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against glutamine synthetase of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 immunoreacted with glutamine synthetase from the N2-fixing heterotrophic bacterium Azotobacter chroococcum. In Western-blotting experiments this antibody recognized a single protein of a molecular mass of 59 kDa corresponding to glutamine synthetase subunit. This protein was in vivo-labelled in response to addition of ammonium, both [3H]adenine and H332PO4 preincubation of the cells being equally effective. Nevertheless, the amount of glutamine available nitrogen source. Modified, inactive glutamine synthetase was re-activated by treatment with snake-venom phosphodiesterase but not by alkaline phosphatase. LMethionine-DL-sulphoximine, an inhibitor of glutamine synthetase, prevented the enzyme from being covalently modified. We conclude that, in A. chroococcum, glutamine synthetase is adenylylated in response to ammonium and that for the modification to take place ammonium must be metabolized.

Trabajo presentado para optar al título de Doctora en Biología por la Universidad de Sevilla. 2019

La regulación redox del metabolismo cloroplastídico desempeña un papel crucial en la adaptación de las plantas a las condiciones lumínicas. En este mecanismo regulatorio, que consiste en intercambios disulfuro-ditiol que afectan a la conformación y actividad de las proteínas dianas, juegan un papel muy importante las tiorredoxinas (Trxs). En el cloroplasto existe una gran variedad de Trxs, agrupadas en distintas familias (f, m, x, y, z), cuyo poder reductor proviene de la ferredoxina reducida a través de una ferredoxina-tiorredoxina reductasa y, por tanto, la actividad de estas Trxs se encuentra íntimamente ligada al transporte fotosintético de electrones (Meyer et al., 2005; Schurmann and Buchanan, 2008). Existe un sistema redox adicional en el cloroplasto, NTRC, que puede utilizar poder reductor proveniente del NADPH (Serrato et al., 2004), por lo que su actividad no depende exclusivamente de la fotosíntesis. NTRC incluye tanto un dominio Trx como un dominio NADPH-Trx reductasa (NTR) (Serrato et al., 2004; Perez-Ruiz and Cejudo, 2009). Las Trxs del cloroplasto están implicadas en diversos procesos metabólicos y también en la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Tanto NTRC como las Trxs de tipo x son eficientes reductores de la 2-Cys peroxiredoxina por lo que tienen función destoxificante (Collin et al., 2003; Perez-Ruiz et al., 2006). Por otro lado, las Trxs tipo m y f, tienen una mayor implicación en la regulación de enzimas que participan en rutas metabólicas tales como malato deshidrogenasa dependiente de NADP (NADP-MDH) y fructosa 1,6-bifostatasa (FBPasa) (Collin et al., 2003). Debido a esta actividades, se ha propuesto que las Trxs cloroplásticas actúan como sensores del estrés lumínico, ya que su estado redox depende del transporte fotosintético de electrones (Li et al., 2009). Así, ante un exceso de luz, es decir, cuando la energía lumínica que absorbe excede su capacidad de utilización en fotoquímica, en el cloroplasto se activan mecanismos de defensa como la disipación de energía en forma de calor (NPQ, “non-photochemical quenching”), evitando una excesiva producción de ROS perjudicial para la planta (Muller et al., 2001; Szabo et al., 2005), proceso que podría tener un control redox mediado por Trxs. El objetivo central de este trabajo ha sido el estudio de la función de sistemas redox del cloroplasto, NTRC y las Trx de tipo f, en los mecanismos de adaptación de las plantas frente a estrés lumínico. Para abordar este objetivo hemos utilizado plantas de Arabidopsis thaliana carentes de NTRC, las cuales son sensibles a distintos estreses abióticos (Serrato et al., 2004; Perez-Ruiz et al., 2006; Chae et al., 2013). A pesar de que el fenotipo de este mutante es dependiente de luz (Perez-Ruiz et al., 2006; Lepisto et al., 2009), no muestran más sensibilidad que las plantas silvestres a alta luz. Sin embargo, el mutante ntrc presenta un nivel anormalmente elevado de NPQ, concretamente del componente dependiente de energía, qE, con un mayor gradiente de protones trans-tilacoidal y diez veces más zeaxantina, lo que disminuye la actividad del fotosistema II y el transporte lineal de electrones. Para comprobar el impacto de esta elevada disipación de energía en el mutante ntrc hemos construido un doble mutante ntrc-psbs carente de qE. Estas plantas recuperan parcialmente el fenotipo del mutante ntrc en cuanto a crecimiento y nivel de clorofila, así como, la actividad del fotosistema II. Dichos resultados revelan un nuevo papel para NTRC en el control de la fotosíntesis. Con el fin de dilucidar el papel de las Trxs f in vivo, hemos generado un doble mutante de Arabidopsis thaliana llamado trxf1f2, que carece de las dos isoformas de Trx f, Trx f1 y Trx f2, presentes en Arabidopsis. Sorprendentemente, a pesar del papel central atribuido a estas Trxs en el metabolismo del carbono, el mutante trxf1f2 presenta un fenotipo visualmente indistinguible de las plantas silvestres en condiciones de día largo y únicamente su crecimiento aparece ligeramente retardado en día corto. Sin embargo, la ausencia de Trx f in vivo tiene especial repercusión en la rápida activación del ciclo de Calvin en los primeros minutos de iluminación tras una transición luz-oscuridad. El mutante trxf1f2 presenta un retraso en la activación de la fotosíntesis, con el consecuente aumento del NPQ inicial, así como en el tiempo medio para alcanzar la máxima tasa de fijación de carbono, debido a una reducción más lenta de enzimas del ciclo de Calvin tales como la FBPasa y la Rubisco activasa, después de una transición luz-oscuridad. No obstante, dichas enzimas llegan a reducirse parcialmente en las plantas carentes de Trx f, sugiriendo que otros sistemas redox del cloroplasto están también implicados en su reducción. Hemos establecido que las Trxs f funcionan en la activación rápida de enzimas de la asimilación del carbono en respuesta a luz y que esta función no se compensa totalmente por otros sistemas redox del cloroplasto

La regulación redox del metabolismo cloroplastídico desempeña un papel crucial en la adaptación de las plantas a las condiciones lumínicas. En este mecanismo regulatorio, que consiste en intercambios disulfuro-ditiol que afectan a la conformación y actividad de las proteínas dianas, juegan un papel muy importante las tiorredoxinas (Trxs). En el cloroplasto existe una gran variedad de Trxs, agrupadas en distintas familias (f, m, x, y, z), cuyo poder reductor proviene de la ferredoxina reducida a través de una ferredoxina-tiorredoxina reductasa y, por tanto, la actividad de estas Trxs se encuentra íntimamente ligada al transporte fotosintético de electrones (Meyer et al., 2005; Schurmann and Buchanan, 2008). Existe un sistema redox adicional en el cloroplasto, NTRC, que puede utilizar poder reductor proveniente del NADPH (Serrato et al., 2004), por lo que su actividad no depende exclusivamente de la fotosíntesis. NTRC incluye tanto un dominio Trx como un dominio NADPH-Trx reductasa (NTR) (Serrato et al., 2004; Perez-Ruiz and Cejudo, 2009). Las Trxs del cloroplasto están implicadas en diversos procesos metabólicos y también en la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Tanto NTRC como las Trxs de tipo x son eficientes reductores de la 2-Cys peroxiredoxina por lo que tienen función destoxificante (Collin et al., 2003; Perez-Ruiz et al., 2006). Por otro lado, las Trxs tipo m y f, tienen una mayor implicación en la regulación de enzimas que participan en rutas metabólicas tales como malato deshidrogenasa dependiente de NADP (NADP-MDH) y fructosa 1,6-bifostatasa (FBPasa) (Collin et al., 2003). Debido a esta actividades, se ha propuesto que las Trxs cloroplásticas actúan como sensores del estrés lumínico, ya que su estado redox depende del transporte fotosintético de electrones (Li et al., 2009). Así, ante un exceso de luz, es decir, cuando la energía lumínica que absorbe excede su capacidad de utilización en fotoquímica, en el cloroplasto se activan mecanismos de defensa como la disipación de energía en forma de calor (NPQ, “non-photochemical quenching”), evitando una excesiva producción de ROS perjudicial para la planta (Muller et al., 2001; Szabo et al., 2005), proceso que podría tener un control redox mediado por Trxs. El objetivo central de este trabajo ha sido el estudio de la función de sistemas redox del cloroplasto, NTRC y las Trx de tipo f, en los mecanismos de adaptación de las plantas frente a estrés lumínico. Para abordar este objetivo hemos utilizado plantas de Arabidopsis thaliana carentes de NTRC, las cuales son sensibles a distintos estreses abióticos (Serrato et al., 2004; Perez-Ruiz et al., 2006; Chae et al., 2013). A pesar de que el fenotipo de este mutante es dependiente de luz (Perez-Ruiz et al., 2006; Lepisto et al., 2009), no muestran más sensibilidad que las plantas silvestres a alta luz. Sin embargo, el mutante ntrc presenta un nivel anormalmente elevado de NPQ, concretamente del componente dependiente de energía, qE, con un mayor gradiente de protones trans-tilacoidal y diez veces más zeaxantina, lo que disminuye la actividad del fotosistema II y el transporte lineal de electrones. Para comprobar el impacto de esta elevada disipación de energía en el mutante ntrc hemos construido un doble mutante ntrc-psbs carente de qE. Estas plantas recuperan parcialmente el fenotipo del mutante ntrc en cuanto a crecimiento y nivel de clorofila, así como, la actividad del fotosistema II. Dichos resultados revelan un nuevo papel para NTRC en el control de la fotosíntesis. Con el fin de dilucidar el papel de las Trxs f in vivo, hemos generado un doble mutante de Arabidopsis thaliana llamado trxf1f2, que carece de las dos isoformas de Trx f, Trx f1 y Trx f2, presentes en Arabidopsis. Sorprendentemente, a pesar del papel central atribuido a estas Trxs en el metabolismo del carbono, el mutante trxf1f2 presenta un fenotipo visualmente indistinguible de las plantas silvestres en condiciones de día largo y únicamente su crecimiento aparece ligeramente retardado en día corto. Sin embargo, la ausencia de Trx f in vivo tiene especial repercusión en la rápida activación del ciclo de Calvin en los primeros minutos de iluminación tras una transición luz-oscuridad. El mutante trxf1f2 presenta un retraso en la activación de la fotosíntesis, con el consecuente aumento del NPQ inicial, así como en el tiempo medio para alcanzar la máxima tasa de fijación de carbono, debido a una reducción más lenta de enzimas del ciclo de Calvin tales como la FBPasa y la Rubisco activasa, después de una transición luz-oscuridad. No obstante, dichas enzimas llegan a reducirse parcialmente en las plantas carentes de Trx f, sugiriendo que otros sistemas redox del cloroplasto están también implicados en su reducción. Hemos establecido que las Trxs f funcionan en la activación rápida de enzimas de la asimilación del carbono en respuesta a luz y que esta función no se compensa totalmente por otros sistemas redox del cloroplasto

Texto completo descargado en Teseo NTRC es una NADPH tiorredoxina reductasa peculiar que posee un dominio tiorredoxina en su extremo C-terminal (Serrato et al., 2004). En Arabidopsis se ha demostrado que el gen NtrC se expresa tanto en tejidos fotosintéticos como no fotosintéticos y que la proteína se localiza en todo tipo de plastos (Kirchsteiger et al., 2012). En el cloroplasto NTRC participa en la destoxificación de peróxidos actuando como principal reductor fisiológico de 2-Cys Prxs (Moon et al., 2006; Perez-Ruiz et al., 2006), sin embargo, cada vez son más las evidencias que demuestran que NTRC participa en la regulación redox de otros procesos como son la síntesis de almidón (Michalska et al., 2009), la síntesis de aminoácidos aromáticos (Lepisto et al., 2009) o la síntesis de clorofilas (Stenbaek and Jensen, 2010). El objetivo principal de este trabajo ha sido la identificación de procesos sometidos a regulación redox mediada por NTRC en tejidos heterotróficos de plantas de interés agronómico. Para ello, el primer objetivo ha sido determinar el patrón de expresión del gen NtrC en semillas de cereales. Se pudo comprobar la presencia de NTRC semillas de cereales en desarrollo y en geminación, si bien, la proteína identificada presenta características peculiares respecto a la de tejidos fotosintéticos. La comprobación de la presencia de NTRC en semillas de cereales permitió llevar a cabo el segundo objetivo, la identificación de las funciones de NTRC en este tejido. Mediante dos aproximaciones proteómicas diferentes se identificaron un elevado número de posibles proteínas diana de NTRC en dicho tejido, sugiriendo la implicación de la enzima en una amplia variedad de procesos como son el metabolismo de carbohidratos, ácidos grasos y aminoácidos; síntesis y transformación de ATP; síntesis y degradación de proteínas; entre otros. Del análisis de estas dianas se dedujo que la función más relevante de NTRC en este tejido es el metabolismo del almidón, participando tanto en la síntesis como en la degradación, y se escogió a la sacarosa sintasa (SUS), identificada repetitivamente como posible diana de NTRC en endospermo de cereales, para el estudio de su posible regulación redox mediada por NTRC. La SUS es una enzima que juega un papel esencial en los órganos heterotróficos de la planta al canalizar la sacarosa importada desde los órganos fotosintéticos hacia la síntesis de almidón y polisacáridos de la pared celular, controlando así la fuerza sumidero de dichos órganos (Koch, 2004). La actividad enzimática de la SUS está regulada por fosforilación de un residuo de serina del extremo N-terminal (Huber et al., 1996; Zhang and Chollet, 1997) y por la formación reversible de puentes disulfuro (Pontis et al., 1981; Rohrig et al., 2004; Marino et al., 2008), aunque el mecanismo implicado en esta regulación redox se desconoce. La identificación de la SUS entre las posibles dianas de NTRC en endospermo de semillas de cereales sugería la participación de NTRC en la regulación redox de su actividad. Para llevar a cabo los estudios de la posible regulación redox de la actividad SUS se desarrolló un método de expresión heteróloga y purificación de las isoformas SUS1, SUS2 y SUS3 de arroz que permitió la obtención de dichas enzimas recombinantes parcialmente purificadas y catalíticamente activas. Del análisis de su actividad se pudo comprobar que las isoformas de SUS de arroz analizadas modulan su actividad en función del estado redox aunque no se pudo establecer la participación de NTRC en dicha regulación.

El objetivo central de este trabajo ha sido el estudio del gen NtrC de arroz. Para ello se plantearon los siguientes objetivos: 1. Caracterización de la familia génica Ntr de arroz mediante el estudio de las relaciones filogenéticas y el análisis de la expresión diferencial de los distintos miembros. 2. Clonación y caracterización bioquímica de NTRC. Estudio del mecanismo de acción y de la estructura cuaternaria de la enzima. 3. Localización subcelular de NTRC en arroz y estudio de la posible función de NTRC en plantas. CONCLUSIONES 1. La familia génica de NTR de arroz está compuesta por tres genes. Dos de ellos codifican para NTRs de tipo procariota, muy relacionados con proteínas homólogas de hongos y bacterias. El tercer gen, NtrC, exclusivo de organismos fotosintéticos, es un nuevo tipo de enzima, probablemente de origen endosimbionte. 2. La estructura primaria de NTRC contiene los elementos característicos de las NTRs de plantas y motivos adicionales; una posible secuencia señal en el extremo N-terminal y un dominio tipo tiorredoxina en el extremo C-terminal que incluye un sitio activo canónico. La caracterización bioquímica de la proteína mostró que se trata de una enzima bifuncional, con actividades tiorredocina reductada dependiente de NADPH y tiorredoxina. La funcionalidad de cada dominio reside en el par de cisteínas que conforman cada sitio redox. 3. Se han identificado de splicing alternativo en OsNtrC, que generan transcritos maduros con diferencias en la secuencia final del mensajero. El splicing constitutivo del gen produciría un mRNA que codifica para una proteína de localización cloroplastídica. Así, ensayos de fraccionamiento subcelular identificaron la proteína en el estroma y tilacoide de arroz. Aunque el gen se expresa en tejidos no fotosintéticos, la proteína solo ha sido detectada en tejidos verdes. 4. La estructura cuaternaria de NTRC alterna entre un estado oligomérico y una forma dimérica, en un equilibrio dinámico regulado por piridín nucleótidos. La unidad mínima catalítica de la enzima es el dímero, a través de un mecanismo de transferencia de electrones entre dominios de monómeros diferentes. 5. NTRC constituye un sistema NTR/Trx con elevada eficiencia en la reducción de BAS1, una 2-Cys Prx implicada en la detoxificación del cloroplasto. Este hecho, unido al fenotipo observado en ausencia de NTRC en Arabidopsis indica que NTRC constituiría un sistema alternativo en la detoxificación del cloroplasto.

El objetivo de este proyecto de Tesis ha sido profundizar en el estudio de la implicación de la Fosfoenolpiruvato Carboxilasa (PEPC) en la respuesta a estreses abióticos en plantas. Para ello, se han estudiado los efectos de diversos estreses abióticos (s

En este trabajo se ha desarrollado un estudio del sistema NADP/Tiorredoxna constituido por una Tiorredoxina H una RADPH Tiorredoxina reductosa (NTR), fundamentalmente en la semilla de trigo. Los puntos principales del estudio han sido: ... nt-family: 'Ti

Los cereales son los cultivos agrícolas más importantes del mundo. La producción toral de los ocho tipos más abundantes (trigo, maíz, arroz, cebada, sorgo, avena, mijo y centeno, en orden decreciente de importancia) excede de 1600 millones de toneladas métricas (según datos de la FAO, 1982). De ellos, la producción anual mundial de trigo es de más de 550 millones de toneladas métricas, siendo su superficie de cultivo de 220 millones de hectáreas, y el valor de mercado de 60000 millones de dólares (datos tomados de Vasil et al., 1992). Durante la formación de la semilla las células del endospermo de reserva se especializan en la síntesis y acumulación de compuestos de reserva, fundamentalmente almidón, que constituye hasta el 82% del peso seco de la semilla, y proteínas, que constituyen en torno al 13% dependiendo de la variedad y las condiciones de cultivo (Robinson, 1987). Las proteínas de reserva de la semilla de trigo son de dos clases: gliadinas, una compleja mezcla de proteínas con peso molecular entre 30 y 70 kDa, y gluteninas, menos solubles que las anteriores, son agregados de peso molecular entre 200 y 20000 kDa (Blackman y Payne, 1987). Estas proteínas son las responsables de la extensibilidad (gliadinas) y elasticidad (gluteninas) de la harina que se obtiene del trigo, propiedades que la hacen especialmente adecuada en la industria panadera. A causa de que la mayoría del trigo se usa en alimentación, este constituye una fuente importante de proteínas en la dieta mundial, a pesar de su relativamente bajo contenido en proteína (usualmente entre 8 y 15%) y de su deficiencia en algunos aminoácidos esenciales (principalmente lisina). En los países industrializados el consumo de pan cubre el 50% de las necesidades de carbohidratos, un tercio de las necesidades de proteínas y dos tercios de las de vitaminas del grupo B. En los países asiáticos, los cereales contribuyen en un 65% a la proteína de la dieta, y el trigo solo en un 48%. La importancia nutricional de las proteínas del trigo, potenciada por algunas épocas de escases alimentaria en determinadas partes del mundo, ha estimulado la investigación de la genética y biosíntesis de las mismas de trigo (Kasarda et al., 1976). Más recientemente las proteínas de reserva han sido utilizadas como sistemas para el estudio de la organización y expresión de genes en plantas (Shewry y Miflin, 1985; Shewry et al., 1995). La calidad nutritiva del trigo viene determinada por la estructura y composición de las proteínas de reserva almacenadas en el endospermo. Recientemente se han obtenido las primeras plantas de trigo establemente transformadas y fértiles (Vasil et al., 1992), abriéndose la posibilidad de manipular la cantidad relativa de las proteínas de reserva y su composición. Las iniciativas encaminadas a mejorar el rendimiento y la productividad del trigo permiten esperar un impacto significativo en la agricultura internacional. CONCLUSIONES 1. Se han identificado por tinción de actividad en gel hasta 20 endoproteasas en extractos de semillas tras 5 d de imbibición. Entre ellas hay un grupo de tiol-proteasas ácidas, que se detectan en el endospermo de reserva y que se sintetizan en capaz de aleurona en respuesta a GA3. 2. Se han purificado tres tiol-proteasas de semillas de trigo tras 5 d de germinación: una de 28 kDa de peso molecular, EP28, hasta la homogenidad electroforética; y las otras dos, EP55 y EP33, de 55 y 33 kDa de peso molecular, respectivamente, parcialmente purificadas. Una mezcla de EP285, EP55 y EP33 es capaz de digerir la gliadina in vitro. 3. Las giberelinas coordinan espacio-temporalmente todos los eventos que tienen lugar durante la germinación de la semilla de trigo: expresión de genes dependientes de GA, variaciones de pH en el endospermo, síntesis y secreción de proteasas al endospermo, degradación de las gliadinas y muerte celular de la capa de aleurona. 4. En los órganos emergentes de la semilla de trigo, radícula y coleptilo, también se han detectado actividades proteolíticas. La tiol-proteasa análoga a la catepsina B se expresa en la radícula y el coleptilo de la semilla de 2 d tras la germinación. En la raíz se detecta concretamente en las células epidérmicas de la zona no meristemática. 5. Se han identificado por tinción de actividad en gel hasta 12 endoproteasas neutras y 6 endoproteasas, ácidas en extractos de semillas, de trigo de 10-30 DPA. La mayor parte de las endoproteasas neutras son serín-proteasas y se localizan en la fracción embrión-aleurona-testa, mientras que las ácidas son tiol-proteasas y se localizan en la fracción endospermo-subaleurona. 6. La carboxipeptidasa III y la tiol-proteasa análoga a la catepsina B, propias de la germinación, también se expresan durante el desarrollo de la semilla de trigo. Ambas se expresan en el tejido nucelar de semillas de 16 DPA, y la tiol-proteasa se detecta también en la ruta postfloemática de transferencia de fotoasimilados, concretamente en las proyecciones nucelares y en las células de aleurona modificadas.

Azotobacter chroococcum se caracteriza por su capacidad de utilizar distintas fuentes de nitrógeno, lo que le obliga a regular fuertemente la asimilación de los distintos compuestos nitrogenados. En este trabajo se ha caracterizado, como primer objetivo, el transporte de nitrato (nitrito). Mediante aproximaciones bioquímicas y fisiológicas se ha establecido que dicho transporte se lleva a cabo a través de un sistema sensible a choque osmótico y multicomponente, formado por un complejo de membrana más un componente periplásmico. El complejo de membrana está constituido, al menos, por tres polipéptidos de 52, 49 y 44 KDA. A continuación se abordo el estudio de la inhibición por amonio de la actividad nitrogenasa en Azotobacter chroococcum y se estableció que esta medida al menos por la acción de dos mecanismos de regulación posttraduccionales, siendo uno de ellos una ADP-RIBOSILACION de la FE-PROTEINA de la nitrogenasa. Por último se estudio la regulación de la glutamina sintetasa de este organismo, observándose que se lleva a cabo fundamentalmente a nivel de actividad más que de síntesis. La actividad glutamina sintetasa se regula por un sistema reversible de adenililación/deadenililación.