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Les plastiques sont omniprésents dans l’environnement où ils sont retrouvés de manière ubiquitaire dans les eaux, les sols et l’air et à différentes tailles, allant des plastiques macroscopiques aux dimensions nanométriques. La voie d’exposition majeure aux plastiques est via l’ingestion. Or, il a été démontré que les particules de taille inférieure à 150 nm peuvent traverser le tractus gastro-intestinal. Pourtant, l’impact sur la santé humaine de ces nanoplastiques n’est à ce jour pas démontré. C’est pour cela que dans cette étude, des modèles d’épithélium intestinal humain ont été utilisés pour tester la toxicité de nanoparticules de polystyrène, une catégorie de plastique largement présente dans l’environnement. Des modèles d’épithélium en co-culture ont été utilisés, composés d’entérocytes Caco2-LV-Nod2 WT ou Caco2-LV-Nod21007fs et des cellules sécrétrices de mucus HT29-MTX. Ainsi, un modèle d’épithélium sain et un modèle d’épithélium comportant des cellules porteuses d’un gène associé à la maladie de Crohn ont été utilisés. La maladie de Crohn est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif qui est favorisée par des facteurs environnementaux. Des tests pour évaluer la toxicité de ces nanoplastiques ont été effectués afin de déterminer l’impact de ces nanoparticules sur la santé humaine : l’évaluation de la cytotoxicité, la mise en évidence d’espèces réactives de l’oxygène et de marqueurs de l’inflammation et des tests de génotoxicité. Cette étude fournit des informations sur la toxicité des nanoparticules de polystyrène sur les cellules de l’intestin humain, qui sont utiles pour évaluer le risque de ces nanoparticules chez l’homme.

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanocrystals with exceptional optical properties, which make them particularly attractive in optoelectronic fields and for biomedical applications. However, during their life cycle, the aging of QDs can lead to the degradation of these compounds, inducing the release of toxic elements. Even if toxicity studies on indium-based QDs are still limited, they show a lower intrinsic toxicity in comparison to the heavy metal containing Cd-based QDs. In this context, our laboratory synthetizes different InP QDs with different shell designs, following a safer by design approach, with the aim of producing less toxic QDs with better optical properties. These QDs are composed of a InZnP/Zn(Se,S) core/shell structure which is covered or not by a thick or a thin additional ZnS layer. In this study, primary human keratinocytes which come from breast surgeries, were exposed to these QDs, either pristine or after simulating environmental weathering. First, the physico-chemical transformations of QDs during aging are characterized. Significant photophysical and structural modifications are highlighted and transformation products are identified. However, the results show that these physico-chemical transformations are slowed down by the presence of a double shell, especially when it is thick. Then, the evaluation of QDs toxicity are performed and new assays are developed via high content screening (HCS) on an automated microscope. While pristine QDs were relatively stable and not very toxic to cells, it was not true for their degradation products. Exposure of cells to aged QDs demonstrated high toxicity at low concentrations and modifyed the expression of some genes and proteins essential for cellular homeostasis. These results show that new generations of QDs are safer. However, it’s important to keep improving their photostability since their dissolution and the release of toxic elements at the end of their life are still inevitable., Les quantum dots (QD) sont des nanocristaux semi-conducteurs fluorescents aux propriétés optiques exceptionnelles, ce qui les rend particulièrement attractifs dans les domaines de l’optoélectronique et pour les applications biomédicales. Cependant, au cours de leur cycle de vie, le vieillissement des QDs peut conduire à la dégradation de ces composés, induisant la libération d'éléments toxiques. Même si les études de toxicité sur les QDs à base d'indium sont peu nombreuses, certaines révèlent une toxicité intrinsèque plus faible que les QDs contenant des métaux lourds comme le Cd. Dans ce contexte, notre laboratoire synthétise différents QDs d’InP recouverts de coquilles, conçus par une approche « safer by design », dans le but de produire des QDs moins toxiques avec de meilleures propriétés optiques. Ces QDs sont constitués d'une structure cœur/coquille de InZnP/Zn (Se,S) qui est recouverte, ou non, d'une couche additionnelle de ZnS, épaisse ou mince. Dans cette étude, des kératinocytes primaires humains, issus de chirurgies mammaires, sont exposés aux QDs, après synthèse ou après vieillissement environnemental simulé. Dans un premier temps, les transformations physico-chimiques des QDs au cours du vieillissement sont caractérisées et mettent en évidence d’importantes modifications photophysiques et structurales ainsi que la formation de produits de transformation. Néanmoins, les résultats montrent que les transformations physico-chimiques des QDs sont ralenties par la présence de la double coquille, notamment lorsqu’elle est épaisse. Dans un second temps, l’évaluation de la toxicité des QDs est effectuée et de nouveaux tests sont dévelopés en criblage à haut contenu (HCS) sur un microscope automatisé. Alors que les QDs non vieillis se sont révélés relativement stables et peu toxiques pour les cellules, il n’en fût pas de même pour leurs produits de dégradation. L’exposition des cellules aux QDs vieillis a mis en évidence une forte toxicité à faibles concentrations, modifiant l’expression de certains gènes et protéines essentiels à l’homéostasie cellulaire. Ces résultats montrent que les nouvelles générations de QDs sont plus sûres. Cependant, il est important de continuer à améliorer leur photostabilité puisque leur dissolution et le relargage d’éléments toxiques en fin de vie sont inévitables pour le moment.

Since their discovery in the 1980s, quantum dots or fluorescent nanocrystals of semiconductor materials have attracted a lot of attention thanks to their exceptional photophysical properties easily scalable according to their sizes and compositions. First to be discovered, binary quantum dots like CdS, CdSe, and PbS are the most studied for potential optoelectronic applications in LEDs or photovoltaics. It was not until 1998 that the the first biomedical applications of CdSe/CdS and CdSe/ZnS core/shell quantum dots were used in vitro as biological probes. Although these QDs have excellent optoelectronic properties, they contain very toxic heavy metals. The toxicity of these binary compounds has been demonstrated both on cells (cytotoxicity) and on DNA (genotoxicity). Their application in electronic components is restricted by the European directive RoHS (Restrictions of hazardous substances). It is therefore necessary to replace these toxic heavy metals with less toxic or non-toxic elements if they are to be used biological probes. Ternary quantum dots containing copper (CuInS2) or silver (AgInS2) as well as the binary compound Ag2S are promising alternatives that can cover emission ranges from the visible to the infrared region. This thesis describes synthesis methods devised to obtain quantum dots of CuInS2, AgInS2 (visible emission) and Ag2S (infrared emission) directly in water and the possible applications of these compounds as biological probes and for biomedical imaging., Depuis leurs découvertes dans les années 1980, les quantum dots ou nanocristaux fluorescents de matériaux semi-conducteurs ont attiré beaucoup d’attention grâce à leurs propriétés photophysiques exceptionnelles facilement modulables en fonction de leurs tailles et leurs compositions. Premiers à être découverts, les quantum dots binaires comme le CdS, CdSe, et PbS sont les plus étudiés pour les applications optoélectroniques comme dans les LEDs ou le photovoltaïque. Il faudra attendre jusqu’à 1998 pour démontrer les premières applications biomédicales des QDs de CdSe/CdS et CdSe/ZnS utilisés in vitro en tant que sondes biologiques. Bien que ces QDs présentent d’excellentes propriétés optoélectroniques, ils contiennent des métaux lourds très toxiques. La toxicité de ces composés binaires a été démontrée autant sur les cellules (cytotoxicité) que sur l’ADN (génotoxicité). Leur application dans les composants électroniques est restreinte par la directive européenne RoHS (Restrictions of hazardous substances). Il est donc nécessaire de remplacer ces métaux lourds toxiques par des éléments moins toxiques ou non-toxiques si l’on souhaite développer des sondes biocompatibles. Les quantum dots ternaires contenant du cuivre (CuInS2) ou de l’argent (AgInS2) ainsi que le composé binaire Ag2S sont des alternatives prometteuses qui permettent de couvrir des gammes d’émission allant du visible à l’infrarouge. Cette thèse décrit des méthodes de synthèse permettant d’obtenir des quantum dots de CuInS2, AgInS2 (émission visible) et Ag2S (émission infrarouge) dans l’eau et les possibles application de ces composés comme sondes biologiques et pour l’imagerie biomédicale.

Tissue engineering aims to develop functional tissues or organs in vitro in order to provide drug testing platforms or transplantable tissues and improve the treatments provided to patients. However, the physiological tissue structures developed to date do not integrate and perfusable vascular network. In vivo, the vascular network supplies the body’s cells with oxygen and nutrients and removes cellular waste and carbon dioxide. It also has a major role in maintaining organ homeostasis. Blood capillaries are hollow vessels whose walls are only composed of a layer of endothelial cells and diffuse nutrients. The blood capillary network is dense and perfuse all tissues. Due to the limit oxygen diffusion inside tissues, each cell is located at most 200µm away from a capillary. The difficulties of building a network of perfusable capillaries and integrating them into tissue constructs limit the development of thick physiological tissues.An innovative technique for developing a microvascular network within a thick construction is presented in this thesis. This technique consists of assembling spherical tissue micro-units within a microfluidic chamber, and developing a network of capillaries through the interstitial pores formed by the spheres packing. Tissue micro-units are composed of biopolymers representative of the extracellular matrix and contain cells from the tissue of interest. A layer of endothelial cells is developed on the surface of these microspheres. The stacking of these microspheres creates a porous medium in which nutrient medium is perfused. Flow control within such a structure allows the application of physical stimuli influencing the self-assembly of endothelial cells into capillaries within the interstitial space of the sphere packing.During this thesis, a device for manufacturing microspheres from natural biopolymers was developed. The structure formed by the stacks of spheres was studied and the flow within such environments were characterized so as to apply controlled physical stimuli to cells. A bioreactor-like perfusion system has been built. A thick tissue structure could be formed within this system and the development of the vascular network was promoted. The formation of the network was demonstrated by the presence of infused blood capillaries within the structure. The technique developed promises to be applied to the development of many tissues and applications for organ-on-chip or tissue engineering devices., L’ingénierie tissulaire vise à développer in vitro des tissus fonctionnels ou des organes afin de fournir des plateformes de tests de médicaments ou des tissus transplantables et améliorer les traitements fournis aux patients. Cependant, les constructions tissulaires physiologiques développées à ce jour n’intègrent pas un réseau vasculaire perfusable. In vivo, le réseau vasculaire approvisionne les cellules de l’organisme en oxygène et nutriments et évacue les déchets cellulaires et le dioxyde de carbone. Il possède également un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie des organes. L’approvisionnement des cellules s’effectue au niveau des capillaires sanguins : vaisseaux creux dont la paroi est uniquement composée d’une couche de cellules endothéliales. Le réseau de capillaires sanguins est un réseau dense perfusant l’ensemble des tissus de l’organisme. De par la limite de diffusion de l’oxygène dans les tissus, chaque cellule est située au maximum à 200 µm d’un capillaire. Les difficultés de construction d’un réseau de capillaires sanguins perfusable et d’intégration au sein de constructions tissulaires limitent le développement de tissus physiologiques épais.Une technique innovante de développement d’un réseau microvasculaire à l’intérieur d’une construction épaisse est présentée dans cette thèse. Cette technique consiste en l’assemblage de micro-unités tissulaires sphériques au sein d’une chambre microfluidique, et en le développement d’un réseau de capillaires au niveau des pores interstitiels formés par l’empilement de sphères. Les micro-unités tissulaires sont composées de biopolymères représentatifs de la matrice extracellulaire et contiennent des cellules du tissu d’intérêt. Une couche de cellules endothéliales est développée à la surface de ces microsphères. L’empilement de ces microsphères crée un milieu poreux dans lequel du milieu nutritif est perfusé. Le contrôle de l’écoulement au sein d’une telle structure permet l’application de stimuli physiques influençant l’auto-assemblage des cellules endothéliales en capillaires au sein de l’espace interstitiel de l’empilement.Durant cette thèse, un dispositif de fabrication de microsphères à partir de biopolymères naturels a été développé. La structure formée par les empilements de sphères a été étudiée et les écoulements au sein de tels milieux ont été caractérisés de sorte à appliquer des stimuli physiques contrôlés aux cellules. Un système microfluidique de perfusion, de type bioréacteur, intégrant une chambre de développement a été fabriquée. Une construction tissulaire épaisse a pu être formée au sein de ce système et le développement du réseau vasculaire a été favorisé. La formation du réseau a été montrée par la présence de capillaires sanguins perfusés au sein de la structure. La technique développée promet une application au développement de nombreux tissus et des applications pour des dispositifs d’organes-sur-puces ou d’ingénierie tissulaire.

Micro-sized titanium dioxide (TiO2) particles are used for years by industrials for their attractive physical and chemical properties. The use of TiO2 nanoparticles (NPs) is also constantly increasing, because the nanometric size gives new interesting properties to particles which industrials are looking for. In some daily-life products including paints, plastics, paper, medicines and food, micro-sized TiO2 particles are used as a pigment for their opacifying and whitening capacities. The use of TiO2 as a food additive, i.e. E171 in the EU, has been authorized in most countries since the 60ies, without any established acceptable daily intake, because of their low toxicity and intestinal absorption. However, it was recently shown that E171 can contain up to 43% of particles with diameter ranging from 1 to 100 nm, i.e. NPs. Still, E171 is not a nanomaterial as described in the European recommendation of definition because it contains less than 50% of NPs (in number). Food grade TiO2 is present in a wide range of food products while little is known about its toxicological impact to human health. The toxicity of ingested TiO2, either nano- or micro-sized, is increasingly documented, still E171 itself is rarely used in these studies.According to in vivo and in vitro studies, TiO2 particles were proven relatively safe for intestinal cells, no cytotoxicity neither genotoxicity were reported. Nevertheless, particles were often reported to increase reactive oxygen species (ROS) cell content, to impair autophagic processes and modulate gene expression and the content of proteins involved in oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and inflammatory response regulation. Interestingly, their reported impact on intestinal cells suggests alteration of almost all the components of the intestinal barrier function, i.e. microbiota, mucus, cell junctions and transporters. This intestinal barrier function is altered in patients suffering from intestinal bowel diseases, these persons are thus possibly more sensitive to mineral particulate in food.The present study aimed at improving knowledge on the toxicity of food-grade TiO2. To this purpose, the impact of E171 was evaluated on in vitro cell models representative of the human intestinal epithelium, i.e. a model of differentiated Caco-2 enterocytes, a model of mucus-secreting epithelium obtained by coculture of Caco-2 and HT29-MTX mucus-secreting cells and a model of the follicle-associated epithelium, which lines Peyer patches, obtained by coculture of Caco-2(C1) and RajiB cells. These cell models were either acutely exposed for 6 h, 24 h and 48 h or chronically exposed for 21 days to E171. In parallel, they were exposed to two model TiO2-NPs, A12 which has the same crystalline structure as E171 and P25, a well-documented TiO2-NPs. Our results show that E171 and TiO2-NPs induced no overt cell mortality but significant oxidative stress, and that they oxidatively damage DNA. They modulate the expression of genes involved in oxidative stress and endoplasmic reticulum stress regulation. They also modulate the expression of genes, as well as the content of proteins from mucus, ABC transporters and inflammatory markers, which are the main players of the intestinal barrier function and presumably increase epithelium sensitivity to xenobiotics. These data suggest that they may be implicated in the development or aggravation of inflammatory bowel diseases., Les particules de dioxyde de titane (TiO2) sont utilisées dans de nombreux secteurs industriels du fait de leurs propriétés physiques et chimiques intéressantes. Depuis une dizaine d’années, elles sont également utilisées sous forme nanoparticulaire car la taille nanométrique leur apporte de nouvelles propriétés, recherchées dans certaines applications industrielles. Elles sont par exemple utilisées comme colorant blanc dans le secteur de la cosmétologie, de la pharmacologie et dans les industries agroalimentaires. Dans ces dernières, l’utilisation de ces particules est autorisée car le TiO2 est un composé insoluble et relativement inerte. Le colorant alimentaire E171, autorisé depuis 1966, est ainsi constitué de particules de TiO2, initialement sous forme micrométrique, mais il s’avère que selon les procédés de fabrication, entre 10 et 43 % (selon les études) de ces particules présentent un diamètre inférieur à 100 nm, i.e. sont sous forme nanométrique. Ce n’est pas un nanomatériau du point de vue de la définition européenne, il n’est donc pas soumis à l’obligation d’étiquetage dans les produits alimentaires. Le E171 est présent dans de nombreux aliments sans que son impact sur la santé humaine, après ingestion, n’ait été clairement documenté. De plus en plus d’études s’intéressent à la toxicité des nanoparticules (NPs) après leur ingestion, mais peu d’entre elles ont été menées avec le E171 à proprement parler. Les études in vivo et in vitro publiées à ce jour démontrent que les NPs de TiO2 sont peu toxiques. Leur absorption intestinale et leur translocation vers le système sanguin puis des organes secondaires est faible. Les principaux effets décrits sont une augmentation des espèces réactives de l’oxygène associées à un stress oxydant, l’induction de marqueurs de l’inflammation, et plus récemment l’induction du stress du réticulum endoplasmique. Des effets sont également rapportés sur différents paramètres de la barrière intestinale, i.e. le microbiote, le mucus, les transporteurs membranaires, les jonctions cellulaires et l’immunité intestinale. Chez certaines personnes, cette barrière est compromise, elles sont donc potentiellement plus sensibles aux micros et nanos-particules contenues dans l’alimentation. Leur épithélium intestinal est enflammé, et à long terme, ces personnes peuvent développer des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et dans les cas les plus graves, des cancers.L’objectif de cette thèse est d’étudier la toxicité du colorant alimentaire E171 et d’approfondir les connaissances relatives à l’impact des NPs de TiO2 sur le système gastro-intestinal. Pour cela, nous avons travaillé avec différents modèles cellulaires d’épithélia intestinaux humain, un modèle d’épithélium jointif composé d’entérocytes Caco-2, un modèle d’épithélium sécrétant une couche de mucus, composé de cellules Caco-2 et HT29-MTX et enfin un modèle d’épithélium bordant les plaques de Peyer, composé des cellules Caco-2(C1) et RajiB. Ces modèles cellulaires ont été exposés de façon aigüe (6 h, 24 h et 48 h) ou chronique (21 jours), au colorant E171 ainsi qu’à deux NPs de TiO2 : A12, qui a la même structure cristalline que le E171 et P25, une NP très documentée dans la littérature. Nos résultats montrent que le E171 et les NPs de TiO2 sont modérément toxiques, ils n’engendrent pas de mortalité cellulaire ni de dommages à L’ADN. Néanmoins, ils provoquent une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène intracellulaires et modulent certains marqueurs impliqués dans le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique et l’inflammation. Ils impactent également la sécrétion et la composition de la couche de mucus, l’expression des transporteurs ABC, qui sont des paramètres impliqués dans la fonction de barrière de l’épithélium intestinal, le rendant possiblement plus vulnérable aux agressions extérieures.

Metallic chemical elements such as Fe, Cu or Zn are present in minute quantities in the brain. The role of these trace metals in neuronal functions such as synaptic transmission and memory processes remains largely unclear. Moreover, metal dyshomeostasis is found in many neuropathologies, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s or amyotrophic lateral sclerosis. The interaction mechanisms of trace metals at the neuronal level are difficult to describe because of the lack of analytical methods with appropriate resolution and sensitivity to determine metal distribution at the synaptic level. Synchrotron X-ray fluorescence spectrometry (SXRF) is a multielemental chemical analysis method for describing the quantitative distribution of these elements at the sub-cellular scale with a nanometric resolution (40 nm at ESRF beamline ID16A ) and a very high sensitivity. In order to accurately interpret chemical imaging results, we have developed a protocol to correlate nano-SXRF imaging with stimulated emission depletion super resolution microscopy (STED), allowing the correlation of metal distribution and that of target proteins in super resolution. We labeled microtubules and F-actin of primary rat hippocampal neurons and imaged the cytoskeleton by STED microscopy before determining the distributions of P, S, Fe, Cu and Zn by SXRF spectrometry. We evidenced the colocalization of Zn and microtubules at the dendritic level and a localization of Cu mainly in the neck of dendritic spines rich in F-actin, and a distribution of Fe in the form of very localized points in the dendrites. These results highlight the crucial role of Zn in cytoskeleton architecture of hippocampal neurons and the developed correlative imaging method opens new perspectives for the study of metal dyshomeostasis in neurodegenerative diseases., Les éléments chimiques métalliques tels que Fe, Cu ou Zn sont présents en quantité infime dans le cerveau. Le rôle de ces métaux traces dans les fonctions neuronales, telles que la transmission synaptique et les processus de mémorisation, reste encore largement à élucider. En outre, une dyshoméostasie des métaux est retrouvée dans de nombreuses neuropathologies, telles que maladie d’Alzheimer, de Parkinson ou sclérose latérale amyotrophique. Les mécanismes d’interaction des métaux traces au niveau neuronal sont difficiles à décrire faute de méthodes analytiques possédant une résolution et une sensibilité adaptées pour en déterminer la distribution à l’échelle synaptique. La spectrométrie de fluorescence-X synchrotron (SXRF) est une méthode d’analyse chimique multi-élémentaire permettant de décrire la distribution quantitative de ces éléments à l’échelle subcellulaire avec une résolution nanométrique (40 nm avec la ligne ID16A du synchrotron ESRF) et une très haute sensibilité. Afin d’interpréter avec précision les résultats d’imagerie chimique, nous avons développé un protocole pour corréler l’imagerie nano-SXRF avec la microscopie super résolutive de déplétion par émission stimulée (STED) permettant ainsi la corrélation des distributions des métaux avec celle de protéines cibles en super résolution. Nous avons marqué les microtubules et l’actine-F de neurones primaires d’hippocampe de rat puis imagé le cytosquelette par microscopie STED avant de déterminer par spectrométrie SXRF les distributions des éléments P, S, Fe, Cu et Zn. Nous avons ainsi mis en évidence la colocalisation du Zn et des microtubules au niveau dendritique ainsi qu’une localisation du Cu essentiellement dans le cou des épines dendritiques riches en F-actine, et une distribution du Fe sous forme de points très localisés dans les dendrites. Ces résultats ont révélé le rôle essentiel du Zn dans l’architecture du cytosquelette des neurones d’hippocampe et la méthode d’imagerie corrélative développée ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude des dyshoméostasies des métaux dans les maladies neurodégénératives.