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BARGHINI P., PASQUALETTI M., GORRASI S., ANDFENICEM.2018.Study of bacterial diversity of a saltern crystallization pond (“Saline di Tarquinia", Italy) and its correlation with salinity variations. J environ prot ecol.19(1): 139–145. PDF online: https://docs.google.com/a/jepe-journal.info/viewer?a=v&pid=sites&srcid=amVwZS1qb3VybmFsLmluZm98amVwZS1qb3VybmFsfGd4OjIyNTM3Mzg1MWQ0YmJmM2Y &nbsp

BARGHINI P., GIOVANNINI V.,FENICEM., GORRASI S., AND PASQUALETTI M.2018.High lutein production by a halo-tolerant strain ofDunaliellasp. (Chlorophyceae) isolated from solar salterns in Central Italy. J environ prot ecol.19(2): 704–712 PDF online:https://docs.google.com/a/jepe-journal.info/viewer?a=v&pid=sites&srcid=amVwZS1qb3VybmFsLmluZm98amVwZS1qb3VybmFsfGd4OjVkYjU0YmFmYmM5NzVkMDA

Lo scopo del lavoro è stato quello di approfondire la comprensione delle interazioni microbiche di una complessa Comunità Microbica (CM) coinvolta nella produzione di CH4 dal processo di Digestione Anaerobica (DA). Due esperimenti sono stati condotti in batch in condizioni di mesofilia (37°C) utilizzando la paglia di grano come substrato. Nel 1° esperimento due diverse strutture di CM sono state testate per comprendere il ruolo dell’aggregazione della comunità sulle produzioni di CH4. I risultati hanno mostrato che la struttura aggregata (A) ha aumentato la produzione (42%) rispetto a quella disaggregata (D). Sia la tecnica Illumina che la FISH hanno evidenziato differenze significative nella composizione sia degli inoculi A e D che delle prove AP e DP. Nel 2° esperimento, le fasi di idrolisi e acidogenesi, sono state migliorate rispettivamente dalla bioaugmentation della CM di D con: 1) un mix di Funghi Anaerobi Ruminali (ARF) e 2) un pool di batteri fermentanti (F210). I migliori risultati sono stati ottenuti quando ARF e F210 sono stati utilizzati insieme (1397,2±73,2 ml/l CH4); solo F210 ha aumentato la produzione di CH4, ma con un’efficienza più bassa (988,3±148,2 ml/l); quando sono stati utilizzati solo gli ARF, la produzione di CH4 è stata molto bassa (250,8±14,6 ml/l) smentendo l’efficacia di una interazione diretta con i metanogeni. Inoltre l’analisi della comunità (Illumina e FISH) ha mostrato degli shift molto interessanti tra le componenti funzionali lungo le prove sperimentali. Questi risultati collocano gli ARF all’inizio della catena trofica della DA e mostrano anche come l’equilibrio tra le componenti funzionali della CM svolge un ruolo fondamentale. The aim of the work was to gain deeper insight into microbial interactions of the complex Microbial Community (MC) involved in CH4 production by Anaerobic Digestion (AD). Two batch experiments were carried out in mesophilic conditions (37°C) using wheat straw as substrate. In the 1st experiment two different structured MC were tested to investigate the role of the microbial aggregation on the CH4 productivity. The results showed that the aggregated structure (A) increased the production (42%) when compared to the disaggregated one (D). Both Illumina and FISH techniques showed significant differences in the composition both of A and D inocula, and AP and DP trials. In the 2nd experiment, the hydrolysis and acidogenesis steps were respectively enhanced by bioaugmentation of the MC of D with: 1) a mix of Anaerobic Ruminal Fungi (ARF) and 2) a fermenting bacteria pool (F210). The best results were obtained when both ARF and F210 were used (1397,2±73,2 ml/l CH4); F210 alone increased the CH4 production but with a lower efficiency (988,3±148,2 ml/l); when only ARF was used, CH4 production was very low (250,8±14,6 ml/l), disproving the effectiveness of their direct interaction with methanogens. Moreover MC analysis (Illumina and FISH) showed very interesting shifts composition along the experimental trial. These results place the ARF at the first step of the AD trophic chain and also show how the equilibrium among the microbial functional component of MC plays a pivotal role. Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche

According to the Convention on Biological Diversity, Biodiversity is “the variability among living organisms from all sources including, inter alia, terrestrial, marine and other aquatic ecosystems, and the ecological complexes of which they are part; this includes diversity within species, between species, and of ecosystems”. Antarctica is the coldest, driest, and windiest continent. The temperature can reach -30 °C, the precipitation is only 5-20 g/cm2/year and the highest recorded wind velocity is 327 km/h. It has the highest average elevation of all the continents, and about 98% of its surface, 14 million km2, is covered by ice. In these extreme conditions, only cold-adapted organisms survive, including plants, animals, and microorganisms. The Antarctic continent has been frequently cited as a pristine place, with a rather limited diversity of plants and animals, but with highly diverse microbial community. In this work we studied the bacterial community obtained from sea water and rock samples collected in Antarctica. The study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial community by molecular methods. The isolates were investigated in order to understand their temperature and salinity preferences. Furthermore, a detailed taxonomical study was carried out both on cultivable and total bacterial population. Study about bacterial isolates  Strain isolation and preliminary tests Isolates derived from two different typology samples: sea water (BA) and rock (BAR). Sea water was sampled in various areas of Ross sea at different distances from the coast: Faraglione (300 m), Santa Maria Novella (2.5 Km), Portofino (1 Km), Thetys Bay (0 m). The rocks samples were sampled according to a longitudinal and altitudinal transect at increasing distance from the sea in 57 different places. Moreover for each sample place were considered different sites. Rocks were fragmented and strewed on PCA plates and water was filtered on membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for the molecular investigations. Pure cultures of the isolates were obtained by plate streak method. Preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates. A total of 100 isolates were obtained.  Taxonomical identification of the isolates Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for the amplification of 16S rDNA to allow taxonomical identification of each isolate. The strains were affiliates to the genera: Microbacterium, Psychrobacter, Diezia, Marisediminicola, Bacillus, Sporosarcina, Arthrobacter, Pseudomonas, Deinococcus, Brevundimonas, Frondihabitans, Rhodococcus, Agrococcus, Auraticoccus, Kocuria. Only 54% of the strains were identified to species level and the remaining were identified only to the genus level. In some cases Blast analyses supplied uncertain identification, sequences were aligned with highly similar 16S in the NCBI Genbank and phylogenetic analysis was performed. Three phylogenetic trees were created for the most important and representative groups: Pseudomonas, Arthrobacter, Psychrobacter. A phylogenetic tree was constructed for all minor groups.  Growth profiles at different Temperature and salinity The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C). The majority (88%) of BA strains were able to grow in a wide temperature range. The 82% of BA were psycrotolerant, 9% were mesophilic- psychrotolerant and 9% strictly psychrophilic because they had the optima at 5°C and 10°C. All BAR strains grew in a wide temperature range. 96% of BAR were psycrotolerant and only 4% were mesophilic- psychrotolerant. The optimal salinity for growth were tested in the range 0-100 g/L on PCA plates containing different concentration of NaCl salt (steps of 5 g/L). 35% of BA strains were no halophilic, 34% were halotollerant and 31% were slightly halophilic. 65% of BAR strains were no halophilic, 26% slightly halophilic and 9% were halotollerant. Study of total bacterial community In order to have a complete overview of the bacterial community structure, by a cultivation-independent approach, total DNA was extracted from the filter-membranes and rocks samples. The bacteria biodiversity was studied by PCR-DGGE fingerprinting. The genetic target used was the hypervariable region V3 of the 16S rDNA. DGGE gel images allow the analysis of band patterns generated from the environmental samples representing the various species present in the community. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by band intensity.  Bacterial community in the sea water samples DGGE analysis was conducted for the bacterial communities present in marine samples from four different sites in the Ross Sea and sampled in three different times. To evaluate the structure of the bacterial community and perform a clustering analysis of the various DGGE profiles two software were used: Quantity One 1-D and Phoretix 1-D. Pearson and Dice dendrograms reflect the high heterogeneity of the sea samples and there was not a clear correlation between either in terms of sites, nor according to the time of sampling. Some bands were excised from the gel, re-amplified, sequenced and compared with NCBI GenBank database sequences. A phylogenetic tree was built to understand the relationships between the sequences. The comparison in the database shows that 67% of the identified sequences were close to unclassified species or uncultured bacteria. 155 bands were observed and the band intensity was calculate for all lanes (profiles) to have information on the relative abundance of species. The biodiversity and richness was estimated with 8 indices: Richness (n°), Weighted Richness (Rr), Stability index, Margalef index, Pielou’s evenness index, functional organization (Fo), Simpson and Shannon index. The correlation of 3 environmental variables: temperature, distance from the coast, presence/absence of ice, with the structure of the microbial communities was observed by NMDS analysis (not metric Multi Dimensional Scaling). In a two-dimensional plot the sea water samples were divided in 3 groups: α, β, γ. The temperature seems to be positively correlated to the group γ and negatively correlated to the α and β groups. While, the variables presence/absence of ice and distance from the coast were positively correlated with the α, β groups and negatively correlated to the γ groups.  Bacterial community in the rock samples The endolithic bacterial community present in rocks samples collected in the McMurdo Dry Valleys of, Victoria Land, was analyzed by the PCR-DGGE technique. The work was divided in two parts: - A first analysis had allowed the study of the total bacterial communities present in 70 samples collected in 57 Victoria Lands sites. For same sites were present more rocks of different types. - A second analysis allowed to investigate how the bacterial biodiversity changes in the micro and macro rock environment. Three sites were analyzed: Richard Nunatak, Vegetation Island and Mt.Howard. For each site were tested two roks samples, both individually and combined together. In addition, from one of the two rocks were derived three sub samples, identified as A, B, C.  Total rocks samples The structure of bacterial endolithic communities was studied by a cluster analysis with two software: Quantity One 1-D and Phoretix 1-D. Dice and Pearson coefficients described a strong heterogeneity among the rock samples. In addition, in the dendrograms no correlation was observed between distribution of the samples and their sampling sites. 61 bands were excised from the gel, re-amplified, sequenced and compared with NCBI GenBank database sequences. The phylogenetic analysis showed that 84% of the sequences presented no similarity with the species and/or genera known. In particular, 46% were related to sequences deposited in the data bank as “Uncultured bacterium”, 25% had similarity with sequences of know genera but a unknow species and 13% showed no similarity with deposited sequences. The biodiversity and richness indices were calculated to describe the bacterial endolithic communities. All rock samples were characterized by high values of biodiversity and richness. The results showed that biodiversity and richness were not affected by position and type of the rock. All samples showed a high heterogeneity. NMDS analysis was done to understand how five variables: altitude, distance from the sea, type of colonization, porosity and type of rock, influenced the biodiversity and richness of rock samples. In the two-dimensional plot each sample appeared to be influenced differently by the five variables and a common relationship was not observed. The results described an environment in which many variables and theit combination determined the biodiversity and richness of community. Each sample is affected differently by the variables and it was not clear how the variables influenced the endolithic bacterial distribution.  Micro and macro rock habitat The micro habitats present inside the rock are influenced by numerous factors: position and orientation of rocks, altitude, permanence of the snow cover. These are significant aspects in the selection of the microorganisms and the position and portion in which the microrganism will begin colonization. This means that within the rock numerous micro habitats are present. These have different characteristics and will influence the development the type of the microbial community. Using the dendrograms based on Dice and Pearson coefficient has investigated the biodiversity into the two rocks of the same site and the diversity in the sub samples, identified as A, B, C. The bacterial endolithic communities had a great heterogeneity even if the bacterial profiles in the same sites were similar and had common bands. The results obtained by biodiversity and richness indices for Richard Nunatak, Mt.Howard and Vegetation Island samples confirmed the results obtained other analysis. These results reinforce the hypothesis that Antarctic rock environment contains numerous micro habitats and the rock represents a complex ecosystem in which each factor causes large variations in microbial communities. Taxonomic DGGE results obtained by the total community study were quite different from those gained by the pure cultures. This could be explained by the limits of two approaches. The first is a cultural technique that allows to study only bacteria that can grow in laboratory. The second is an cultured indipendent technique, but the DGGE can detect bacteria representing at least 1% of the total community. It is possible that some species, present in a very low percentage and not observed in DGGE, had prevailed under to favorable culture conditions during the isolation procedures. This work is very interesting to understand the structure of bacterial communities in sea water and rocks samples. In particular, Biodiversity and Richness in rock habitats is extremely high and the results underlined that it’is necessary to increase the knowledge so far collected and further expand the studies on bacterial communities endolithic Antarctica. Il significato di Biodiversità, con le sue diverse accezioni, lo si può comprendere più facilmente quando non lo si considera come termine assoluto, ma come qualcosa dipendente dal contesto che si sta studiando. De Long nel 1996 afferma: “La Biodiversità è un attributo di un territorio e in particolare si riferisce alla varietà all'interno e tra organismi viventi, nell’insieme di organismi viventi, nelle comunità biotiche e nei processi biotici presenti in natura o modificati dall'uomo. La Biodiversità può essere misurata in termini di diversità genetica e con l'identità e il numero di diversi tipi di specie, insieme di specie, comunità biotiche e processi biotici, e la quantità (abbondanza, biomassa, copertura,) e la struttura. Può essere osservata e misurata in qualunque scala spaziale che va da micrositi a differenti habitat per l'intera biosfera”. L’Antartide per posizione geografica, caratteristiche fisiche e la quasi totale assenza di perturbazioni antropiche rappresenta un ambiente estremo particolarmente interessante per la ricerca scientifica; non solo per lo studio della Biodiversità che qui si può osservare, ma anche per la ricerca dei vari processi evolutivi e i cambiamenti climatici che prendono parte al “global change”. L'Antartide è il continente più meridionale della terra, si sviluppa quasi totalmente all'interno del Circolo Polare Antartico e comprende i mari e le terre che circondano il Polo Sud. E’ il continente più freddo, più secco e ventoso. La temperatura varia da valori che si aggirano attorno a 0°C in estate sulla costa, fino a sfiorare i -90°C in inverno a 3000 metri di quota. Le precipitazioni sono piuttosto scarse e si aggirano intorno ai 5-20 g/cm2/anno. I venti possono superare i 200 km/h. Ha la più alta elevazione media se confrontato con gli altri continenti e il 98% del suo territorio è coperto dalla Calotta glaciale Antartica con uno spessore medio di 1,6 km. Il progetto di ricerca presentato prevede lo studio delle popolazioni batteriche presenti in campioni di acqua marina e di rocce prelevate in diverse zone dell’Antartide. L’attività è stata caratterizzata da un lavoro sperimentale suddiviso in due parti fondamentali: la prima, legata ad un approccio basato su tecniche coltura-indipendenti e la seconda legata all’utilizzo di tecniche colturali. I campioni marini provenienti dal mare di Ross e i campioni di roccia sono stati raccolti durante la campagna 2010-2011 del progetto PNRA (Programma Nazionale di Ricerche in Antartide). Le acque sono state prelevate in tre periodi distinti, in 4 differenti siti a differente distanza dalla costa: Faraglione, Santa Maria Novella, Portofino e Thetys Bay, mentre le rocce sono state campionate secondo un transetto longitudinale e altitudinale a crescente distanza dal mare nelle Valli Secche di McMurdo, Terra Vittoria. Le informazioni sulle comunità batteriche delle rocce antartiche non sono numerose e poco si conosce dei generi e delle specie che è possibile osservare in questi particolari habitat. Con questo lavoro è stato possibile ampliare e approfondire le conoscenze sulla struttura delle comunità batteriche endolitiche antartiche ed inoltre, lo studio delle comunità batteriche delle acque del mare di Ross hanno permesso di confrontare le due diverse tipologie di comunità evidenziando come alcuni generi siano presenti in entrambi gli ambienti, mentre altri siano specifici dell’uno o dell’altro habitat. Studio dei ceppi isolati  Isolamento e test preliminari I ceppi isolati derivano da campioni di acqua di mare (BA) e campioni di roccia (BAR). Le rocce erano frammentate e poste su piastre di PCA. L’acqua è stata preventivamente filtrata e le membrane poste su piastre di PCA. Le colture pure erano ottenute mediante la tecnica dello striscio. Uno screening iniziale e test preliminari, studio morfologico della cellula e della colonia e test biochimici, hanno permesso di eliminare replicati consentendo di ottenere 100 isolati.  Identificazione tassonomica dei ceppi mediante il gene 16S rDNA Il DNA era estratto dalle colture pure è stato usato per amplificare il gene 16S rDNA, il quale ha permesso l’identificazione tassonomica di ogni isolato. Solo il 54% dei ceppi potevano essere identificati a livello di specie, mentre i restanti erano identificati solo al livello di genere. I ceppi erano affiliati ai generi: Microbacterium, Psychrobacter, Diezia, Marisediminicola, Bacillus, Sporosarcina, Arthrobacter, Pseudomonas, Deinococcus, Brevundimonas, Frondihabitans, Rhodococcus, Agrococcus, Auraticoccus, Kocuria. Sono stati costruiti quattro alberi filogenetici allineando le sequenze dei ceppi identificati con le sequenze presenti in banca dati NCBI GenBank con le quali si erano ottenuti i più alti valori di similarità. Gli alberi filogenetici erano costruiti per i tre generi più rappresentativi: Pseudomonas, Arthrobacter, Psychrobacter, mentre un albero era costruito per tutti i gruppi minoritari.  Profili di crescita a differenti temperature e concentrazioni saline Il profilo di crescita a differenti temperature per i ceppi antartici era determinato monitorando la crescita delle colonie batteriche su piastre di PCA in un intervallo di temperatura tra 0 e 45°C con step di 5°C. 88% dei ceppi BA erano in grado di crescere in un ampio intervallo di temperatura e solo il 12% arrestava la propria crescita sotto i 35°C. L’82% dei ceppi BA erano psicrotolleranti, il 9% erano mesofili-psicrotolleranti e il 9% erano psicrofili stretti, avendo un optimum a 5-10°C. Tutti i BAR crescevano in un ampio intervallo di temperatura; il 96% erano psicrotolleranti e solo il 4% erano mesofili-psicrotolleranti. L’optimum e il range di crescita a differenti concentrazioni saline era testato monitorando la crescita delle colonie batteriche su piastre di PCA contenenti NaCl in concetrazioni 0-100 g/L, con intervalli di 5g/L. Il 35% dei BA erano non alofili, il 34% erano alotolleranti e il 31% erano moderatamente alofili. I ceppi BAR erano principalmente (65%) non alofili, il 26% erano moderatamente alofili e il 9% erano alotolleranti. Studio della comunità batterica totale Oggi la comunità scientifica ritiene che circa il 99% dei microrganismi presenti in natura, non può essere isolato in colture pure. Quindi, per comprendere meglio la diversità microbica e il ruolo che essa ha nel mantenimento dell'ecosistema, sono necessarie ulteriori tecniche che completano e complementano l'approccio delle tecniche colturali. Le Tecniche di Fingerprinting molecolare consentono un confronto diretto del DNA di comunità microbiche provenienti da diversi campioni e sono considerate strumenti importanti per valutare rapidamente i cambiamenti della struttura delle comunità nel tempo e nello spazio. La biodiversità batterica era studiata mediante la tecnica di fingerprinting PCR-DGGE. Il target genico scelto era la regione ipervariabile V3 del gene 16S rDNA. La DGGE si basata sull’elettroforesi di frammenti di DNA su un gel di poliacrilammide contenente un gradiente crescente di sostanze denaturanti, urea e formammide.  Studio della comunità batterica nei campioni di acqua marina Mediante la tecnica DGGE è stata condotta un’analisi delle comunità batteriche presenti in campioni marini provenienti da quattro differenti siti del mare di Ross e campionati in tre differenti tempi.Per valutare la struttura della comunità batterica e condurre un’analisi di clusterizzazione dei profili dei differenti campioni sono stati usati due software di analisi d’immagine: Quantity One 1-D e Phoretix 1-D. Sia il dendrogramma basato sul coefficiente di Dice che quello basato sul coefficiente di Pearson rispecchiano l’elevata eterogeneità che caratterizza i campioni studiati evidenziando come non ci sia una netta correlazione fra di loro, né a livello di siti, né in base ai periodi di campionamento. Per ottenere una visione più dettagliata delle specie presenti nei campioni del mare di Ross, le bande più rappresentative sono state excise dal gel di DGGE, ri-amplificate, sequenziate e confrontate con le sequenze depositate in banca dati NCBI GenBank. Inoltre è stato realizzato un albero filogenetico che descrive le relazioni fra le sequenze ottenute. Il confronto in banca dati mostra come il 67% delle sequenze identificate siano appartenenti a specie non ancora classificate o non coltivabili. Questi risultati evidenziano come le conoscenze sulla biodiversità microbica in ambienti poco conosciuti ed estremi, come l’Antartide, siano ancora molto limitate. L’analisi d’immagine elaborata con il software Quantity One 1-D ha permesso di individuare un totale di 155 bande e calcolare per tutte i profili l’intensità di ogni banda così da avere informazioni sull’abbondanza relativa delle specie. La biodiversità e la ricchezza nei diversi campioni è stata stimata attraverso l’utilizzo di otto diversi indici: Ricchezza (n°), Ricchezza ponderata (Rr), indice di Stabilità, indice di Margalef , indice di Pielou, Organizzazione funzionale (Fo), indice di Simpson e Shannon. Inoltre, per comprendere l’effetto di tre variabili ambientali: temperatura dell’acqua durante il campionamento, presenza o assenza di ghiaccio e distanza dalla costa, sulla struttura delle comunità microbiche si è scelto di applicare agli indici calcolati sui profili di DGGE la tecnica di orientamento NMDS (Non metric Multi Dimensional Scaling), la quale ha permesso di evidenziare se e come le componenti abiotiche fossero correlate positivamente o negativamente con la ricchezza e biodiversità dei campioni. Nel grafico bi-dimensionale i campioni erano suddivisi in tre gruppi: α, β, γ. Il gruppo γ sembrava essere positivamente correlato alla temperatura diversamente dai gruppi α e β che sembravano correlati negativamente. Le variabili presenza/assenza di ghiaccio e distanza dalla costa erano correlate positivamente con α, β e negativamente con γ.  Studio della comunità batterica nei campioni rocciosi La comunità batterica endolitica presente nelle rocce raccolte nelle Valli Secche di McMurdo, Terra Vittoria, è stata analizzata mediante la tecnica di fingerprinting molecolare PCR-DGGE. La biodiversità batterica totale è stata studiata a due differenti livelli: una prima analisi ha permesso lo studio della comunità batterica totale presente nei campioni raccolti nelle 57 località analizzando anche rocce di differente tipologia proveniente da uno stesso sito. Una seconda analisi ha permesso di investigare se e come la biodiversità batterica cambi all’interno del micro e macro habitat roccioso. Per studiare la comunità batterica due campioni di rocce della stessa tipologia e provenienti da uno stesso sito sono stati processati mediante DGGE, sia separatamente che uniti insieme. Inoltre, da una delle due rocce sono stati ricavati tre sotto campioni, identificati come A, B, C, processati separatamente per comprendere come la biodiversità cambi all’interno del micro habitat roccioso.  Analisi dei campioni rocciosi Per valutare la struttura delle comunità batteriche endolitiche e realizzare un’analisi di clusterizzazione dei profili dei differenti campioni sono stati usati due software di analisi d’immagine: Quantity One 1-D e Phoretix 1-D. L’analisi di cluster si è basata sul coefficiente di correlazione di Dice e sul coefficiente di Pearson. Entrambi i coefficienti hanno evidenziato la forte eterogeneità che si ha tra i campioni rocciosi. Inoltre, non è stato possibile individuare una correlazione tra la distribuzione dei profili all’interno del dendrogramma e la tipologia di roccia e la posizione dei siti da cui i campioni provengono. L’analisi mediante DGGE dei 70 campioni rocciosi ha evidenziato profili con numerose bande e di queste 61 sono state excise dal gel, ri-amplificate e i prodotti di PCR sono stati sequenziati. Le sequenze sono state confrontate con quelle depositate in banca dati NCBI GenBank e utilizzate per l’analisi filogenetica. I risultati ottenuti hanno mostrato come l’84% delle sequenze non presentavo similitudine con specie e/o generi noti. In particolare, il 46% erano simili a sequenze depositate in banca dati come “Uncultured bacterium”, il 25% presentano maggiore similarità con sequenze di specie non coltivabili appartenenti a generi conosciuti e il 13% non mostravano alcuna similarità con sequenze depositate e questo non permetteva l’attribuzione ad alcuna specie nota. Solo il 16% delle sequenze era riconducibile a generi e/o specie note. Mediante gli indici di biodiversità e ricchezza è stato possibile descrivere ulteriormente la struttura delle comunità batteriche endolitiche dei differenti siti. Tutte le rocce erano caratterizzate da un’elevata eterogeneità; inoltre, i risultati mostravano come la diversità e la ricchezza in specie non fosse correlata con la posizione e il sito di campionamento. Al fine di comprendere come la ricchezza e la biodiversità calcolate per le comunità batteriche che colonizzano le 70 rocce studiate possano essere correlati ad alcuni fattori, è stata utilizzata l’analisi di orientamento NMDS (Non-Metric Multidimensional Scaling). Nell’analisi multivariata le variabili prese in considerazione erano: distanza dal mare (km), altitudine (m), il tipo di colonizzazione, di porosità e il tipo di roccia.  Analisi del micro e macro habitat roccioso I micro habitat che si sviluppano all’interno della roccia sono influenzati da numerosi fattori come la posizione, l’esposizione, l’orientamento, l’altitudine, la permanenza della copertura nevosa. Questi sono aspetti significativi nella scelta da parte dei microrganismi della posizione e della porzione nella quale avverrà la colonizzazione. Mediante i dendrogrammi basati sul coefficiente di Dice e Pearson si è studiata la biodiversità e le relazioni esistenti di rocce campionate all’interno di uno stesso sito. Inoltre si è cercato di comprendere se e come all’interno di una stessa roccia esistano più microhabitat con una differente distribuzione della comunità batterica. I risultati ottenuti mostrano come la struttura delle comunità batteriche sia caratteristica per ogni sito e come all’interno di ognuno e dei sottogruppi A, B, C non ci siano differenze rilevanti che fanno sì che i loro profili possano clusterizzare in posizioni differenti dal gruppo a cui appartengono. Mediante il software Quantity-one è stato possibile elaborare per ogni sito il confrontato tra i profili permettendo di indicare le bande comuni a tutti e quelle presenti solo in alcuni. I risultati ottenuti sembrerebbero descrivere la roccia antartica come un ambiente caratterizzato da numerosi micro habitat all’interno dei quali si sviluppano numerose comunità batteriche particolari. Quindi le estreme condizioni che caratterizzano il continente Antartide fanno si che anche piccole differenze nell’esposizione e nell’inclinazione della roccia definiscano se e come la roccia venga colonizzata. Gli indici di biodiversità e ricchezza calcolati per i siti Richard Nunatak, Mt.Howard e Vegetation Island evidenziano dei campioni caratterizzati da un elevata diversità confermando i risultati ottenuti dall’analisi del confronto dei profili di uno stesso sito. Grazie a questo lavoro di tesi è stato possibile ampliare le informazioni sulle comunità batteriche endolitiche antartiche. Le informazioni su queste comunità non sono particolarmente abbondanti, quindi la possibilità di introdurre nuove informazioni è estremamente importante per capire sia come la vita si sviluppi in ambienti estremi come l’Antaertide sia quale siano i limiti a cui gli organismi viventi sono in grado di spingersi. Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche

Obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo studio delle comunità batteriche presenti nelle acque delle Saline di Tarquinia, Viterbo (Italia) attraverso metodi colturali e coltura indipendenti ed il monitoraggio del cambiamento nella composizione di tali comunità in seguito a variazioni nutrizionali, climatiche, stagionali,… Nelle Saline di Tarquinia sono stati eseguiti vari studi relativi agli organismi eucarioti che popolano tale ambiente, ma non sono mai state studiate finora le comunità batteriche presenti. Allo scopo di ottenere informazioni sia a livello ecologico, sia per possibili future applicazioni in ambito biotecnologico, lo studio è stato eseguito sia su batteri coltivabili, isolati con i metodi tradizionali, sia sulle comunità batteriche totali, utilizzando metodi molecolari (PCR-DGGE). Gli ecosistemi iperalini sono considerati ambienti estremi e le saline ne sono un esempio. Esse sono caratterizzate da una serie di vasche interconnesse nelle quali la concentrazione salina aumenta progressivamente fin oltre la saturazione e sono caratterizzate da una elevata variabilità dei parametri chimico-fisici, i quali sono soggetti a forti fluttuazioni. Le Saline di Tarquinia sono state utilizzate per la produzione industriale di sale fino al 1997 e dal 1980 sono state istituite Riserva Naturale. Sono caratterizzate da oltre 100 vasche. Allo scopo di poter eseguire una comparazione con una salina ancora attiva nella produzione di sale, è stato condotto uno studio preliminare presso “Salina Chiusicella” all’interno delle saline di Trapani e Paceco. Presso le saline di Tarquinia è stata eseguita una campagna di campionamento triennale, che ha previsto il prelievo mensile di campioni di acqua per i primi due anni, a partire dal mese di maggio 2012 e settimanale per tre mesi significativi a livello stagionale (maggio 2014, settembre 2014 e febbraio 2015) durante il terzo anno. La campagna di campionamento ha previsto il prelievo di campioni di acqua da 14 vasche scelte secondo un gradiente di salinità e dal mare limitrofo per un totale di 15 campioni. Ciascun campione rappresenta la media di tre sottocampioni prelevati da tre punti significativi in ciascun sito. Presso Salina Chiusicella sono stati invece eseguiti due campionamenti (settembre 2013 e settembre 2014) da 10 vasche scelte secondo un gradiente di salinità. Isolamento dei batteri coltivabili e test preliminari I campioni di acqua sono stati filtrati su membrane di nitrocellulosa allo scopo di ottenere colture batteriche pure incubando il filtro su piastre di PCA (Plate Count Agar) a differenti concentrazioni saline scelte in un range compreso tra 0 e 250‰ con step di 50‰. Si è proceduto quindi ad una caratterizzazione morfologica e biochimica ed alla colorazione di Gram, che hanno permesso di ottenere 39 diversi isolati. Identificazione degli isolati Il DNA genomico batterico è stato estratto dalle colture pure ad utilizzato per l’amplificazione del 16S rDNA per permettere l’identificazione degli isolati. 29 ceppi su 39 sono stati identificati a livello di specie (77% ca.). 26 di questi hanno mostrato, dal confronto in banca dati GenBank, valori elevati di identità (99-100%). Tutti gli altri isolati sono stati identificati a livello di genere. 29 ceppi appartenevano alla classe γ-Proteobacteria e 14 di questi all’ordine Oceanospirillales. Tra questi, i generi Halomonas e Salinivibrio erano la maggioranza (11 e 7 isolati rispettivamente). In particolare, all’interno del genere Halomonas sono state identificate 7 differenti specie. Sono stati isolati inoltre ceppi appartenenti agli ordini Enterobacteriales (generi Yersinia e Erwinia), Pseudomonadales (generi Pseudomonas e Psychrobacter), Alteromonadales (genere Idiomarina), Vibrionales (genere Salinivibrio), Rhodobacterales (genere Ruegeria), Actinomycetales (generi Rhodococcus, Nesterenkonia, Arthrobacter e Microbacterium) Bacillales (generi Bacillus, Marinococcus e Planococcus) e Aeromonadales (genere Aeromonas). Le sequenze 16S rDNA dei ceppi isolati sono state allineate tra loro e con quelle che dal confronto in banca dati GenBank hanno mostrato la maggior percentuale di similarità con esse, allo scopo di eseguire analisi filogenetiche. Sono stati ottenuti tre alberi filogenetici utilizzando il metodo della massima verosimiglianza: uno comprendente tutti i ceppi isolati, il secondo relativo all’ordine Oceanospirillales e il terzo relativo agli altri ordini. Sulla base dei risultati ottenuti, alcuni dei ceppi sono stati identificati con certezza a livello di specie mentre altri, a causa della lunghezza dei rami o della posizione esterna nei raggruppamenti, probabilmente appartengono a specie nuove. Per tutti gli altri ceppi, l’identificazione è stata possibile solo a livello di genere. In molti casi questo potrebbe essere dovuto allo scarso potere informativo del gene target utilizzato per discernere la relazioni al di sotto del livello di genere. Determinazione dei profili di crescita a differenti temperature La crescita dei ceppi batterici è stata testata nel range 0-45°C, con step di 5°C, su piastre di PCA con concentrazione salina pari all’optimum per ogni ceppo. La maggior parte di essi (54% ca.) mostrava l’optimum a 30°C. L’optimum più basso è stato registrato per due ceppi (S8 e S34) ed era pari a 20°C. Nessun ceppo mostrava un optimum superiore ai 35°C. La maggior parte degli isolati (64% ca.) mostrava l’optimum nel range mesofilo, ma era in grado di crescere anche a 0-5°C. Questi organismi potrebbero essere definiti come mesofili-psicrotolleranti. Solo il 3% ca. dei ceppi mostrava un optimum a 20°C e cresceva nel range 5-35°C. Questi ceppi possono essere definiti psicrotrofi. Il resto degli isolati (ca. 33%) cresceva a partire da temperature pari o superiori ai 10°C e mostrava un optimum intorno ai 30-35°C. Per questa ragione possono essere definiti mesofili. Quasi tutti i ceppi studiati potrebbero essere considerati euritermi, indicando l’adattamento ad ampie variazioni di temperatura tipiche di un ambiente come quello delle saline. Se comparati con le stesse specie descritte in letteratura, i ceppi testati mostravano un range di crescita spostato verso temperature più basse, ma gli optimum non erano molto differenti. Determinazione dei profili di crescita a differenti concentrazioni di cloruro di sodio La crescita dei ceppi è stata testata nel range 0-320‰, con step di 40‰ su piastre di PCA. Il 46% ca. dei ceppi mostrava un optimum di crescita pari a 40‰ di NaCl e ca. il 23% mostrava l’optimum ad 80‰. La maggior parte di questi ceppi (ca. 81%) non era in grado di crescere in assenza di NaCl ed il 22% cresceva in presenza di concentrazioni saline uguali o superiori a 240‰. Tra i ceppi che mostravano l’optimum a 40‰ di NaCl, alcuni (BS34, S1, S39, S46 e S48) erano in grado di crescere bene anche in assenza di sale. Potrebbero quindi essere definiti come alofili moderati normotolleranti. Circa il 31% dei ceppi mostrava un optimum pari a 0‰, ma era in grado di tollerare concentrazioni saline relativamente alte. Questi microrganismi possono essere definiti quindi alotolleranti. La maggior parte dei ceppi potrebbe essere considerata eurialina, poiché in grado di crescere in un range piuttosto ampio di salinità. Questo fa sì che l’organismo sia in grado di adattarsi all’elevata variabilità tipica di un ambiente come quello delle saline, in cui la salinità è soggetta a forti fluttuazioni. Se comparati con le stesse specie descritte in letteratura, i ceppi testati manifestano un range di crescita meno ampio. Per quanto riguarda gli optima sembrerebbe esserci invece una buona corrispondenza con i pochi dati disponibili in bibliografia. Citometria di flusso Informazioni più dettagliate concernenti l’omeostasi e lo stato fisiologico delle cellule batteriche sottoposte a differenti concentrazioni saline, sono state ottenute da studi di citometria di flusso nel range 0-280‰ con step di 40‰, per quattro ceppi di interesse (BS6, S17, S19 e S28). Per i ceppi BS6 e S28, i risultati ottenuti dalla citometria di flusso confermano quelli ottenuti con la prova di crescita su piastra. Per i ceppi S17 e S19, i risultati ottenuti dalla prova di crescita su piastra, durante la quale era stata evidenziata crescita fino a 280‰ seppur limitata a partire dai 200‰, non sono stati confermati. Per il ceppo S19 infatti, la crescita era manifestata fino a 200‰, ma con il graduale aumento della salinità era possibile notare un aumento proporzionale della sofferenza cellulare. Per il ceppo S17 invece, la crescita si arrestava repentinamente a 120‰, mostrando segni di sofferenza già dalle prime ore di incubazione. È importante sottolineare che la richiesta e la tolleranza di sale per molte specie, varia al variare delle condizioni di crescita, come ad esempio la temperatura o la composizione del terreno. Inoltre la prova di citometria di flusso è stata condotta in terreno liquido, quindi ci possono essere differenze che influiscono sulla crescita del microrganismo. Una delle più rilevanti è la diversa disponibilità di ossigeno a cui il batterio è sottoposto rispetto ad una crescita su terreno solido in piastra. Studio delle comunità batteriche La diversità batterica è stata studiata inoltre utilizzando la tecnica di fingerprinting PCR-DGGE ed i patterns di bande ottenuti sono stati comparati tra loro e sottoposti ad analisi di clusterizzazione attraverso l’utilizzo dei programmi Quantity-One e Phoretix 1D. Una singola specie è rappresentata da una singola banda e la sua abbondanza relativa è determinata dall’intensità della banda. L’analisi di clusterizzazione è stata eseguita utilizzando il metodo UPGMA ed i coefficienti di Dice e Pearson. Dall’ analisi dei gel eseguiti è stata riscontrata una notevole variabilità nei profili di fingerprinting, che non sono risultati omogenei né nel numero di bande rilevate né nella loro distribuzione all’interno del gel. Inoltre, nel corso dei diversi mesi di campionamento, i raggruppamenti all’interno dei dendrogrammi non risultavano correlati alla salinità delle vasche campionate. Questo risultato è stato confermato anche per i mesi estivi, in cui sono state rilevate le differenze più marcate tra i valori di salinità delle varie vasche. Infine, dalle analisi di clusterizzazione è emerso che le vasche in cui si sono registrati sempre i valori di salinità più elevati, non presentavano nella maggior parte dei casi un numero di bande inferiore rispetto agli altri siti nel corso dei campionamenti effettuati. Allo scopo di rappresentare graficamente l’uniformità delle comunità batteriche studiate, sono state calcolate le curve di Pareto-Lorenz basate sull’intensità delle bande presenti nei profili. Ogni profilo di DGGE è descritto da una curva che viene disegnata in un grafico in cui in ascissa è riportato il numero cumulativo normalizzato di bande e in ordinata le rispettive intensità cumulative normalizzate. Per interpretare numericamente la curva si fa riferimento alla proiezione del valore dell’asse y nel punto in cui le intensità corrispondono alla verticale del 20% sull’asse x (indice di organizzazione funzionale - Fo). Le curve di Pareto-Lorenz sono state eseguite per tutti i siti di campionamento e per i mesi di agosto 2012, marzo 2013 e maggio 2012, caratterizzati rispettivamente da salinità massima, minima e intermedia rispetto all’intero periodo di campionamento. I valori medi di Fo calcolati per i mesi di agosto e maggio 2012 (35% e 32% rispettivamente), descrivevano comunità con una medio-bassa organizzazione funzionale e con elevata uniformità, in grado quindi di reagire al mutare delle condizioni ambientali, preservando la loro funzionalità. Questi risultati sembrerebbero adattarsi all’ambiente delle saline, caratterizzato da elevata instabilità dei parametri ambientali, a cui solo una comunità con queste caratteristiche sarebbe in grado di far fronte. Per quanto riguarda il mese di marzo 2013 invece, il valore medio di Fo sale al 43%. Si tratta del mese in cui sono stati registrati i valori di salinità più bassi rispetto ai due anni di campionamento. In questo caso quindi, grazie ad un aumento delle potenzialità fisico-chimiche dei siti campionati, si è rilevato anche un aumento dell’organizzazione funzionale della comunità. Le curve di Pareto-Lorenz sono state calcolate anche per i primi due anni di campionamento per il sito vascone. L’organizzazione funzionale è risultata essere molto differente tra i vari mesi, evidenziando quindi una elevata variabilità nella struttura della comunità batterica nel tempo. Infine è stata eseguita la Moving Windows Analysis per valutare i cambiamenti nella struttura della comunità batterica presente in ciascun sito campionato, a partire dalla matrice di similarità delle curve densiometriche dei profili DGGE. Per tutte le vasche è stata rilevata una elevata dinamicità nel tempo nella composizione delle comunità batteriche presenti. NMDS (No metric multidimensional scaling) Il metodo NMDS è stato eseguito per ogni sito campionato e per tutti i mesi di campionamento, per la ricerca dei rapporti tra il set di dati biologici (conte totali e vitali, matrice delle bande DGGE e Richness) e i dati ambientali rilevati (salinità, temperatura, ossigeno disciolto, pH, clorofeopigmenti e BOD5). I diagrammi di ordinamento sono stati generati utilizzando il coefficiente di similarità Bray-Curtis. Osservando i diagrammi ottenuti è stato possibile notare che essi descrivono uno schema di ordinamento caratteristico per ciascuna delle vasche campionate e questo risultato è stato confermato anche dall’NMDS eseguita per la ricerca dei rapporti tra gli indici di biodiversità calcolati (Richness, indici di Simpson e Shannon-Wiener ed Evenness) e i dati ambientali utilizzati anche per la precedente analisi. Studio delle variazioni mensili Al termine dei due anni di campionamento a cadenza mensile, sono stati eseguiti campionamenti a cadenza settimanale per tre mesi significativi a livello stagionale (maggio 2014, settembre 2014 e febbraio 2015). In questo modo è stato possibile ottenere un confronto su un ulteriore anno di campionamento, almeno per alcuni mesi, ed è stato possibile rilevare anche le variazioni mensili per questo ambiente. I dati relativi al mese di febbraio 2015 sono ancora in fase di elaborazione. I risultati confermano quelli ottenuti con la campagna di campionamento a cadenza mensile: è stata riscontrata una elevata variabilità nella composizione delle comunità batteriche tra i vari siti e i raggruppamenti all’interno dei dendrogrammi, anche in questo caso, non risultano correlati alla salinità delle vasche campionate. Al fine di comprendere le relazioni esistenti tra le comunità batteriche di uno stesso mese nel corso dei vari campionamenti, è stata eseguita un’analisi combinata dei gel sia per il mese di maggio sia per quello di settembre. Per questi è stato possibile eseguire un raffronto per tutti e tre gli anni di campionamento. L’analisi combinata è stata eseguita utilizzando il software Phoretix 1D. I dendrogrammi relativi alla similarità dei patterns di bande sono stati calcolati utilizzando il coefficiente di Dice e l’algoritmo UPGMA. Dai dendrogrammi è stato possibile osservare che, salvo alcune eccezioni, le vasche clusterizzano tra di loro in funzione della data di campionamento. Quindi i profili per le varie vasche, prelevate allo stesso tempo, risultano più simili tra loro di quanto non lo siano i profili ottenuti per la stessa vasca nel corso dei tre anni. Studio preliminare sulle Saline di Trapani e Paceco Al fine di poter eseguire un confronto della diversità batterica tra saline attive nella produzione di sale e non, si è proceduto ad uno studio preliminare presso “Salina Chiusicella” all’interno delle Saline di Trapani e Paceco. Le analisi di clusterizzazione rilevano una differenza sostanziale con i risultati ottenuti per le saline di Tarquinia. È stato possibile infatti rilevare, in questo caso, una suddivisione netta in diversi raggruppamenti, in relazione ai valori di salinità delle vasche campionate. Inoltre, durante il mese di settembre 2014, sebbene nella maggior parte dei casi siano stati rilevati valori di salinità più elevati, è stata evidenziata una maggior diversità batterica. In entrambe le saline quindi non è stato possibile trarre una qualsiasi conclusione netta relativa all’andamento del numero di OTU al variare della salinità in questi ambienti. Questo conferma la complessità nella variazione della struttura delle comunità batteriche lungo un gradiente di salinità e suggerisce di rivalutare il ruolo del dominio batteri negli ambienti “estremi”. In this work we have studied the bacterial communities present in the water environments of “Saline di Tarquinia” Viterbo (Italy) through culture dependent and independent methods and the changes in the communities composition as a function of seasonal, climatic and nutritional variations recorded. Various studies were performed in the “Saline in Tarquinia” on the eukaryotic organisms that inhabit that environment, but the bacterial communities present have never been studied so far. In order to obtain information both at the ecological level and for possible future applications in biotechnology, the study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial communities by molecular methods (PCR-DGGE). Hyperaline ecosystems are considered as extreme environments and the solar salterns are typical examples. They are characterized by a series of interconnected ponds in which salt concentration increases progressively up to saturation. They also show a high variability of physical-chemical parameters such as temperature and salinity and dissolved oxygen, which are subject to strong fluctuations. “Saline di Tarquinia” were used for industrial salt production until 1997 and since 1980 they had been transformed into a natural reserve. They have more than 100 ponds. In order to do a comparison with a solar saltern still active in the salt production, we have carried out a preliminary study in the “Salina Chiusicella” of “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern. In “Saline di Tarquinia” the sampling campaign was planned for three years starting from May 2012. From May 2012 to April 2014 we carried out monthly sampling and in the third year we performed weekly sampling for three months: May 2014, September 2014 and February 2015. Sampling campaign consisted in the collection of water from 14 ponds with a salinity gradient. The nearby sea water was also collected as a reference. These samples represented the average of three sub-samples taken from three separate points in each site. In “saline di Trapani e Paceco” we carried out two samplings in September 2013 and September 2014 from 10 ponds with a salinity gradient. Strain isolation and preliminary tests Water samples were filtered through membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for molecular studies. Pure cultures of isolates were obtained by plate streak method on PCA (Plate Count Agar) with different salt concentration from 0 to 250‰ with steps of 50‰. Preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates and to keep 39 isolates. Taxonomical identification of isolates Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for amplification of 16S rDNA, to allow taxonomical identification of each isolate. 29 strains out of 39 (ca. 77%), were identified at species level. 26 strains of these showing high identity (99-100%). All other isolates were identified at the genus level. 29 strains out of 39, belonged to the γ-Proteobacteria class and 14 of these belonged to the Oceanospirillales order. Among these strains, the genera Halomonas and Salinivibrio were the mayority (11 and 7 isolates respectively). In particular, 7 different species have been identified in the Halomonas genus. We have also isolated strains of Enterobacteriales (genera Yersinia and Erwinia), Pseudomonadales (genera Pseudomonas and Psychrobacter), Alteromonadales (genus Idiomarina), Vibrionales (genus Salinivibrio), Rhodobacterales (genus Ruegeria), Actinomycetales (genera Rhodococcus, Nesterenkonia, Arthrobacter and Microbacterium) Bacillales (genera Bacillus, Marinococcus and Planococcus) and Aeromonadales (genus Aeromonas) orders. In addition, the 16S rDNA sequences of the studied strains were aligned between them and with highly similar 16S in the GenBank and phylogenetic analysis was performed. To get a confident branch-length, three different trees were inferred: the first for all studied strains, the second for Oceanospirillales order and the third for the other orders. Based on the results, some of the strains were identified with certainty at species level while some others, due to the branch length or the external position, probably belonged to new species. For all other strains identification was possible at genus level only. In many cases this could be due to the scarce informative power of the gene target used to discern the relations below the genus level. Temperature growth profiles The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C) with optimal NaCl concentration for each strain. Most of the strains (54% ca.) showed the optimum at 30°C. The lowest optimum was recorded at 20°C for two strain only (S8 e S34). None of them showed an optimum above 35°C. The majority of the isolates (64% ca.) showed the optimum in the mesophilic range, but they were also able to grow to 0-5°C. These organisms can be defined as mesophilic-psychrotolerant. Only 3% ca. of the strains showed the optimum at 20°C and growing in the range 5-35°C. These can be defined psychrotrophics. The rest of the isolates (ca. 33%) grew from or above 10°C and showed an optimum amount to 30-35°C. For this reason they can be defined mesophilics. Almost all the strains could be considered as eurythermics, indicating adaptation to wide temperature variations such as those of the water environments of “Saline di Tarquinia”. If compared with the same species described in the literature, the tested strains showed a growth range shifted to lower temperatures, but optima weren’t very different. Salinity growth profiles The optimal salinity for growth of the strains were tested in the range 0-320‰ on PCA plates (steps of 40‰) at 25°C. Approximately 46% of the strains showed an optimum of growth at 40‰ of NaCl and about 23% showed the optimum at 80‰. Most of these strains (ca. 81%) was not able to grow in the absence of NaCl and 22% ca. grew in the presence of salt concentrations equal or greater than 240‰. Among the strains that showed the optimum growth at 40‰ of NaCl, there were some (BS34, S1, S39, S46 and S48) that were able to grow well even in the absence of salt. They could be defined as moderate halophilics normotolerant. Approximately 31% of all strains showed the optimum to 0‰, but were able to tolerate relatively high salt concentrations. These microorganisms can be define halotolerants. Almost all the strains could be considered as euryhaline, indicating adaptation to wide salinity variations such as those of Saline di Tarquinia. If, compared with the same species described in the literature, the strains tested showed a less wide growth range. With regard to the optimum, it would seem to be a good match with the limited data available in the literature. Flow cytometry More detailed information concerning homeostasis and physiological state of each bacterial cell, submitted to different conditions of salinity, was obtained by flow cytometry in the range 0-280‰, with steps of 40‰, for four strains of interest (BS6, S17, S19 and S28). For BS6 and S28 strains, the results obtained by flow cytometry confirmed those obtained with the test of growth on plate. For S17 and S19 strains, the results obtained from the test plate, in which was highlighted growth up to 280‰, although limited from 200‰, were not confirmed. In fact, for S19 strain the growth was manifested up to 200‰ but at the gradual increase in salinity it is possible to notice a proportional increase in the cellular suffering. For S17 strain, the growth stopped at 120‰, showing signs of suffering from the first hours of incubation. This is because the request and the tolerance of salt for many species, varies with growth conditions, such as temperature or composition of medium. The flow cytometry was performed in liquid medium (LB), so there may be differences that affect the growth of the organism. One of the most important is the varying availability of oxygen to which the bacterium is subjected compared to growth on solid medium in the plate. Study on the bacterial communities The bacteria biodiversity was studied by PCR-DGGE fingerprinting of partial 16S-rRNA gene amplicons. DGGE band patterns, representing the various species present in the communities, were compared and clustered using Quantity-One and Phoretix 1D software. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by the band intensity. The cluster analysis was performed using the method UPGMA and Dice and Pearson coefficients. From the analysis of the gel it was possible to find a considerable variability in the profiles of fingerprinting, which were not homogeneous neither in the number of bands nor in the distribution of these within the gel. In addition, in the course of several months of sampling, the clusters within the dendrograms were not related to the salinity of the ponds sampled and this has been confirmed also for the summer months, when the largest differences between the values of salinity of the ponds were found. Moreover, it emerged by the clustering analysis that the ponds with high salinity didn’t not present in most of the cases a number of bands less than the other sites during the sampling conducted. To render a graphic representation of the bacterial communities evenness, Pareto-Lorenz distribution curves were drawn based on the intensities of bands in the profiles for three months: August 2012, March 2013 and May 2012, respectively characterized by salinity maximum, minimum and intermediate compared to the whole sample period. The functional community redundancy (response to perturbing environmental conditions) is evaluated by the Functional organization index (Fo) considering curves slope. Results for the months of August and May 2012 (35% and 32% respectively) showed communities with medium-low Fo and a high evenness. In other words, due to the elevated concentration of some species and the availability of many others, the community can potentially deal with environmental conditions changes thus preserving its functionality. These results would seem to adapt to the environment of the solar salterns, characterized by high instability of the environmental parameters that only a community with these features would be able to face. In March 2013 the value was of 43%, therefore due to an increase of the potential physical and chemical properties of the sampled sites, there is also an increase of the functional organization of the community. Pareto-Lorenz distribution curves were drawn also for the first two sampling years for the bacterial community of the vascone pond. The functional organization was very different during the years, therefore there was a high variability in the structure of the community in the time. The Moving Window Analysis was performed to evaluate the changes in the structure of the bacterial community in a single ponds between one month and the next. The variability in the composition of community for the various ponds was very high as highlighted also by the analysis of DGGE gel. Statistical analyses NMDS (No metric multidimensional scaling) NMDS method was performed to search for patterns in the set of biological data (viable and total count, DGGE band matrix and Richness) and to assess their relationship with the environmental data (water salinity and temperature, BOD5, pH, dissolved oxygen and chlorophyll pigments). Looking at the diagrams obtained it was possible to observe that they described a sorting scheme characteristic for each sampled site and this result was confirmed also by NMDS to search for patterns in the set of Biodiversity index (richness, Shannon-Wiener index, Simpson index and evenness) and to assess their relationship with the same environmental data of the previous analysis. Weekly sampling At the end of the monthly sampling, we performed weekly ones for three months in different seasons (May 2014, September 2014 and February 2015). In this way it was possible to obtain a comparison of an additional year of sampling at least for a few months and it was possible to detect even the monthly changes for this environment. The data for the month of February 2015 are still being processed. Weekly sampling have confirmed the results obtained with the monthly sampling. It was highlighted a high variability in the composition of bacterial community among the ponds and, the clusters within the dendrograms do not seem related to the salinity of the sampled ponds. In order to understand the relationships between the bacterial communities of a month over the years of sampling, a combined analysis of the gels was performed for the months of May and September. For these it was possible to perform a comparison for all three years of sampling. The dendrograms related to the similarity of the patterns of bands were calculated using the Dice coefficient and UPGMA algorithm with Phoretix 1D software. Observing both dendrograms it can be seen that, with some exceptions, the ponds group between them according to the date of sampling. Therefore the profiles for the various ponds, taken at the same time, are more similar to each other than the profiles obtained for the same pond in the course of three years. Preliminary study on “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern In order to make a comparison with a solar saltern still active in the salt production, we have carried out a preliminary study in the “Salina Chiusicella” of “Saline di Trapani e Paceco” solar saltern. Clustering analysis revealed a substantial difference with the results obtained for the “Saline di Tarquinia”. Looking at the dendrograms in fact, it was possible to detect a clear division into different groupings, in relation to salinity values of the sampled ponds. In addition, during the month of September 2014, although in most cases higher salinities were detected than in the month of September 2013, we could observe a greater number of bands in the fingerprinting profiles and therefore a greater bacterial biodiversity. In both sites, it was not possible to draw any conclusion concerning the trend of the number of OTU varying the salinity in these environments. This confirms the complexity of the change in structure of bacterial communities along the salinity gradient and suggests to revalue the role of the domain bacteria in "extreme" environments. Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche

Floodplains are among the most valuable and the most degraded ecosystems in Europe. The Kopački rit Nature Park is situated in northeastern Croatia, between courses of the Danube and the Drava Rivers. The appearance of the whole area and rich biodiversity depends on the flooding regime of the Danube River, while the Drava River has much less importance. This area is protected since 1967, and proclaimed as nature park in 1999 on the surface of 231 km2. In 1993 it is listed among wetlands of international importance(Ramsar area). Tradition of hunting the particular wild animal species: red deer (Cervus elaphus), roe deer (Capreolus capreolus) and wild boar (Sus scrofa) in this part of Croatia dates back more than 300 years. Wildlife management with a purpose of breeding, protection and hunting the game animals is carried out since 1781, when this area was part of the large Belje Estate. Through active management over hundred of years a significant growth in population size of game animals has been achieved, and this area became a hunting resort known all over Europe and the world. Nowadays, wildlife management and hunting activities within the boundaries of the Kopački rit Nature Park are implemented according to Croatian nature protection legislation. Main threats to wildlife management are anthropogenic impact, habitat loss or degradation, more frequent occurrence of extreme weather and hydrological events, and water-borne diseases.

Parasitic diseases are permanently present in wild animals living in natural habitats. The giant liver fluke (Fascioloides magna)is one of the most pathogenic helminths parasitizing a number of mammalian species (primarily ruminants), causing a severe health problems, often leading to death. Specific distribution route of this endoparasite from Central towards Southeast Europe mainly follows the inundation area of the Danube River, where the seasonal migration of red deer (Cervus elaphus) is possible, and intermediate host, a freshwater snail (Lymnaea truncatula) is present. The giant liver fluke was firstly discovered in Croatia in January 2000, during liver examination of red deer hunt in the hunting ground located in the floodplain of the Danube River. It can be confirmed that developmental stages of the giant liver fluke were introduced in Croatia by migration of invaded red deer, and by freshwater snails deposited with floods during the high water-level episodes. Appropriate treatment of parasitic disease has been tried but with limited success. The risk of infection is still present, which was confirmed by dissection of the red deer hind found dead in April 2015, when about 60 liver flukes were taken from the liver. Proper application of zoo-hygienic measures in hunting grounds, combined with antiparasitic treatment of free ranging red deer population and captive deer is important to restrain the further spread of fascioloidosis in Croatia.