keine Polyubiquitinylierung. Daher stellen diese Aminosäuren die Ziele der Polyubiquitinylierung dar.

In this thesis it was succeeded to establish an expression system for BDV-glycoprotein. This system yielded a BDV-glycoprotein, which correlates with the wild type glycoprotein in all characteristics. It is cloven at Amino acid position 246-249 by Furin. The transport to the cell surface and the therewith associated glycosylation conform to the natural glycoprotein. Therefore, it was possible to make the further analysis with the help of a vectorialy expressed glycoprotein, which complies with the glycoprotein of infected cells. As it is fact, that many proteins which are involved in cell fusion are dimmers or trimers, so this was investigated for the BDV-glycoprotein, too. Superior, oligomeric forms of the BDV glycoprotein could be demonstrated, in all probability, dimers and trimers of this protein. By means of this new expression system it was possible to show, that the BDV glycoprotein is able to arrange the cell-cell-fusion on its own after the subsidence of the pH-value. For this reaction it is essential that the BDV-glycoprotein has been cloven before. Compared to the amount in infected cells, the increased fusion activity of BDV-glycoprotein stable cell line could be explained by the higher expression level and the more efficient transport to the cell surface. An inhibition of the fusion of about 50% could be attained by the treatment of the cells with Heparin before lowering the pH-value. Through substitution in the amino acid region 296-305 in the c-terminal subunit of BDV-glycoprotein it could be shown that this region plays an important role during the fusion process. As a conclusion it can be stated, that the fusion peptide is located in this domain. In order to precisely characterise the fusion peptide, further investigations have to be carried out., In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Expressionssystem für das BDV-Glykoprotein zu etablieren, welches ein solitäres BDV-Glykoprotein hervorbringt, das vollständig funktionell ist und in allen seinen Eigenschaften denen des Wildtyp-Glykoproteins entspricht. Es wird ebenso wie das Wildtyp-Glykoprotein an Aminosäure-Position 246-249 durch Furin gespalten. Der Transport zur Oberfläche und die damit verbundene Glykosylierung entsprechen der des natürlichen Glykoproteins. Somit konnten nun alle weiteren Untersuchungen an einem vektoriell exprimierten Glykoprotein durchgeführt werden, welches dem aus infizierten Zellen entspricht. Da bekannt ist, dass viele Proteine, die an der Zellfusion beteiligt sind, meist als Dimere oder Trimere vorliegen, wurde hier dieses auch für BDV untersucht. Dargestellt werden konnten höher oligomere Formen des BDV-Glykoproteins, wobei es sich wahrscheinlich um dimere und trimere Formen des BDV-Glykoproteins handelt. Mit Hilfe des Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass das BDV- Glykoprotein alleine in der Lage ist, nach einer Erniedrigung des pH-Werts eine Zell-Zell-Fusion zu vermitteln. Essentiell für die Fusion ist, dass das BDV-Glykoprotein gespalten vorliegt. Die erhöhte Fusionsaktivität der stabil Glykoprotein exprimierenden Zelllinie gegenüber infizierten Zellen liegt wahrscheinlich an der erhöhten Expressionsrate und dem effizienteren Transport an die Oberflächen. Eine Inhibition der Fusion um 50% konnte durch eine Behandlung der Zellen mit gelöstem Heparin erreicht werden, bevor der pH-Wert herabgesetzt wurde. Durch Substitutions-Mutationen konnte gezeigt werden, dass der Aminosäurebereich 296-305 in der C-terminalen Untereinheit des BDV-Glykoprotein eine wichtige Rolle bei der Fusion spielt. Es kann daher gesagt werden, dass ein Fusionspeptid in diesem Bereich des BDV-Glykoprotein liegt. Für eine genauere Charakterisierung sind weitere Untersuchungen nötig.

The diatom Phaeodactylum tricornutum harbors a plastid that is surrounded by four membranes and evolved by way of secondary endosymbiosis. Like land plants, most of its plastid proteins are encoded as preproteins on the nuclear genome of the host cell and are resultantly redirected into the organelle. Because two more membranes are present in diatoms than the one pair surrounding primary plastids, the targeting situation is obviously different and more complex. In my PHD-work, I focused on preprotein transport across the second outermost plastid membrane – an issue that was inaccessible until now. My results provide first indications that the hypothesis of an ERAD (ER-associated degradation)-derived preprotein transport system might be correct. The data demonstrate that the symbiont-specific Der1 proteins, sDer1-1 and sDer1-2, form an oligomeric complex within the second outermost membrane of the complex plastid of P. tricornutum. Moreover, the results provide evidence that the complex interacts with transit peptides of preproteins being transported across this membrane into the periplastidal compartment, but not with transit peptides of stromal targeted proteins. Thus, the sDer1-complex might have an additional role in discriminating preproteins that are transported across the two outermost membranes from preproteins directed across all four membranes of the complex plastid. Altogether, the studies of the symbiont-specific ERAD-like machinery of diatoms suggest that a preexisting cellular machinery was recycled to fulfill a novel function during the transition of a former free-living eukaryote into a secondary endosymbiont., Diatomeen spielen bei der globalen Kohlenstofffixierung eine maßgebliche Rolle und stellen als Hauptbestandteil des Phytoplanktons einen Großteil der marinen Biomasse dar. Wie viele andere Algengruppen, aber auch beispielsweise humanpathogene Organismen, wie der Malariaerreger P. falciparum, sind Diatomeen im Rahmen einer sekundären Endosymbiose entstanden, bei der eine Rotalge von einer eukaryoten Wirtszelle aufgenommen und zur komplexen Plastide reduziert wurde. Vergleichbar mit der Entstehung primärer Plastiden mussten in der Folge Transportmechanismen entwickelt werden, um Präproteine zurück in die Plastide über nun allerdings nicht zwei, sondern drei bzw. vier Membranen zu transportieren. Wie die Zelle dieses Problem mechanistisch gelöst hat, war lange Zeit unklar und wurde im Rahmen verschiedenster Modelle diskutiert. 2007 wurde auf theoretischer Basis postuliert, dass der Präproteintransport an der zweiten Plastidenmembran von Heterokontophyten, Haptophyten, Cryptophyten und Apikomplexen durch ein ERAD-ähnliches Transportsystem vermittelt wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Hypothese in der Diatomee P. tricornutum erstmals experimentell untermauert werden. Es wurde gezeigt, dass die symbiontenspezifischen ERAD-Faktoren sDer1-1 und sDer1-2 einen oligomeren Komplex in der zweiten Plastidenmembran bilden und mit den Transitpeptiden periplastidärer Präproteine interagieren. Der sDer1-Komplex spielt dabei als potentiell kanalbildende Komponente eine zentrale Rolle des symbiontenspezifischen ERAD-ähnlichen Systems SELMA. Zusätzlich findet am sDer1-Komplex eine Unterscheidung stromaler und periplastidärer Präproteine statt. So wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass Transitpeptide periplastidärer nicht aber stromaler Präproteine mit den Proteinen sDer1- 1 und sDer1-2 interagieren. Untersuchungen mit mutagenisierten Transitpeptiden zeigten zudem, dass alleine die +1 Position des Transitpeptids, besetzt mit einer aromatischen bzw. nicht-aromatischen Aminosäure, für diese Unterscheidung am sDer1-Komplex kritisch ist. Mit der symbiontenspezifischen Ubiquitin-Ligase s-E3 wurde ein Kandidat für ein weiteres Schlüsselelement von SELMA identifiziert. Im Ganzen zeigt sich damit, dass das symbiontenspezifische ERAD-Translokationssystem im Zuge der Endosymbiose von der ER-Membran in die zweite Plastidenmembran relokalisiert und zum Präproteintranslokator SELMA umfunktioniert wurde.

Chromalveolaten sind eine hochdiverse Gruppe von Protisten, die als gemeinsames Merkmal eine sogenannte komplexe Plastide tragen. Diese ist das Resultat einer sekundären Endocytobiose zwischen einer eukaryoten Wirtszelle und einer Rhodophyte. Die komplexe Plastide ist, anders als die primären Plastiden der Archaeplastida, i. d. R von vier Membranen umgeben (eine Ausnahme bilden die Plastiden der Peridinin-haltigen Dinoflagellaten mit nur drei Membranen). Wie auch bei den Archaeplastida ist ein Großteil der plastidären Proteine von Chromalveolaten auf dem Kerngenom des Wirtes codiert, und muss daher posttranslational aus dem Cytosol importiert werden. Proteine des Plastidenstromas müssen also vier Membranen passieren. Während für drei der vier Membranen bereits putative Translokatoren beschrieben werden konnten, war das Translokon der drittäußersten Membran bislang völlig unbekannt. Diese Membran ist der äußeren Membran primärer Plastiden homolog, ein entsprechendes Toc-Translokon konnte allerdings bislang nicht identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein kürzlich identifiziertes putatives Omp85-Protein der Diatomee Phaeodactylum tricornutum erstmals eingehend analysiert und charakterisiert. Das Protein, ptOmp85, konnte eindeutig der Familie der Omp85- Proteine zugeordnet werden. Innerhalb der Familie weist es die die nächsten Verwandtschaftsbeziehungen zum Toc75-Homolog der freilebenden Rotalge Cyanidioschyzon merolae auf. Es konnte nachgewiesen werden, dass ptOmp85 ein integrales Protein der drittäußersten Membran der komplexen Plastide ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ptOmp85 intraorganellär einem zu Toc75 homologen. Zielsteuerungsmechanismus unterliegt. Die Analyse der elektrophysiolgischen Eigenschaften der Membranpore von ptOmp85 zeigte eindeutige Ähnlichkeiten zu den Poreneigenschaften von Toc75-artigen, nicht aber zu denen von Sam50-artigen Omp85-Proteinen. Diese aufgedeckten Charakteristika implizieren, dass es sich bei ptOm85 tatsächlich um das Proteintranslokon der drittäußersten Plastidenmembran von Chromalveolaten handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen somit grundlegend zum Verständnis des Proteinimports in die komplexen Plastiden dieser Protistengruppe bei., Chromalveolates are a diverse group of protists that include many ecologically and medically relevant organisms such as diatoms and apicomplexan parasites. They possess plastids generally surrounded by four membranes, which evolved by engulfment of a red alga. Today, most plastid proteins must be imported, but many aspects of protein import into complex plastids are still cryptic. In particular, how proteins cross the third outermost membrane has remained unexplained. We identified a protein in the third outermost membrane of the diatom Phaeodactylum tricornutum with properties comparable to those of the Omp85 family. We demonstrate that the targeting route of P. tricornutum Omp85 parallels that of the translocation channel of the outer envelope membrane of chloroplasts, Toc75. In addition, the electrophysiological properties are similar to those of the Omp85 proteins involved in protein translocation. This supports the hypothesis that P. tricornutum Omp85 is involved in precursor protein translocation, which would close a gap in the fundamental understanding of the evolutionary origin and function of protein import in secondary plastids.

In chloroplasts members of the Alb3/YidC/Oxa1p protein family are necessary for assembly of photosynthetic complexes in the thylakoid membranes. For Alb3p in Arabidopsis thaliana an important function in LHCII-integration into thylakoid membranes has been shown. In Synechocystis the Alb3 homolog SynOxa1p is responsible for the insertion of D1 into the thylakoid membrane and the assembly into photosystem (PS) II. The albino3 mutation of Alb3p has pleiotropic defects. Under autotrophic growth conditions albino3 is seedling-lethal. Plants shifted to autotrophic growth grow slowly, are sterile and show a yellowish phenotype. This complex phenotype suggests additive functions for Alb3p beyond dysfunction in LHCII integration and PSII assembly. To analyse this potential additional Alb3 function, different Arabidopsis thaliana mutants with defects in thylakoid membrane protein transport and on mutant with knock-out of carotenoid biosynthesis were characterised at different light conditions and compared to the albino3 mutation. These mutants were knock-out mutations of Hcf106, part of the receptor complex in delta pH/cpTat transport, CpFtsY and CpSRP54 which are together with Alb3p part of the cpSRP transport pathway for post-translational LHCII integration and co-translational D1 assembly and PSY as central enzyme of the carotenoid biosynthesis pathway. Comparison of the different phenotypes shows that Alb3p maybe important for carotenoid assembly into photosynthetic complexes while cpSRP protein insertion into the thylakoid membrane.

Die GTPase ARFRP1 (ARF-related protein 1) ist ein ubiquitär exprimiertes Mitglied der ARF (ADP ribosylation factor)-Familie, die als GTP-abhängige, molekulare Schalter in der Regulation des intrazellulären Transports und der Golgi-Funktion beteiligt sind. Aktives ARFRP1 assoziiert mit Membranen des trans-Golgi und kontrolliert die Rekrutierung von ARL1 und seinen Effektoren, den GRIP-domain Proteinen, an dieses Kompartiment. Die Darm-spezifische Deletion von Arfrp1 in der Maus führte zu einer frühen, postnatalen Wachstumsretardierung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Darm-spezifischen Arfrp1-Nullmutante bezüglich der Wachstumsretardierung und der Absorption von Nährstoffen. Zusätzlich sollte die Rolle von ARFRP1 für die Translokation von E-Cadherin an die Plasmamembran epithelialer Zellen untersucht werden. Arfrpvil-/--Mäuse zeigten erniedrigte Blutglucosespiegel, sowie reduzierte Konzentrationen an Triglyceriden und freien Fettsäuren im Plasma, was auf eine Malabsorption als Ursache der Wachstumsretardierung hinwies. Mehrere Experimente zeigten, dass die Absorption von Glucose und Proteinen durch die Abwesenheit von ARFRP1 nicht beeinflusst war. Im Gegensatz dazu wurde mit Hilfe eines oralen Fett- Toleranztests eine eingeschränkte Lipidaufnahme der Arfrp1vil-/--Tiere nachgewiesen, obwohl sie nach oraler Ölgabe Fettsäuren ins Darmepithels aufnahmen und dort als Lipidtropfen akkumulierten. Demnach scheint ARFRP1 an der Formation oder Sekretion von Chylomikronen beteiligt zu sein. Der Mangel von ARFRP1 in den Enterozyten der Arfrp1vil-/--Mäusen beeinflusste die Rekrutierung von Proteinen an den trans-Golgi und dessen Organisation, da ARL1 ausschließlich im Zytosol der Arfrp1vil-/--Enterozyten vorlag und der trans- Golgi-Marker TGN38 in immunhistochemischen Analysen nicht nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war die Organisation des cis-Golgis nicht beeinträchtigt. Interessanterweise zeigten die Rab-Proteine Rab2 und Rab6, als Interaktionspartner der Effektoren von ARL1, den GRIP-domain Proteinen, eine veränderte Expression und Lokalisation in Arfrp1vil-/--Enterozyten. Dies zeigt, dass eine direkte Kaskade ARFRP1-ARL1-GRIP-Rab2/6 für die Synthese und/oder die Sekretion von Chylomikronen benötigt wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von ARFRP1 in der Regulation der Translokation von E-Cadherin an die Plasmamembran in den Epithelzellen des Darms bestätigt. In Arfrp1vil-/--Tieren verblieben große Teile von E-Cadherin in intrazellulären Membranen des Darmepithels und lagen partiell mit dem cis-Golgi-Marker GM130 ko-lokalisiert vor. Mit Hilfe von Ko-Immunopräzipitationen wurde eine direkte Interaktion von ARFRP1 mit dem E-Cadherin/β-Catenin Komplex nachgewiesen. Dies zeigt eine essentielle Rolle von ARFRP1 für die korrekte Sortierung von E-Cadherin durch den Golgi-Apparat und somit für die Lokalisation des E-Cadherin/β-Catenin Komplexes an der Zelloberfläche., The GTPase ARFRP1 (ARF-related protein 1) is a member of the family of ADP- ribosylation factors (ARFs) that operate as GTP-dependent molecular switches in the regulation of intracellular protein traffic and Golgi function. It associates with trans-Golgi membranes and controls the recruitment of ARL1 and its effectors, GRIP-domain proteins such as golgin-245. Conditional deletion of Arfrp1 in the intestinal epithelium of mice (Arfrp1vil-/-) as achieved by crossing Arfrp1flox/flox mice with transgenic mice expressing the Cre- recombinase under the villin promoter, resulted in an early postnatal growth retardation. The aim of the present work was to characterise the intestine- specific Arfrp1 nullmutant in respect to the growth retardation and to study its nutrient absorption. In addition, the specific role of ARFRP1 for the targeting of E-cadherin to the cell surface of epithelial cells should be evaluated. Arfrpvil-/- mice revealed decreased levels of blood glucose as well as triglyceride and free fatty acid concentrations in the plasma, indicating that their growth retardation is the consequence of a malabsorption. Several experiments revealed, that glucose and aminoacid absorption was not affected in Arfrpvil-/- mice. In contrast, lipid uptake elucidated by oral fat tolerance tests was impaired in Arfrp1vil-/- mice. However, Arfrp1vil-/- mice transported fatty acids into the intestinal epithelium and accumulated lipid droplets in epithelial cells after an oil bolus. This indicates that ARFRP1 is required either in chylomicron formation or their release. The lack of ARFRP1 in enterocytes of Arfrp1vil-/- mice impaired the recruitment of proteins to the trans-Golgi and altered trans-Golgi organisation, as ARL1 was exclusively located in the cytosol of Arfrp1vil-/- cells and the trans-Golgi marker TGN38 was not detectable by immunohistochemistry. In contrast, the organisation of the cis-Golgi was unaffected as detected by staining with antibodies for GM130 and p115. Interestingly, the Rab proteins Rab2 and Rab6 as interaction partners of the ARL1 effector GRIP-domain proteins, exhibited an altered expression and distribution in Arfrp1vil-/- enterocytes suggesting that a ARFRP1-ARL1-GRIP-Rab2/6 cascade is required for intestinal chylomicron production and/or release. In the second part of the present work the role of ARFRP1 in the regulation of targeting of E-cadherin to the plasma membrane was confirmed for the intestinal epithelium. Arfrp1vil-/- mice exhibited a retention of E-cadherin in intracellular membranes partially colocalising with the cis-Golgi marker GM130 in epithelial cells of the small intestine. In addition, a direct interaction of ARFRP1 with the E-cadherin/catenin complex was demonstrated by co-immunoprecipitation experiments. These data indicate that ARFRP1 is essential for the correct trafficking of E-cadherin through the Golgi and thereby required for the correct cell surface targeting of the E-cadherin complex.

The development of the nervous system is a complex and highly regulated process in which the exact timing and location of the action of neurotrophins and their receptors plays an important role. They support survival and differentiation of neuronal cells. The prototypic neurotrophin NGF (nerve growth factor) specifically stimulates the transmembrane receptor TrkA. The TrkA Isoform II, which is expressed in neuronal cells only, can additionally be activated by Neurotrophin 3 (NT 3). TrkA knockout mice suffer from massive neuronal cell loss and most of them die within one month. In human patients mutations in the trkA gene can lead to hereditary sensory and autonomous neuropathy type IV (HSAN IV or CIPA = congenital insensitivity to pain with anhidrosis). This autosomal recessive disorder manifests in loss of pain and temperature sensitivity, the inability to sweat and often also mental retardation. Due to the human pathogenic mutation R780P close to the C terminus of TrkA and its phospholipaseCgamma (PLCgamma) binding site, the receptor cannot be phosphorylated anymore. In the present work it could be demonstrated that nevertheless downstream pathways could still be activated on a reduced level following stimulation with NGF and NT 3, respectively. Further analysis of the interaction with binding partners revealed that PLCgamma1 binding could still be detected but was compromised. However the interaction with Shc was unchanged compared to wild type TrkA receptor. In addition the R780P mutation led to alterations of intracellular TrkA trafficking. Following internalisation the receptor did not enter anymore the lysosomal degradative pathway, but – at least to some extent – was recycled back to the cell surface. Moreover, the mutation R780P led to defects in neurite outgrowth. These effects were accompanied by an impairment of protein stability of the mutated receptor and changes in the viability of transiently transfected cells. Hence a model is discussed in which the mutation R780P leads to the sorting of the receptor into recycling endosomes which allows a minimum of downstream pathway activation. Still, this activation is not sufficient to promote neurite outgrowth. These alterations could contribute to the pathomechanism leading to impaired innervation of sweat glands and skin in HSAN IV patients.

Peroxisomen sind ubiquitär in Eukaryonten vorkommende Zellorganellen, die ihre Matrix- und Membranproteine posttranslational importieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des peroxisomalen Matrixproteinimportes untersucht. Ein Projekt beschäftigte sich mit der Fragestellung, inwiefern die PTS-Rezeptoren der Hefe \(\textit {S. cerevisiae}\) am Translokationsschritt von Matrixproteinen über die Peroxisomenmembran beteiligt sind. Diesbezüglich wurde mittels mehrerer methodischer Ansätze untersucht, was nach dem "Docking" der Kargo-beladenen Rezeptoren an die peroxisomale Membran geschieht. Zudem erfolgte eine detaillierte Analyse des PTS2-Korezeptors Pex18p. Dabei wurde Pex18p hinsichtlich Ubiquitin-Modifikationen untersucht und außerdem wurde die Beteiligung dieses Proteins am PTS2-Kargoimport näher charakterisiert. Ein weiteres Projekt innerhalb dieser Arbeit war die Etablierung eines PTS2-\(\textit {in vitro}\)-Import-Systems.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der chloroplastidären Homologe Alb3 und Alb4 bei der Biogenese der Thylakoidmembran von Arabidopsis thaliana genauer analysiert. In einem ersten Teilprojekt dieser Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob für den docking-Prozess des Transitkomplexes an die Thylakoidmembran eine direkte Interaktion der Proteine des cpSRP-Transportwegs mit der Translokase Alb3 vorliegt. Die in vivo Interaktionsstudien zeigten eine direkte Interaktion von cpSRP43 mit Alb3. Anhand detaillierter Analysen wurden zwei Bindestellen des Alb3 für das cpSRP43 identifiziert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Bindedomäne des cpSRP43 für die Interaktion mit Alb3 eingegrenzt. In dem zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde eine direkte Interaktion und Assoziation von Alb4 mit der chloroplastidären ATP-Synthase nachgewiesen. Es zeigte sich zudem, dass Alb4 nicht mit Alb3 und cpSecY in einem stabilen Komplex vorliegt.

Epithelzellen besitzen die Fähigkeit zur Ausbildung und Aufrechterhaltung funktional unterschiedlicher Bereiche der Plasmamembran. Die apikale Membran ist zum Lumen (Umwelt) gerichtet, die basolaterale Membran zur Basalmembran und zu den benachbarten Epithelzellen. Dabei unterscheiden sich die apikale und die basolaterale Membran in ihrer Protein- und Lipidzusammensetzung. Diese unterschiedlich aufgebauten Bereiche der Plasmamembran werden durch die Tight Junctions voneinander getrennt und durch einen selektiven Transport aufrechterhalten. Für den selektiven Transport spielen verschiedene Sortiersignale eine entscheidende Rolle, die die Proteine in entsprechende Transportvesikel sortieren. Im basolateralen Transport sind es vor allem spezifische Aminosäuresequenzen im zytoplasmatisch gelegenen Anteil der Proteine. Apikale Sortiersignale sind vielfältiger und umfassen N- und O-Glykane, GPI-Anker und Transmembrandomänen. Diese apikalen Sortiersignale beeinflussen, ob apikal-lokalisierte und -sezernierte Proteine einen Lipid Raft-abhängigen oder einen Lipid Raft-unabhängigen Weg zur apikalen Membran durchlaufen. Als Lipid Rafts werden spezielle Membranmikrodomänen in Zellmembranen angesehen. Auf den Weg gebrachte Transportvesikel mit der zuvor selektiv zusammengestellten Fracht, binden zunächst an die Zielmembran, bevor sie mit dieser verschmelzen. Diese Bindung wird von Vesikel-Bindungskomplexen vermittelt. Einer dieser Bindungskomplexe ist der Exocyst-Komplex, ein Multiproteinkomplex bestehend aus acht Untereinheiten. Exocyst-Untereinheiten befinden sich dabei sowohl am Transportvesikel (Ligand) als auch an der Zielmembran (Rezeptor). Ligand und Rezeptor vermitteln die spezifische Bindung, bevor die Verschmelzung stattfinden kann. Die Verschmelzung von Vesikel und Membran wird über sog. SNARE-Komplexe vermittelt. In polaren MDCK-Zellen (Nierenepithelzellen) befindet sich der überwiegende Teil des Exocyst-Komplexes an der lateralen Membran, in unmittelbarer Nähe zu den Tight Junctions. Eine wichtige Rolle des Exocyst-Komplexes im gerichteten Transport konnte für einige basolateral lokalisierte Proteine in MDCK-Zellen bereits gezeigt werden. Im Rahmen dieser Dissertation, wurde die Rolle bestimmter Exocyst-Untereinheiten, besonders von Sec8, im apikalen Transport des Modellproteins Saccharase-Isomaltase (SI) in MDCK-Zellen untersucht. Ausgangspunkt war die Identifizierung der Untereinheit Sec6 an SI-tragenden, apikalen Transportvesikeln 20 min nach Verlassen des trans-Golgi Netzwerkes (TGNs) in polaren MDCK-SI-YFP-Zellen. Immunpräzipitations-Experimente konnten die Assoziation einer weiteren Exocyst-Untereinheit, Sec8, mit SI-tragenden Vesikeln zeigen. Dabei interagiert Sec8 indirekt mit SI. Eine Verminderung der endogenen Sec8-Konzentration durch spezifische siRNA zeigte keinen Einfluss auf den apikalen Transport der SI in MDCK-SI-Zellen. Mikroskopische Untersuchungen an MDCK-SI-YFP-Zellen lassen auf eine Interaktion von Sec6 und Sec8 mit SI-tragenden Vesikeln an der lateralen Membran schließen. Dieser Membranbereich entspricht der Hauptlokalisation des Exocyst-Komplexes in polaren MDCK-Zellen und befindet sich in unmittelbarer Nähe der Tight Junctions. Mikroskopische Untersuchungen an unpolaren COS-Zellen (Fibroblasten) konnten keine Kolokalisation von SI-tragenden Vesikeln mit den Exocyst-Untereinheiten Sec6 und Sec8 zeigen. Sec6 und Sec8 sind in COS-Zellen überwiegend an Recycling Endosomes lokalisiert. Die SI wird über einen Lipid Raft-abhängigen Weg zur apikalen Membran transportiert. Eine Isolation dieser speziellen Membranmikrodomänen ergab, dass die Untereinheit Sec8 ebenfalls mit sog. Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus MDCK-SI-Zellen assoziiert ist. Die im Rahmen der Doktorarbeit gewonnenen Daten deuten darauf hin, dass die Exocyst-Untereinheit Sec8 keinen Einfluss auf den apikalen Transport der SI an die Zelloberfläche in MDCK-Zellen hat. Zu diesem Zeitpunkt kann keine Aussage darüber getroffen werden, wo die Assoziation von Sec8 mit DRMs zustande kommt. Weitere Untersuchungen sind dafür notwendig., Epithelial cells are able to form and sustain different functional areas in their plasma membrane. The apical membrane faces the lumen (environment) and the basolateral membrane faces the basement membrane and neighbouring cells. The two membrane domains differ in their protein and lipid composition. These different types of membranes are separated by tight junctions and sustained by a selective transport. Different sorting signals are important for the selective transport and for the sorting of proteins in respective transport vesicles. For the basolateral transport specific amino acid sequences in the cytoplasmic part of the protein are important. Apical sequences are more complex and consist of N- and O-glycans, GPI-anchors, and transmembrane domains. These apical sorting signals bias if apical-localized and -secreted proteins take the lipid raft associated or the non-lipid raft associated route to the apical membrane. Lipid rafts are special membrane microdomains within cell membranes. Transport vesicles with their selective cargo bind to the target membrane on the route to the cell surface before fusion occurs. Vesicle binding to the target membrane is arranged by tethering complexes. One of these tethering complexes is the so-called “Exocyst” complex, a multiprotein complex consisting of eight subunits. Exocyst subunits can be found on the transport vesicle (ligand) as well as on the target membrane (receptor). Ligand and receptor arrange the binding before fusion occurs. The fusion of the vesicle and the membrane is then triggered by SNARE-complexes. In polarized MDCK cells (kidney epithelial cells) the main part of the Exocyst complex is located on the lateral membrane near the tight junctions. A decisive role of the Exocyst complex in protein trafficking could previously be shown for some basolateral localized proteins in MDCK cells. Within this dissertation, the role of some Exocyst subunits, especially for Sec8, in the apical transport of the model protein sucrase-isomaltase (SI) in MDCK cells were investigated. The starting point was the identification of the Exocyst subunit Sec6 on SI carrying, apical transport vesicles twenty minutes after the release from trans-Golgi network in polarized MDCK-SI-YFP cells. Immunoprecipitation experiments could show an association of another Exocyst subunit, Sec8, with SI carrying vesicles. Sec8 interacts indirectly with SI. Reduction of endogenous Sec8 concentration by specific siRNA shows no effect on the apical transport of SI in MDCK-SI cells. Microscopic investigations in MDCK-SI-YFP cells suggest an interaction of Sec6 and Sec8 with SI carrying vesicles on the lateral membrane. This membrane area corresponds to the main localization of the Exocyst complex in polarized MDCK cells and resides near the tight junctions. Microscopic investigations in unpolarized COS cells (fibroblasts) shows no colocalization of SI carrying vesicles with the Exocyst subunits Sec6 and Sec8. Sec6 and Sec8 are localized in COS cells predominantly on recycling endosomes. SI is transported on a lipid raft-dependent route to the apical membrane. Isolation of these special membrane microdomains shows that the subunit Sec8 is also associated with detergent resistant membranes (DRMs) in MDCK-SI cells. The data obtained within this dissertation suggest, that the Exocyst subunit Sec8 has no influence on the apical transport of SI in MDCK cells. At this time, no conclusion can made where the association of Sec8 with DRMs occurs. Further investigations are necessary in this regard.

The aim of this PhD thesis was the functional analysis of Oxa1/Alb3/YidC homologues in Synechocystis and Chlamydomonas reinhardtii with focus on protein insertion and assembly. The results of the analysis of Synechocystis Slr1471p using the Split-Ubiquitin system can be summarized as follows: A direct interaction of the PSI reaction centrum protein PsaB with the Oxa1/Alb3/YidC homologue Slr1471p and the cpSecY homologue Sll1814p could be demonstrated. Localization studies of the interaction sites of Slr1471p showed that all analyzed proteins interact with the transmembrane helices 4-5 of Slr1471p, apart from Slr1531p. Slr1531p associates with the N-terminal transmembrane helices 1-3 of Slr1471p. This suggests that the N-terminal site of Slr1471p binds to Slr1531p and is responsible for protein targeting to the membran, while the C-terminal site shows an affinity for the substrates. For the biochemical analysis of Alb3.2p of C. reinhardtii the following results were obtained: Alb3.2p is localized in the thylakoid membrane and enriched in the stroma lamella. An association of Alb3.2p with polysomes could not be demonstrated using polysome analysis. Therefore an Alb3.2p participitation in co-translational integration is very unlikely. Alb3.2p is interacting only with itself, as shown by co-immunoprecipitation and HPLC/MS analysis. In the chloroplasts of C. reinhardtii Alb3.2p exist as monomer or homooligomer. An association of Alb3.2p with interacting partners seems to be weak or short-lived. An association of Alb3.2p with high molecular weight complexes of > 1 MDa could be demonstrated for the first time by cross linking experiments. The results give evidence that the function of Oxa1/Alb3/YidC homologues changed during evolution. Because of gene duplication it was possible that Oxa1/Alb3/YidC homologues in the chloroplasts of higher plants gained spezialized functions loosing the property to insert proteins co-translationally.

Proteins of the intermembrane space of mitochondria are generally encoded by nuclear genes that are synthesized in the cytosol. A group of small intermembrane space proteins lack classical mitochondrial targeting sequences, but these proteins are imported in an oxidation-driven reaction that relies on the activity of two components, Mia40 and Erv1. Both proteins constitute the mitochondrial disulfide relay system. Mia40 functions as an import receptor that interacts with incoming polypeptides via transient, intermolecular disulfide bonds. Erv1 is an FAD-binding sulfhydryl oxidase that activates Mia40 by re-oxidation, but the process how Erv1 itself is re-oxidized has been poorly understood. Here, I show that Erv1 interacts with cytochrome c which provides a functional link between the mitochondrial disulfide relay system and the respiratory chain. This mechanism not only increases the efficiency of mitochondrial inport by the re-oxidation of Erv1 and Mia40 but also prevents the formation of deleterious hydrogen peroxide within the intermembrane space. Thus, the miochondrial disulfide relay system is, analogous to that of the bacterial periplasm, connected to the electron transport chain of the inner membrane, which possibly allows an oxygen-dependend regulation of mitochondrial import rates. In addition, I modeled the structure of Erv1 on the basis of the Saccharomyces cerevisiae Erv2 crystal structure in order to gain insight into the molecular mechanism of Erv1. According to the high degree of sequence homologies, various characteristics found for Erv2 are also valid for Erv1. Finally, I propose a regulatory function of the disulfide relay system on the respiratory chain. The disulfide relay system senses the molecular oxygen levels in mitochondria and, thus, is able to adapt respiratory chain activity in order to prevent wastage of NADH and production of ROS. Die Proteine des mitochondrialen Intermembranraums werden normalerweise im Kern kodiert und im Zytosol synthetisiert. Eine Gruppe kleiner Intermembranraumproteine besitzen keine mitochondrialen Zielführungssequenzen, sondern werden in einer redoxabhängigen Reaktion, die auf zwei Komponenten beruht, importiert: Mia40 und Erv1. Diese Proteine begründen das mitochondriale Disulfidbrücken-Transfer-System. Mia40 agiert als Importrezeptor im Intermembranraum und bindet über transiente Disulfidbrücken an seine Substratproteine. Erv1 is eine FAD-bindende Sulfhydryloxidase, die Mia40 mittels Oxidation reaktiviert. Wie Erv1 selbst durch Oxidation reaktiviert wird, ist nur wenig verstanden. Hier zeige ich, dass Erv1 mit Cytochrom c interagiert. Dadurch wird ein funktionelle Verbindung zwischen dem Disulfidbrücken-Transfer-System und der Atmungskette geschaffen. Dieser Mechanismus erhöht die Effizienz des mitochondrialen Imports durch Reoxidation von Erv1 und Mia40. Darüberhinaus verhindert es die Bildung von hochreaktivem Wasserstoffperoxid im Intermembranraum. Dadurch ist das Disulfidbrücken-Transfer-System ähnlich dem System im bakteriellen Periplasma mit der Atmungskette der Mitochondrien verbunden, was die Möglichkeit einer Sauerstoff-abhängigen Regulation mitochondrialen Imports eröffnet. Darüberhinaus modellierte ich die 3D-Struktur von Erv1 auf der Basis der Erv2-Struktur aus Hefe. Damit wollte ich einen tieferen Einblick in die molekularen Mechanismen von Erv1 erlangen. Einige Eigenschaften, die von Erv2 bekannt waren, konnte ich auch für Erv1 zeigen. Letztlich möchte ich eine regulatorische Funktion von Erv1 auf die Aktivität der Atmungskette vorschlagen. So wird die Konzentration molekularen Sauerstoffs von Erv1 gemessen und die Aktivität der Atmungskette angepasst, um NADH zu sparen und eine ROS Produktion zu vermeiden.

Proteins of the intermembrane space of mitochondria are generally encoded by nuclear genes that are synthesized in the cytosol. A group of small intermembrane space proteins lack classical mitochondrial targeting sequences, but these proteins are imported in an oxidation-driven reaction that relies on the activity of two components, Mia40 and Erv1. Both proteins constitute the mitochondrial disulfide relay system. Mia40 functions as an import receptor that interacts with incoming polypeptides via transient, intermolecular disulfide bonds. Erv1 is an FAD-binding sulfhydryl oxidase that activates Mia40 by re-oxidation, but the process how Erv1 itself is re-oxidized has been poorly understood. Here, I show that Erv1 interacts with cytochrome c which provides a functional link between the mitochondrial disulfide relay system and the respiratory chain. This mechanism not only increases the efficiency of mitochondrial inport by the re-oxidation of Erv1 and Mia40 but also prevents the formation of deleterious hydrogen peroxide within the intermembrane space. Thus, the miochondrial disulfide relay system is, analogous to that of the bacterial periplasm, connected to the electron transport chain of the inner membrane, which possibly allows an oxygen-dependend regulation of mitochondrial import rates. In addition, I modeled the structure of Erv1 on the basis of the Saccharomyces cerevisiae Erv2 crystal structure in order to gain insight into the molecular mechanism of Erv1. According to the high degree of sequence homologies, various characteristics found for Erv2 are also valid for Erv1. Finally, I propose a regulatory function of the disulfide relay system on the respiratory chain. The disulfide relay system senses the molecular oxygen levels in mitochondria and, thus, is able to adapt respiratory chain activity in order to prevent wastage of NADH and production of ROS. Die Proteine des mitochondrialen Intermembranraums werden normalerweise im Kern kodiert und im Zytosol synthetisiert. Eine Gruppe kleiner Intermembranraumproteine besitzen keine mitochondrialen Zielführungssequenzen, sondern werden in einer redoxabhängigen Reaktion, die auf zwei Komponenten beruht, importiert: Mia40 und Erv1. Diese Proteine begründen das mitochondriale Disulfidbrücken-Transfer-System. Mia40 agiert als Importrezeptor im Intermembranraum und bindet über transiente Disulfidbrücken an seine Substratproteine. Erv1 is eine FAD-bindende Sulfhydryloxidase, die Mia40 mittels Oxidation reaktiviert. Wie Erv1 selbst durch Oxidation reaktiviert wird, ist nur wenig verstanden. Hier zeige ich, dass Erv1 mit Cytochrom c interagiert. Dadurch wird ein funktionelle Verbindung zwischen dem Disulfidbrücken-Transfer-System und der Atmungskette geschaffen. Dieser Mechanismus erhöht die Effizienz des mitochondrialen Imports durch Reoxidation von Erv1 und Mia40. Darüberhinaus verhindert es die Bildung von hochreaktivem Wasserstoffperoxid im Intermembranraum. Dadurch ist das Disulfidbrücken-Transfer-System ähnlich dem System im bakteriellen Periplasma mit der Atmungskette der Mitochondrien verbunden, was die Möglichkeit einer Sauerstoff-abhängigen Regulation mitochondrialen Imports eröffnet. Darüberhinaus modellierte ich die 3D-Struktur von Erv1 auf der Basis der Erv2-Struktur aus Hefe. Damit wollte ich einen tieferen Einblick in die molekularen Mechanismen von Erv1 erlangen. Einige Eigenschaften, die von Erv2 bekannt waren, konnte ich auch für Erv1 zeigen. Letztlich möchte ich eine regulatorische Funktion von Erv1 auf die Aktivität der Atmungskette vorschlagen. So wird die Konzentration molekularen Sauerstoffs von Erv1 gemessen und die Aktivität der Atmungskette angepasst, um NADH zu sparen und eine ROS Produktion zu vermeiden.

In dieser Arbeit wurden die GTPasen Ran und Rap1b hinsichtlich ihres Reaktionsmechanismus mit Hilfe der trFTIR-Spektroskopie untersucht. Es wurde gefunden, dass Tyrosin 39 bei Ran das angreifende Wasser falsch positioniert. Fehlt Tyrosin 39, wird die intrinsische Hydrolyse beschleunigt; bei der GAP-katalysierten Hydrolyse hat Tyrosin 39 keine Bedeutung. Die Bande von Tyrosin 39 konnte durch Mutationsstudien und Isotopenmarkierung mittels trFTIR identifiziert und der zeitliche Ablauf während der Hydrolyse zugeordnet werden. Es wurden \(^{13}\)C\(^{15}\)N-markierte Aminosäuren mittels auxotropher \(\textit {E. coli}\)-Stämme in M9-Medium in die Proteine eingebaut. Zunächst wurden isolierte Aminosäuren und die von deren Seitenketten abgeleiteten Moleküle IR-spektroskopisch analysiert. Die Technik der Isotopenmarkierung konnte von \(\textit {E. coli}\) auf \(\textit {R. spheroides}\) übertragen werden. Bei Rap1b wurde der Einfluss des "Asparagindaumens" während der \(\it {"off"}\) nach \(\it {"on"}\) Reaktion aufgeklärt.

The plasma membrane of polarized epithelial cells is divided into two separate membrane compartments, the apical and the basolateral domain. Based on their functional specialization the domains are composed of different proteins and lipids. This is maintained by an intracellular machinery that directs newly synthesized material into the correct target membrane. Polypeptides from the apical membrane domain of epithelial cells classically reach their destination by a sequential passage from the ER through the Golgi to the TGN, from where they are sorted into apical transport vesicles. Dependent on their lipid raft affinity apical proteins are segregated into distinct vesicle populations. The investigations are focused on the transport and sorting machinery in apical transport. For this, two model proteins were used, the lipid raft-associated SI and the non-raft-associated LPH. Biochemical approaches and fluorescence microscopy studies identified that SI and LPH traverse endosomal compartments before entering the apical membrane. Furthermore the role of the lectin galectin-3 in LAV and the role of the kinase ALPK-1 for SAV were reported., Die Plasmamembran von polarisierten Epithelzellen besteht aus zwei unterschiedlichen Bereichen, einer apikalen und einer basolateralen Domäne. Aufgrund ihrer spezifischen Funktionen weisen sie eine asymmetrische Verteilung von Lipid- und Proteinkomponenten auf. Dies setzt genaue Sortier- und Transportmechanismen voraus, welche neu synthetisiertes Material zu ihrer korrekten Zielmembran befördern. Polypeptide der apikalen Membran erreichen ihre Zielmembran über den sekretorischen Transportweg vom ER durch den Golgi-Apparat zum TGN, von wo sie in apikale Transportvesikel sortiert werden. Die Einsortierung in verschiedene Vesikelpopulationen erfolgt für apikale Proteine abhängig von ihrer raft-Assoziation. Ziel der Arbeit war die Erforschung der Transport- und Sortiermaschinerie im apikalen Transport. Dafür wurden zwei Modellproteine verwendet, die raft-assoziierte SI und die nicht-raft-assoziierte LPH. Biochemische und konfokalmikroskopische Studien konnten zeigen, dass die SI und LPH auf ihrem Weg zur apikalen Membran endosomale Kompartimente durchqueren. Darüber hinaus konnte die Rolle des Lektins Galektin-3 in LPH-tragenden Vesikeln und die Rolle der ALPK-1-Kinase in SI-tragenden Vesikeln charakterisiert werden.

Xpo1p ist der Transportrezeptor für den Export von Proteinen mit einem Leucin-reichen Kernexportsignal (NES) aus dem Kern. Die Interaktion mit seinem Substrat wird durch die Interaktion mit dem Guaninnukleotid-bindenden Protein Ran reguliert. Die Komplexbildung im Kern und die –Dissoziation im Zytoplasma werden durch Helferproteine unterstützt. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Xpo1p mit einem NES-Substrat und Ran•GTP sowie mit den Helferproteinen Yrb1p und Yrb2p untersucht. Proteinkristalle vom Komplex aus Xpo1p, einem N-terminal verkürztem Yrb1p-Fragment und RanQ69L•GppNHp wurden erhalten und die Struktur des Komplexes aus \(\Delta\)Yrb1p und RanQ69L•GppNHp mittels Röntgenkristallographie charakterisiert. Basierend auf biochemische Untersuchungen wurde ein Modell für den Dissoziationsmechanismus des Xpo1p•NES-Substrat•Ran•GTP-Komplexes durch Yrb1p aufgestellt, bei dem der N-Terminus von Yrb1p eine wichtige Rolle spielt.

Transport of proteins into or across cellular membranes is mediated by the conserved and ubiquitous Sec-machinery. The Sec-homologue in the inner membrane of Escherichia coli is SecYEG. Sec-mediated insertion of numerous membrane proteins is aided by YidC, another protein integral to the inner membrane of Escherichia coli. YidC fulfils in addition the integration of a variety of membrane proteins Sec-independently. It belongs to a conserved but structurally uncharacterised family of proteins important for membrane protein biogenesis and comprises homologues in mitochondria and chloroplasts. By modification of a former crystallisation protocol two-dimensional crystals of SecYEG were grown in presence of the signal sequence peptide of LamB. Recording of structural data by electron cryo-microscopy and calculation of a difference structure comparing a former SecYEG projection structure with the one of SecYEG crystallised in presence of the substrate revealed several new and vacant densities. These hint to signal peptide binding close to the translocation pore and to significant rearrangements in proximity to the lateral exit site for transmembrane domains in SecYEG. The difference structure suggests that dimeric SecYEG is an asymmetric molecule consisting of one active and one inactive SecYEG monomer. Detergent removal from a mixture of purified YidC and lipids produced two-dimensional crystals that were highly dependent on the ionic strength and lipid composition for their growth. Electron cryo-microscopy on the frozen-hydrated crystals and image processing visualised structural details at about 10 Å resolution. Averaging two alternative projection structures in p2 and p121_a symmetry, respectively, yielded essentially the same features. Four YidC monomers form one unit cell (dimensions 82 x 71 Å, included angle 85 ° and 90 °, respectively) and seem to be arranged as two sets of dimers integrated in an anti-parallel fashion into the membrane. An area of low density in the centre of each YidC monomer resembles possibly a constriction of the membrane, which could have particular relevance for the integration of substrate proteins into the lipid bilayer. Der Transport von Proteinen in zelluläre Membranen hinein oder durch diese hindurch wird durch die konservierte und überall anzutreffende Sec-Maschinerie vermittelt. Das Sec-Homolog in der inneren Membran von Escherichia coli ist SecYEG. Der Sec-vermittelte Einbau von vielen Membranproteinen wird unterstützt von YidC, einem weiteren Protein in der inneren Membran von Escherichia coli. YidC führt zusätzlich den Einbau einiger Proteine Sec-unabhängig durch. YidC gehört zu einer konservierten aber strukturell uncharakterisierten Familie von Proteinen, die wichtig für die Biogenese von Membranproteinen sind und hat Homologe in Mitochondrien und Chloroplasten. Durch Modifikation eines früheren Kristallisations-Protokolles wurde zweidimensionale Kristalle von SecYEG in Gegenwart des Signalsequenz-Peptides von LamB gezüchtet. Das Aufnehmen von Strukturdaten mittels Elektronen-Kryomikroskopie und die Berechnung einer Differenzstruktur, welche eine frühere SecYEG-Projektionsstruktur mit der von SecYEG kristallisiert in Gegenwart von Substrat vergleicht, demonstrierte eine Reihe neuer bzw. fehlender Dichten. Diese deuten auf das Binden von Signalpeptid in räumlicher Nähe zur Translokationspore sowie auf signifikante Umlagerungen in der Nähe des lateralen Austrittsortes für Transmembrandomänen in SecYEG hin. Die Differenzstruktur legt nahe, dass dimeres SecYEG ein asymmetrisches Molekül ist, bestehend aus einem aktiven und einem inaktiven SecYEG-Monomer. Detergenzentfernung aus einem Gemisch von gereinigtem YidC und Lipiden brachte zweidimensionale Kristalle hervor, welche bezüglich ihrer Bildung sehr abhängig von Ionenstärke und Lipidkomposition waren. Eine elektronen-kryomikroskopische Untersuchung der in hydratisiertem Zustand gefrorenen Kristalle und Bildverarbeitung machten strukturelle Details mit einer Auflösung von etwa 10 Å sichtbar. Mitteln von Einzelbildern zu zwei alternativen Projektionsstrukturen in p2 bzw. p121_a Symmetrie brachte grundsätzlich gleiche strukturelle Merkmale hervor. Vier YidC-Monomere bilden eine Einheitszelle (Dimensionen 82 x 71 Å, eingeschlossener Winkel 85 ° bzw. 90 °) und scheinen als zwei Dimere vorzuliegen, welche in gegensätzlicher Orientierung in die Membran eingebettet sind. Ein Bereich geringer Dichte im Zentrum eines jeden YidC-Monomers stellt möglicherweise eine Einstülpung der Membran dar, die besondere Bedeutung für den Einbau von Substratproteinen in die Lipid-Doppelschicht haben könnte.

Peroxisomen sind ubiquitär in eukaryontischen Zellen vorkommende Organellen, deren Matrix- und Membranproteine posttranslational importiert werden. Für den gerichteten Import von Proteinen in die Matrix des Organells werden Signalsequenzen (PTS-Sequenzen = \(\underline {\bf{p}}\)eroxisomal \(\underline {\bf {t}}\)argeting \(\underline {\bf {s}}\)ignal) und entsprechende Rezeptoren, sowie ein membranständiges Importomer benötigt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Pex5p-abhängigen Import von PTS1-Matrixproteinen im Vergleich zu dem non-PTS Protein Acyl-CoA-Oxidase. Des Weiteren wurden die drei RING-finger Peroxine Pex2p, Pex10p und Pex12p als Bestandteile des peroxisomalen Importomers näher charakterisiert. Neben der Charakterisierung und Funktionsanalyse bereits bekannter peroxisomaler Proteine ist die Identifizierung noch unbekannter Proteine im Fokus der aktuellen Forschung. Daher wurde in einem weiteren Projekt die Isolierung von Peroxisomen aus humanem Leber- und Nierengewebe für Proteomanalysen etabliert und optimiert.

Peroxisomen sind ubiquitär in eukaryontischen Zellen vorkommende Organellen, deren Matrix- und Membranproteine posttranslational importiert werden. Für den gerichteten Import von Proteinen in die Matrix des Organells werden Signalsequenzen (PTS-Sequenzen = peroxisomal targeting signal) und entsprechende Rezeptoren, sowie ein membranständiges Importomer benötigt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Pex5p-abhängigen Import von PTS1-Matrixproteinen im Vergleich zu dem non-PTS Protein Acyl-CoA-Oxidase. Des Weiteren wurden die drei RING-finger Peroxine Pex2p, Pex10p und Pex12p als Bestandteile des peroxisomalen Importomers näher charakterisiert. Neben der Charakterisierung und Funktionsanalyse bereits bekannter peroxisomaler Proteine ist die Identifizierung noch unbekannter Proteine im Fokus der aktuellen Forschung. Daher wurde in einem weiteren Projekt die Isolierung von Peroxisomen aus humanem Leber- und Nierengewebe für Proteomanalysen etabliert und optimiert.

Ein Hauptanliegen aktueller Forschung ist das generelle Verständnis des Peroxisoms als Organell. Hierbei bildet die Struktur- und Funktionsanalyse bereits identifizierter peroxisomaler Komponenten einen Schwerpunkt in der Untersuchung der Biogenese, Teilung und Vererbung des Organells. Parallel führt die Entwicklung neuer Methoden und Ansätze immer wieder zur Identifizierung von bislang unbekannten peroxisomalen Proteinen. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit stellte die Identifizierung peroxisomaler Interaktionspartner von Pex8p, sowie Untersuchungen eines zielgerichteten Transports dieses Proteins zum Peroxisom dar. Im Weiteren wurde ein bislang unbekanntes 17 kDa Protein über einen revers genetischen Ansatz identifiziert und als peroxisomales Membranprotein charakterisiert. Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die beiden Dynamin-verwandten Proteine Dnm1p und Vps1p die Teilung von Peroxisomen regulieren.

Der posttranslationale Import von im Cytosol synthetisierten Matrixproteinen ist ein wesentlicher Teilschritt der Biogenese von Peroxisomen. Eine zentrale Rolle innerhalb der Importprozesse spielt die Ausbildung eines Multiproteinkomplexes (Importomer) an der peroxisomalen Membran. Für das intraperoxisomale Protein Pex8p aus \(\textit {S. cerevisiae}\) wurde dabei eine Funktion als mechanistisches Verbindungsglied bei der Assemblierung des Importomers postuliert. Zur näheren Charakterisierung der Funktion von Pex8p wurden mutationsgestützte Analysen durchgeführt, deren Ergebnisse auf einen modularen Aufbau des Pex8-Proteins hindeuten. Das integrale Membranprotein Pex15p steht in enger funktioneller Verbindung zu den AAA-Peroxinen Pex1p und Pex6p, die die ATP-abhängige Freisetzung des entladenen Rezeptors für peroxisomale Matrixproteine von der Membran steuern. Die strukturelle Charakterisierung von Pex15p aus \(\textit {S. cerevisiae}\) mit kristallographischen Methoden stand im Mittelpunkt eines zweiten Projektes.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist eine funktionelle Analyse der späten Schritte des peroxisomalen Matrixproteinimports in \(\textit {Saccharomyces cerevisiae}\) durchgeführt worden. Die Hauptaussagen können wie folgt zusammengefasst werden: 1) Bei Deletion oder Inaktivierung der Komponenten des AAA- oder des Pex4p/Pex22p-Komplexes wird der PTS1-Rezeptor Pex5p von Ubc4p an zwei Lysinresten polyubiquitinyliert und anschließend im Proteasom degradiert. 2) Mittels der Etablierung eines \(\textit {in vitro}\) Export Systems konnte den AAA-Peroxinen Pex1p und Pex6p die Funktion als Dislokasen für den ATP-abhängigen Export von Pex5p zugewiesen werden. 3) Für Pex4p konnte Pex5p als Substrat für eine Monoubiquitinylierung identifiziert werden. 4) Der Energieabhängigkeit des peroxisomalen Proteinimports kann letztendlich in zwei Schritte differenziert werden: Pex4p-abhängige Rezeptor-Ubiquitinylierung und AAA-abhängige Dislokation.

Secondary plastids of chromalveolates are, in most cases, bound by four surrounding membranes, hence revealing their (secondary) symbiogenetic origin from an engulfed formerly free-living, phototrophic eukaryote (an ancestral rhodophyte). In the cryptophytes, which possess the most primordial plastids of this group, the nucleomorph (a remnant of the rhodophytic nucleus) bears additional witness to this process. One major task in establishing secondary symbiosis was the massive transfer of genetic material from the symbionts' genomes to the host nucleus. This was subsequently followed by a loss of the original loci, and accounted ex ante for the evolution of adequate mechanisms for a re-import of the encoded proteins. Present models merely explain the transport processes at the outermost and innermost of the four membranes (see above). The underling mechanisms at the remaining membranes, especially the second outermost (the periplastid membrane, PPM) continue to be elusive. Starting with Gt_ORF201 (homolog to Der1p) from the model cryptophyte Guillardia theta, a number of nucleomorph-encoded factors were identified with homology to components of the ER-associated degradation system (ERAD) from Saccharomyces cerevisiae, the core of which composes a machinery for the elimination (dislocation) of misfolded proteins from the ER and their subsequental degradation at the proteasome. These were complimented by nucleomorph-encoded homologues of Hrd1p (Gt_ORF477), the AAA-ATPase Cdc48p (Gt_sCdc48) and its cofactor Ufd1p (Gt_sUfd1). Exemplarily, ORF201 was shown to be a functional ortholog to Der1p, most likely located in the periplastid membrane of Guillardia theta. In exhaustive genome analyses of previously sequenced chromalveolates (amongst others the genomes of the heterokont Phaeodactylum tricornutum and the apicomplexan human pathogen Plasmodium falciparum), a conservation of the identified symbiont-specific factors was shown (as being nuclear-encoded pre-proteins with functional symbiont-specific targeting signals in these cases). Considering that the symbiont-specific "ERAD"-factors exist in parallel to the host-specific ERAD-machinery in all investigated organisms for protein degradation, and that these factors are exclusively associated with the pre-degradative dislocation of ERAD-substrates from the ER, a novel ERAD-independent role is suggested: The import of nucleus-encoded symbiont- and plastid-localised proteins through the periplastid membrane of four-membrane bound plastids of chromalveolates. Based on current knowledge of ERAD associated substrate dislocation, this thesis provides the first experimentally testable mechanistic model for protein transport across the PPM., Die sekundären Plastiden der Chromalveolaten sind von drei oder vier Hüll¬membranen umgeben. Sie lassen damit ihren (sekundär) symbiogenetischen Ursprung aus einer ehemals frei lebenden phototrophen Eucyte (einer ancestra¬len Rhodophyte) erkennen. In Cryptophyten, den Vertretern mit den ursprüng¬lichsten Plastiden dieser Gruppe, zeugt der remanente Nucleus im periplasti¬dären Kompartiment (PPC) des Symbionten, das Nucleomorph, zusätzlich von dieser Herkunft. Ein wesentlicher Bestandteil in der Etablierung der sekundären Symbiose war der Transfer von genetischem Material von den Genomen des Symbionten in das Genom des Wirtes und dessen subsequente Eliminierung am Ursprungs¬lokus. Dies jedoch setzte die Entwicklung geeigneter Mechanismen zum Reim¬port der nun nucleuscodierten Proteine voraus. Konkrete Hinweise auf die Natur dieser Mechanismen gibt es nur von der äußersten bzw. innersten der vier Hüllmembranen der Plastide. Für die weiteren Transportvorgänge der Pro¬teine, vor allem über die zweite, periplastidäre Membran (PPM), werden bislang nur alternative Modelle kontrovers diskutiert. Ausgehend von der Analyse des nucleomophcodierten Proteins Gt_ORF201 der Cryptophyte Guillardia theta, wurden eine Reihe von Faktoren identifiziert, die Homologien zu Komponenten des ER-assoziierten Degradations Systems (ERAD) aus Saccharomyces cerevisiae aufweisen, deren Kern eine Maschinerie zur Dislokation missgefalteter sekretorischer Proteine aus dem ER bildet. Dies waren u.a. Homologe zu den Membranproteinen Der1p und Hrd1p, zur ATPase Cdc48p und ein Homolog zum Cdc48-Cofaktor Ufd1p. Exemplarisch wurde ge¬zeigt, dass Gt_ORF201 funktionell ortholog zu seinem Homolog Der1p aus Hefe ist und sich in Guillardia theta in der periplastidären Membran des Symbionten befindet. Durch eingehende Datenbank Analysen bereits vollständig sequenzierter Chromalveolatengenome (u.a. von Phaeodactylum tricornutum, Plasmodium fal¬ciparum) wurde eine Konservation der identifizierten symbiontspezifischen Fak¬toren (hier im Nucleus als Präprotein mit PPC/PPM-relevanter Zielsteuerungs¬sequenz codiert) innerhalb der Gruppe der Chromalveolaten gezeigt. Da das symbiontische "ERAD-System" in allen untersuchten Organismen parallel zur ERAD-Maschinerie des Wirtes existiert, und die homologen Fak¬toren in Saccharomyces cerevisiae vornehmlich an den prädegradativen Prozes¬sen der Substratdislokation aus dem ER beteiligt sind, wurde für die symbion¬tischen Faktoren eine neue, ERAD-unabhängige Funktion beim Transport nuc¬leuscodierter (peri-) plastidärer Präproteine über die PPM postuliert. Basierend auf den Prinzipien der Substratdislokation in ERAD wurde in dieser Arbeit erstmalig ein experimentell nachprüfbares Modell für den Präpro¬teinimport an der periplastidären Membran erarbeitet.

Der posttranslationale Import von im Cytosol synthetisierten Matrixproteinen ist ein wesentlicher Teilschritt der Biogenese von Peroxisomen. Eine zentrale Rolle innerhalb der Importprozesse spielt die Ausbildung eines Multiproteinkomplexes (Importomer) an der peroxisomalen Membran. Für das intraperoxisomale Protein Pex8p aus S. cerevisiae wurde dabei eine Funktion als mechanistisches Verbindungsglied bei der Assemblierung des Importomers postuliert. Zur näheren Charakterisierung der Funktion von Pex8p wurden mutationsgestützte Analysen durchgeführt, deren Ergebnisse auf einen modularen Aufbau des Pex8-Proteins hindeuten. Das integrale Membranprotein Pex15p steht in enger funktioneller Verbindung zu den AAA-Peroxinen Pex1p und Pex6p, die die ATP-abhängige Freisetzung des entladenen Rezeptors für peroxisomale Matrixproteine von der Membran steuern. Die strukturelle Charakterisierung von Pex15p aus S. cerevisiae mit kristallographischen Methoden stand im Mittelpunkt eines zweiten Projektes.

Ein Hauptanliegen aktueller Forschung ist das generelle Verständnis des Peroxisoms als Organell. Hierbei bildet die Struktur- und Funktionsanalyse bereits identifizierter peroxisomaler Komponenten einen Schwerpunkt in der Untersuchung der Biogenese, Teilung und Vererbung des Organells. Parallel führt die Entwicklung neuer Methoden und Ansätze immer wieder zur Identifizierung von bislang unbekannten peroxisomalen Proteinen. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit stellte die Identifizierung peroxisomaler Interaktionspartner von Pex8p, sowie Untersuchungen eines zielgerichteten Transports dieses Proteins zum Peroxisom dar. Im Weiteren wurde ein bislang unbekanntes 17 kDa Protein über einen revers genetischen Ansatz identifiziert und als peroxisomales Membranprotein charakterisiert. Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die beiden Dynamin-verwandten Proteine Dnm1p und Vps1p die Teilung von Peroxisomen regulieren.

In dieser Arbeit wurde über Sequenzvergleiche ein mögliches humanes Ortholog zu \(\it Yl\)PEX23 identifiziert. Subzelluläre Lokalisationsstudien ergaben eine hauptsächlich cytosolische Verteilung von \(\it Hs\)PEX23. In humanen Fibroblasten wurde nach Überexpression von \(\it Hs\)PEX23 kein Effekt auf die Peroxisomenbiogenese beobachtet. Bei Expression in \(\textit {S. cerevisiae}\) zeigten sich eine peroxisomale Lokalisation von \(\it Hs\)PEX23 sowie die Bildung von Peroxisomenclustern. Weiterhin wurde eine stabile Expressionszelllinie für \(\it Hs\)PEX14-ProtA hergestellt, die zur Isolierung nativer Proteinkomplexe verwendet wurde. Es konnten zwei unterschiedliche Komplexe identifiziert werden. Über massenspektrometrische Analysen konnten 141 mit \(\it Hs\)PEX14 eluierte Proteine bestimmt werden. Darunter befanden sich insgesamt 8 der bislang bekannten Peroxine. Außerdem konnten Proteine mit unbekannter Funktion und Lokalisation identifiziert werden. Zusätzlich ergaben sich Hinweise, auf ein ubiquitiniertes \(\it Hs\)PEX5 an der peroxisomalen Membran.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist eine funktionelle Analyse der späten Schritte des peroxisomalen Matrixproteinimports in Saccharomyces cerevisiae durchgeführt worden. Die Hauptaussagen können wie folgt zusammengefasst werden: 1) Bei Deletion oder Inaktivierung der Komponenten des AAA- oder des Pex4p/Pex22p-Komplexes wird der PTS1-Rezeptor Pex5p von Ubc4p an zwei Lysinresten polyubiquitinyliert und anschließend im Proteasom degradiert. 2) Mittels der Etablierung eines in vitro Export Systems konnte den AAA-Peroxinen Pex1p und Pex6p die Funktion als Dislokasen für den ATP-abhängigen Export von Pex5p zugewiesen werden. 3) Für Pex4p konnte Pex5p als Substrat für eine Monoubiquitinylierung identifiziert werden. 4) Der Energieabhängigkeit des peroxisomalen Proteinimports kann letztendlich in zwei Schritte differenziert werden: Pex4p-abhängige Rezeptor-Ubiquitinylierung und AAA-abhängige Dislokation.

In der vorliegenden Arbeit wurden detaillierte Analysen der Lipidbindeeigenschaft des peroxisomalen Protein-Importrezeptors Pex5p unter den Gesichtspunkten der Lipidspezifität, der Lipid-Bindestellen in Pex5p, sowie der Art der Anbindung von Pex5p an Membranen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass das lösliche Protein mit Lipiden interagiert (\(\textit {in vivo}\) und \(\textit {in vitro}\)), wobei die Lipidassoziation die Degradation durch Proteasen verhinderte. Durch \(\textit {in vitro}\) Untersuchungen wurden zwei unabhängige Lipid-Bindestellen in H\(\it {s}\)Pex5p identifiziert. \(\textit {In vitro}\) verursachte deren Mutation eine Schwächung der Lipidinteraktion, \(\textit {in vivo}\) wurde der Katalase Import gestört. Phosphatidat hatte einen positiven Einfluss auf die Pex5p-Lipidinteraktion. Der Konsensus für die Pex5p/Pex14p Interaktion wurde zudem weiter verfeinert. Aus den erhaltenen Daten wurde abschließend ein Modell zum Proteinimport in Peroxisomen entwickelt, indem Pex5p eine aktive Rolle als porenbildendes Protein übernimmt.

Für die AAA-Peroxine Pex1p und Pex6p der Hefe \(\textit {S.cerevisiae}\) wurde eine Beteiligung am Import peroxisomaler Matrixproteine postuliert. Insbesondere sollen sie zusammen mit Pex15p, dem Membrananker von Pex6p, an der ATP-abhängigen Freisetzung der Importrezeptoren beteiligt sein. Aufgrund der postulierten Funktion wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Pex1p, Pex6p und Pex15p mit der peroxisomalen Importmaschinerie assoziiert sind. Zur Untersuchung einer Beteiligung an den peroxisomalen Importprozessen und zur Identifizierung weiterer Interaktionspartner von Pex1p, Pex6p und Pex15p wurden native lösliche und membrangebundene peroxin-haltige Proteinkomplexe isoliert und in Bezug auf Zusammensetzung und molekulare Größe analysiert. Desweiteren wurde in dieser Arbeit die bereits bekannte Interaktion zwischen Pex1p und Pex6p mittels Koimmunopräzipitation und Two-Hybrid-Analyse genauer charakterisiert.

[no abstract]

Das Cytoplasma Gram-negativer Bakterien ist von einer Zellhülle umgeben, die sich aus der Innenmembran (Cytoplasmamembran), der Außenmembran und dem dazwischen liegenden Periplasma zusammensetzt. Proteine, die in einem dieser Kompartimente lokalisiert sind, müssen nach ihrer Synthese im Cytoplasma spezifisch an ihren Wirkungsort transportiert werden. Der posttranslationale Transport einiger dieser Proteine wird durch das twin arginine translocation (Tat)-System vermittelt, das aus den drei Innenmembranproteinen TatA, TatB und TatC aufgebaut ist. Substrate des Tat-Systems besitzen in ihrer N-terminalen Signalsequenz das Konsensusmotif S-R-R-x-F-L-K, dessen Arginin-Paar Namensgeber dieses Transportsystems ist. Eine Besonderheit des Tat-Systems stellt dessen Fähigkeit dar, Proteine im vollständig gefalteten Zustand zu transportieren. Tat-Substrate falten sich bereits vor ihrem Transport, da sie entweder Kofaktoren benötigen, die im Cytoplasma eingebaut werden, als Oligomere transportiert werden, oder vermutlich eine sehr schnellen Faltungskinetik aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte Einblick in den Mechanismus des Tat-abhängigen Transportes in Escherichia coli gewonnen werden. Dazu kam das Tat-abhängige Fusionsprotein TorA-PhoA zum Einsatz, das sich aus der Signalsequenz des Tat-Substrates Trimethylamin-N-Oxid-Reduktase (TorA) und dem reifen Teil der alkalischen Phosphatase (PhoA) aus Escherichia coli zusammensetzt. In einer früheren Studie konnte gezeigt werden, dass die Bildung der beiden intramolekularen Disulfidbrücken im reifen Teil von TorA-PhoA, und somit das Erlangen der nativen Faltung, Voraussetzung für den Tat-abhängigen Transport in Escherichia coli-Zellen war. In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, diese Ergebnisse in einem gekoppelten in vitro-Transkriptions/Translations-System zu reproduzieren. TorA-PhoA wurde in vitro synthetisiert und Tat-abhängig in Innenmembranvesikel aus Escherichia coli transportiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass im., The twin-arginine translocation (Tat) pathway is a protein transport system of bacteria, archaea and chloroplasts. In E. coli the Tat system comprise three functionally distinct membrane proteins, the single-span TatA and TatB, and the polytopic TatC. Characteristic for the Tat signal peptide is the consensus motif S-R-R-x-F-L-K in the n-region where x is a polar amino acid. The highly conserved double-arginine pair gave grounds to the term twin-arginine translocase (Tat). The Tat pathway possesses the ability to export proteins in a fully folded conformation. Pretranslocational folding results from the cytosolic incorporation of cofactors and assembly into oligomeric complexes or from rapid folding kinetics. Consistent with previous in vivo data, we show here that the model Tat substrate TorA-PhoA is translocated by the TatABC translocase of E. coli inner membrane vesicles only if the PhoA moiety was allowed to fold by disulfide bond formation. TatABC-specific membrane binding was independent of the folding state of TorA-PhoA. Site-specific cross-linking revealed that unfolded TorA-PhoA, although it physically associates with the Tat translocase of the vesicles, hardly interacts with the TatBC receptor site. Some of the functionally targeted TorA-PhoA precursor was not completely translocated into the lumen of the vesicles but accumulated in a partially protease-protected membrane environment. The translocational arrest occurred after the initial binding of folded TorA-PhoA to the TatBC receptor site, but prior to processing by the signal peptidase. Moreover, the transport intermediate required TatA, but no proton-motive force to form, and was arrested in close vicinity to TatA. These results are consistent with some degree of quality control by TatBC and a recruitment of TatA to a folded substrate that has functionally engaged the twin-arginine translocase but not yet entered the energy-dependent step(s) of translocation.

The structure and functions of lipid rafts and the mechanisms of intracellular membrane trafficking are major topics in current cell biological research. Rafts have been proposed to act as sorting platforms during biosynthetic transport, especially along pathways that deliver proteins to the apical membrane of polarised cells. Based on this, the aim of this work was to contribute to the understanding of apical sorting in epithelial cells. The study of how lipid rafts are structured has been hampered by the scarcity of techniques for their purification. Rafts are thought to be partially resistant to solubilisation by mild detergents, which has made the isolation of detergent-resistant membranes (DRMs) the primary method to characterise them biochemically. While a growing number of detergents is being used to prepare DRMs, it is not clear what can be inferred about the native structure of cell membranes from the composition of different DRMs. This issue was addressed by an analysis of DRMs prepared with a variety of mild detergents. The protein and lipid content of different DRMs from two cell lines, Madin-Darby canine kidney (MDCK) and Jurkat cells, was compared. It was shown that the detergents differed considerably in their ability to selectively solubilise membrane proteins and lipids. These results make it unlikely that different DRMs reflect the same underlying principle of membrane organisation. Another obstacle for understanding apical sorting is that the evidence implicating certain proteins in this process has come from various disparate approaches. It would be helpful to re-examine the putative components of the apical sorting machinery in a single experimental system. To this end, a retroviral system for RNA interference (RNAi) in MDCK cells was established. Efficient suppression of thirteen genes was achieved by retroviral co-expression of short hairpin RNAs and a selectable marker. In addition, the system was extended to simultaneously target two genes, giving rise to double knockdowns.Retroviral RNAi was applied to deplete proteins implicated in apical sorting. Surprisingly, none of the knockdowns analysed caused defects in surface delivery of influenza virus hemagglutinin, a common marker protein for apical transport. Therefore, none of the proteins examined is absolutely required for transport to the apical membrane of MDCK cells. Cells may adapt to the depletion of proteins involved in membrane trafficking by activating alternative pathways. To avoid such adaptation, a visual transport assay was established. It is based on the adenoviral expression of fluorescent marker proteins whose surface transport can be followed microscopically as soon as RNAi has become effective. With this assay, it should now be possible to screen the knockdowns for defects in surface transport. Taken together, this work has provided a number of experimental tools for the study of membrane trafficking in epithelial cells. First, the biochemical analysis of DRMs highlighted that DRMs obtained with different detergents are unlikely to correspond to distinct types of membrane microdomains in cell membranes. Second, the retroviral RNAi system should be valuable for defining the function of proteins, not only in membrane transport, but also in processes like epithelial polarisation. Third, the visual assay for monitoring the surface transport of adenovirally expressed marker proteins should be suitable to detect defects in polarised sorting.

Das 1995 entdeckte Plasmodium falciparum Zytoadhärenz-Molekül PfEmp1 wird auf der Oberfläche von infizierten Erythrozyten exponiert und ist ein wichtiger Pathogenitätsfaktor in Malaria. PfEmp1-Proteine bilden eine hoch-variable Antigenfamilie, die dem intraerythrozytären Parasiten die Immunevasion ermöglicht. In der allgemeinen Vorstellung wird PfEmp1, das eine zum C-Terminus proximale hydrophobe Region besitzt, als Typ 1-Membranprotein synthetisiert und als solches in die Erythrozytenmembran sezerniert. Dieses Modell setzt einen Protein-Sekretionsapparat, wie er in allen kernhaltigen eukaryoten Zellen vorhanden ist, in der Wirtszelle voraus. Erythrozyten sind jedoch weder zu der Synthese noch zu dem Transport von Proteinen fähig. Dieses Problem wurde in dem vorliegenden Projekt zum Anlass genommen, das Modell einer genauen biochemischen Überprüfung zu unterziehen. Das Protein konnte nach Behandlung von infizierten Erythrozyten mit dem Sekretions-Inhibitor BFA im Parasiten akkumuliert werden und ließ sich dort mit alkalischem Karbonatpuffer im Gegensatz zu einem integralen Marker-Membranprotein extrahieren. Es wurde ein Verfahren zur Untersuchung von Transportvesikeln entwickelt, jedoch konnte die Assoziation von PfEmp1 mit solchen nicht gezeigt werden. Stattdessen war das Protein, einmal in die Wirtszelle sezerniert, unter Bedingungen, unter denen integrale Membranproteine unlöslich sind, löslich. PfEmp1-Moleküle, die in die Erythrozytenmembran inseriert waren, konnten mit Harnstoff extrahiert werden. Integrale Marker-Membranproteine waren resistent gegen die Harnstoffbehandlung, und in Saccharose-Dichtegradienten konnte Oberflächen-PfEmp1 nach Harnstoffbehandlung von Membranproteinen des Erythrozyten getrennt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeichnen ein neues Bild von der Membranassoziation von PfEmp1 und deuten auf einen gänzlich verschiedenen Mechanismus der Sekretion und der Membraninsertion hin. Das Protein wird vermutlich als peripheres Membranprotein oder als Teil eines Komplexes sezerniert und über einen unbekannten Mechanismus, der die spezifische Interaktion von PfEmp1 mit Protein-Bindungspartnern impliziert, in die Erythrozytenmembran inseriert. Dort steht PfEmp1 im Verband mit anderen Proteinen, ohne selber direkt mit Lipiden wechselzuwirken., The Plasmodium falciparum cytoadherence factor PfEmp1 is expressed on the surface of red blood cells where it interacts with various endothelial receptors leading to the sequestration of infected red blood cells in blood capillaries. In addition, PfEmp1 undergoes antigenic variation giving rise to the generation of irrelevant antibodies in the immune response. Thus PfEmp1 is a major factor which contributes to the severe pathology of malaria. PfEmp1 possesses a hydrophobic segment in the vicinity of the carboxy end which according to a commonly accepted view constitutes a transmembrane helix anchoring the protein into the erythrocyte membrane. This model provides a protein secretion machinery in red blood cells, which by themselves are incapable of the synthesis and trafficking of proteins. In this thesis the transport model on PfEmp1 was issued by a precise biochemical examination resulting in to the general view on PfEmp1 trafficking conflicting data that suggest a novel model on synthesis and transport of the protein. After treatment of infected cells with the protein secretion blocking agent brefeldin A PfEmp1 was retained in the parasite. In contrast to integral membrane proteins the protein could be extracted with alkaline carbonate buffer, typical of peripheral membrane proteins. Another goal of this thesis was the development of an assay that allows to investigate transport vesicles such as suggested to be involved in the secretion of PfEmp1. No association of the protein with vesicles was found. Once the protein had been secreted into the host cell it could be extracted under conditions that left integral membrane proteins insoluble. PfEmp1 of the red cell membrane could be extracted with urea which integral membrane proteins of the red cell membrane resisted. Further, PfEmp1 could be separated from these marker membrane proteins by density gradient centrifugation after urea treatment. The results of this thesis imply a novel picture of the membrane association of PfEmp1. The protein presumably becomes secreted as a peripheral membrane protein or as part of a protein complex. By an unknown mechanism on the basis of protein interaction the protein is targeted to the red cell surface where it is inserted into the membrane keeping the hydrophobic segment of the protein bound to proteins.

Peroxisomen sind ubiquitär in Eukaryonten vorkommende Organellen, deren Proteine posttranslational importiert werden. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung des peripheren peroxisomalen Membranproteins \(\it Sc\)Pex17p aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae, das eine essentielle Rolle beim Matrixprotein-Import spielt. Das zentrale Thema dieser Arbeit ist die Kartierung des Peroxins hinsichtlich der funktionell relevanten Bereiche des Proteins sowie der Bindestellen zu anderen Peroxinen wie z.B. Pex14p oder Pex19p. Dazu wurden 13 verschiede Deletionen des 199 Aminosäure umfassenden Proteins untersucht. Darüber hinaus wurden mit Hilfe affinitätschromatographischer Methoden Pex17p enthaltende Proteinkomplexe aus Hefe isoliert. In diesen Komplexen wurden andere Peroxine wie Pex5p, Pex13p und Pex3p identifiziert.