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Este documento contiene archivo en PDF. La presente tesis de grado propone un Modelo de Gestión de Buenas Prácticas de Manufactura en la producción de Bebidas No Alcohólicas para conseguir la inocuidad de los productos, en el caso práctico Aguas Aromáticas del Ecuador S. A. Se aplicó la metodología descriptiva, deductiva, cuantitativa, con base en la aplicación del Check List, que evidenció los siguientes resultados: el bloque de los equipos y utensilios fue el de mayor cumplimiento en la lista de verificación de los requisitos de las Buenas Prácticas de Manufactura con el 87,50% de cumplimiento que según la escala valorada fue considerado aceptable; el bloque inherente al aseguramiento de la calidad obtuvo la calificación más baja (4,17% de cumplimiento), debido a que la empresa carece de un Manual del Sistema de la Calidad, mientras que las operaciones de producción fueron el segundo bloque de menor puntaje con 7,14% de cumplimiento, debido a la carencia de documentación y controles en el proceso productivo, además que la empresa no ha implementado el HACCP durante las etapas de la elaboración del producto beco – horchata; obteniéndose una calificación general de 37,50% que indicó bajo nivel de cumplimiento de los requisitos de las Buenas Prácticas de Manufactura, lo cual constituye un severo problema para la competitividad de la compañía. Por este motivo se planteó como propuesta la elaboración del Modelo de Gestión de BPM, con base en las normas BPM y en las normas NTE INEN 2392:2007 para la elaboración de bebidas aromáticas, sustentada en la metodología PML y en el ciclo de mejoramiento continuo. This thesis proposes a management model of Good Manufacturing Practices in the production of non-alcoholic beverages looking for the harmlessness of products, in the study case of Aromatics Waters of Ecuador S.A.; descriptive, deductive, and quantitative methodologies were applied, based on the application of check list, which showed the following results: block equipment and utensils had the highest fulfillment in the requirements checklist of the of Good Manufacturing Practices with the 87.50% of compliance valued according to the scale was considered acceptable; the safety quality inherent block had the lowest score (4.17% compliance), because the company lacks a Quality System Manual, while the production operations were the second lowest scored block with a 7.14% compliance due to the lack of documentation and controls in the production process. The company also has not implemented the HACCP during the stages of developing the product Beco - Horchata; yielding an overall rating of 37.50% indicating low level of compliance with the requirements of Good Manufacturing Practices, which is a severe problem for the competitiveness of the company. For this reason, a proposal to the development Management Model BPM, based on GMP and NTE INEN 2392: 2007 standards are proposed for the production of aromatic drinks, based on the PML methodology and the cycle of continuous improvement

The present research work entitled "Biological Value VITALR HN commercial product used in Artificial Nutrition, for which we used the method of net protein utilization (NPU), were used ten copies of Rattus rattus var. norvegicus, food was administered for 10 days, then calculated the amount of nitrogen consumed and the amount of nitrogen excreted in urine and feces, later Biological value was calculated. After analyzing the results concluded that commercial product proteins VITALR HN is 97.54% +/- 2.77%. El presente trabajo de investigación intitulado “Valor Biológico del producto comercial VITALR HN” utilizado en Nutrición Artificial, para lo cual se empleó el método de Utilización Protéica Neta (NPU), se utilizaron diez ejemplares de Rattus rattus var. norvegicus, se hizo un estudio en ratas en crecimiento, a las que se les administró el alimento por 10 días, luego se calculó la cantidad de nitrógeno consumido y la cantidad de nitrógeno eliminada por orina y heces, con ello posteriormente se calculó el Valor biológico. Después del análisis de los resultados de llegó a la conclusión que las proteínas del producto comercial VITALR HN es de 97.54% +/- 2.77%. Tesis

Realizar la pre-producción, producción y postproducción de un montaje radiofónico dentro del formato dramático, sobre elementos teóricos de la radio partiendo del cuento “El Gato negro” del libro “Relatos Edgar Allan Poe” en busca de generación de imágenes radiofónicas sobre el radioescucha Incluye bibliografía, anexos

Digital, El desarrollo de nuevas estrategias para reducir el uso de antibióticos tradicionales ha sido un tema de interés mundial, debido a la resistencia que generan microorganismos multirresistentes, entre ellos E. coli, como agentes etiológicos de diversas enfermedades. Los péptidos antimicrobianos se presentan como una alternativa para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por este tipo de microorganismos. Los péptidos Ib-M cumplen con las características para ser empleados como compuestos antimicrobianos, sin embargo, es necesario utilizar estrategias que generen protección y resistan las condiciones a las que se expone en un sistema biológico. Por lo tanto, en este estudio se realizó la síntesis de nanopartículas de Alginato y Quitosan (Nps Alg-Chi) mediante la técnica de gelificación iónica para inmovilizar los péptidos Ib-M y formar los bioconjugado Ib-M/Alg-Chi. Las características estructurales de las nanopartículas se determinaron mediante SEM, DLS y FT-IR. Se evaluó la actividad biológica contra E. coli ATCC 25922 y células de mamífero Vero, y la estabilidad a temperatura, pH y proteasas de los Ib-M e Ib-M/Alg-Chi. Los resultados mostraron aglomerados de nanopartículas con tamaños promedio de 150nm; la CMI determinada correspondió a 12,5μM en el Ib-M1 y 25μM para el Ib-M2 e Ib-M6, las cuales se mantuvieron en el bioconjugado, y la citotoxicidad con valores cercanos al 40%. La estabilidad se mantuvo frente al pH y a temperatura y en proteasas solo se evidenció frente a pepsina en Ib-M/Alg-Chi. Los resultados son prometedores para utilizar los Ib-M e Ib-M/Alg-Chi como posibles agentes antimicrobianos., The development of new strategies to reduce the use of traditional antibiotics has been a topic of global interest, due to the resistance generated by multiresistant microorganisms, including E. coli, as etiological agents of various diseases. Antimicrobial peptides are presented as an alternative for the treatment of infectious diseases caused by this type of microorganisms. Ib-M peptides meet the characteristics to be used as antimicrobial compounds, however, it is necessary to use strategies that generate protection and resist the conditions to which it is exposed in a biological system. Therefore, in this study, the synthesis of Alginate and Chitosan nanoparticles (Nps Alg-Chi) was carried out using the ionic gelation technique to immobilize Ib-M peptides and form Ib-M/Alg-Chi bioconjugates. The structural features of the nanoparticles were determined by SEM, DLS and FT-IR. The biological activity against E. coli ATCC 25922 and mammalian Vero cells, and the stability at temperature, pH and proteases of Ib-M and Ib-M/Alg-Chi were evaluated. The results showed nanoparticle agglomerates with average sizes of 150nm; the MIC determined corresponded to 12.5μM in Ib-M1 and 25μM for Ib-M2 and Ib-M6, which were maintained in the bioconjugate, and the cytotoxicity with values close to 40%. Stability was maintained against pH and temperature and in proteases it was only evidenced against pepsin in Ib-M/Alg-Chi. The results are promising for using Ib-M and Ib-M/Alg-Chi as possible antimicrobial agents., Maestría, Magíster en Investigación en enfermedades Infecciosas, Introducción .................................................................................................................................. 19 1. Marco Referencial ..................................................................................................................... 22 1.1 Escherichia coli ...................................................................................................................... 22 1.1.1 Patotipos ............................................................................................................................... 23 1.2 Escherichia Coli Atcc 25922 ....................................................................................... 26 1.3 Antibióticos ................................................................................................................. 26 1.4 Resistencia Antimicrobiana ......................................................................................... 31 1.5 Péptidos Antimicrobianos............................................................................................ 33 1.6 Péptidos Ib-M .............................................................................................................. 34 1.7 Mecanismos de Acción de los Amps ........................................................................... 35 1.7.1 Modelo Alfombra ....................................................................................................... 36 1.7.2 Modelo en Forma de Barril ........................................................................................ 36 1.7.3 Modelo de Poro Toroidal ........................................................................................... 36 1.7.4 Modelo de Agregación. .............................................................................................. 37 1.8 Limitaciones de los Péptidos Antimicrobianos ........................................................... 38 1.9 Nanopartículas Poliméricas ......................................................................................... 39 1.10 Síntesis de Nanopartículas Poliméricas ....................................................................... 40 1.11 Quitosano ..................................................................................................................... 41 1.12 Alginato ....................................................................................................................... 41 1.13 Técnicas de Caracterización ........................................................................................ 42 1.13.1 Espectroscopia Ir ......................................................................................................... 42 1.13.2 Dispersión de luz Dinámica - Dls ................................................................................ 43 1.13.3 Microscopía Electrónica de Barrido (Sem) ................................................................. 43 2. Objetivos ................................................................................................................................... 45 2.1 Objetivo General .......................................................................................................... 45 2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 45 3. Materiales y Métodos .................................................................................................. 46 3.1 Reactivos ..................................................................................................................... 46 3.2 Materiales .................................................................................................................... 46 3.3 Métodos ....................................................................................................................... 46 3.3.1 Preparación de las Nanopartículas de Alginato-Quitosano ......................................... 46 3.3.2 Caracterización de las Nanopartículas ......................................................................... 47 3.3.3 Preparación del Bioconjugado de Nanopartículas Poliméricas y de Los Péptidos Ib-M ………………………………………………………………………………………..48 3.3.4 Actividad Antimicrobiana Contra E. Coli ................................................................... 49 3.3.5 Evaluación de la Actividad Citotóxica ........................................................................ 49 3.3.6 Evaluación de la Estabilidad de los Péptidos Libres y los Bioconjugados ................. 50 4. Resultados .................................................................................................................... 53 4.1 Preparación y Caracterización de las Nanopartículas de Alginato-Quitosano ............ 53 4.2 Preparación del Bioconjugado de Nanopartículas Poliméricas y de los Péptidos Ib-M ………………………………………..………………………………………………55 4.3 Actividad Antimicrobiana Contra E. Coli ................................................................... 56 4.3.1 Actividad de los Péptidos Ib-M Contra E. Coli ........................................................... 56 4.3.2 Actividad de los Bioconjugados Ib-M/Alg-Chi Contra E. Coli .................................. 57 4.4 Evaluación de la Actividad Citotóxica ........................................................................ 58 4.5 Evaluación de la Estabilidad de los Péptidos Libres y los Bioconjugados ................. 59 4.5.1 Estabilidad a ph ........................................................................................................... 59 4.5.2 Estabilidad a Temperaturas ......................................................................................... 61 4.5.3 Estabilidad a Proteasas ................................................................................................ 63 5. Discusión ..................................................................................................................... 67 6. Conclusiones ................................................................................................................ 73 8. Recomendaciones ........................................................................................................ 74 9. Referencias .................................................................................................................. 75

Digital, El diseño de biosensores electroquímico se ha estado empleando como un método alternativo para la detección de microorganismos patógenos debido a su simplicidad y alta sensibilidad. En este proyecto de grado se desarrolló un biosensor electroquímico para la detección analítica rápida de Escherichia coli O157:H7 mediante la modificación de un electrodo serigrafiado (SPE) con nanopartículas de oro y elementos biológicos de reconocimiento. Para dichos elementos biológicos, se utilizaron 2 péptidos diseñados en el grupo de investigación CIBAS. El péptido 1 (PEPTIR 1) y péptido 2 (PEPTIR 2), los cuales difieren en el cambio de un aminoácido, una asparagina por una alanina, esto confiere parámetros de interacción molecular con la proteína intimina superiores en PEPTIR 2.0, además, presenta mejores valores de afinidad de unión y constante de disociación. Los dos péptidos tienen la misma región de unión al interactuar con la proteína intimina, sin embargo, el PEPTIR 1.0 genera un menor número de contactos intermoleculares (52 contactos) que el PEPTIR 2.0 (63 contactos), por esto, es más sensible para detectar microorganismos como S. aureus y P. aeruginosa y el PEPTIR 2,0 es más específico o selectivo para E.coli patógena, por consiguiente, surgió la importancia de combinar estos dos elementos de reconocimiento en un mismo biosensor y así determinar el efecto que tienen sobre la especificidad y la sensibilidad al momento de detectar Escherichia coli O157:H7. La medición de las propiedades electroquímicas del biosensor se realizaron a través de las técnicas de espectroscopia de impedancia electroquímica, voltametría de onda cuadrada y voltametría cíclica. Los resultados obtenidos concluyeron que la combinación que mejor presento resultados fue la combinación I, donde se trabajó con concentraciones de 10,0 nM para el PEPTIR-1 y 5.0 nM de PEPTIR-2, obteniendo límites de detección y cuantificación de 3 UFC/mL y 11 UFC/mL, respectivamente., Electrochemical biosensor design has been used as an alternative method for the detection of pathogenic microorganisms due to its simplicity and high sensitivity. In this degree project, an electrochemical biosensor was developed for the rapid analytical detection of Escherichia coli O157:H7 by modifying a screen-printed electrode (SPE) with gold nanoparticles and biological recognition elements. For these biological elements, 2 peptides designed in the CIBAS research group were used. Peptide 1 (PEPTIR 1) and peptide 2 (PEPTIR 2), which differ in the change of an amino acid, an asparagine for an alanine, this confers higher molecular interaction parameters with the intimin protein in PEPTIR 2.0, in addition, it presents better binding affinity and dissociation constant values. The two peptides have the same binding region when interacting with the intimin protein, however, PEPTIR 1.0 generates fewer intermolecular contacts (52 contacts) than PEPTIR 2.0 (63 contacts), therefore, it is more sensitive to detect microorganisms such as S. aureus and P. aeruginosa and PEPTIR 2.0 is more specific or selective for pathogenic E.coli, therefore, it was important to combine these two recognition elements in the same biosensor and thus determine the effect they have on the specificity and sensitivity at the time of detecting Escherichia coli O157:H7. The measurement of the electrochemical properties of the biosensor was carried out through the techniques of electrochemical impedance spectroscopy, square wave voltammetry and cyclic voltammetry. The results obtained concluded the results obtained concluded that the combination that presented the best results was combination I, where concentrations of 10.0 nM for PEPTIR-1 and 5.0 nM for PEPTIR-2 were worked, obtaining detection and quantification limits of 3 CFU/mL. and 11 CFU/mL, respectively., Pregrado, Microbiólogo Industrial, Nanotecnología y biomateriales, Tabla de Contenido Capítulo 1 20 Introducción 20 Capítulo 2 24 Objetivos 24 Objetivo General 24 Objetivos Específicos 24 Capítulo 3. Marco de Referencia 25 Marco de Antecedentes 25 Década de los 60 y 70 25 Actualidad 26 Marco Teórico 27 Escherichia coli 27 Escherichia coli O157:H7 27 Métodos Tradicionales de Detección 28 Filtración por Membrana 28 Métodos Moleculares (PCR) 29 Método del Número Más Probable 29 Biosensor Electroquímico 30 Componentes de los Biosensores Electroquímicos 31 Elementos de Reconocimiento 31 Transductor 32 Traducción Electroquímica – Técnicas 33 Espectroscopia de Impedancia Electroquímica 33 Voltametría de Onda Cuadrada (SWV) 33 Voltametría Cíclica (CV) 34 Capítulo 4. Marco Legal 35 Capítulo 5. Metodología 36 Equipos y Materiales 36 Instrumentación 36 Electrodos 36 Reactivos 36 Material Microbiológico 36 Péptidos 37 Métodos y Procedimientos Analíticos 37 Técnicas Electroquímicas 37 Electrodeposición de AuNPs. 38 Inmovilización de Péptidos 39 Caracterización Electroquímica 40 Capítulo 5. Resultados y Discusión 42 Establecimiento de las combinaciones de péptidos PEPTIR mediante biosensores electroquímicos. 42 Curva de Calibración 47 Límites de Detección (LDD) y Límites de Cuantificación (LDC) 48 Linealidad del Biosensor 49 Prueba de Selectividad 51 Conclusiones 55 Recomendaciones 56 Referencias Bibliográficas 57 Apéndices 62

Digital, Candida palmioleophila es una levadura lipolítica anteriormente conocida como Torulopsis candida, la cual se ha reportado por su capacidad de asimilar aceite de palma crudo y se ha encontrado en sus perfiles proteicos presencia de enzimas lipolíticas de un tamaño de 63kDa y 28kDa (Cáceres Villamizar, 2019). Las lipasas son proteínas presentes en los animales, en las plantas y en los microorganismos (Pedroza Padilla et al., 2017). La función principal de las lipasas es la hidrólisis de triacilgliceroles que produce ácidos grasos y glicerol; además, estas enzimas catalizan reacciones in vitro, tales como esterificación, transesterificación e interesterificación en medios hidrofóbicos (Fernández Jerí et al., 2013). Estas ventajas las ha impulsado dentro del grupo de enzimas con mayor producción en el campo de aplicaciones biotecnológicas. Sin embargo, aunque se tienen evidencias de la posible producción de enzimas lipolíticas por C. palmioleophila, no existen revisiones sobre la actividad hidrolítica de extractos enzimáticos de esta levadura, permitiendo de esta forma identificar otros procesos industriales en los cuales pueda ser utilizado este microorganismo. Una estrategia empleada para la optimización de la estabilidad y la actividad de las enzimas con el fin de ser usadas en procesos industriales, es la inmovilización, este es un proceso en el cual se busca confinar a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que permitan su reúso (D. M. Arroyo, 1998). Por lo anterior, en este trabajo se estudiaron las características bioquímicas de extractos enzimáticos de C. palmioleophila libres e inmovilizados en nanopartículas de óxido de hierro. Se evaluaron diferentes medios de cultivo suplementados con fuentes de carbono basadas en ácidos grasos, de estos se seleccionó el medio MBS2 /Ácido oleico (1%) por ser el que favoreció la mayor cantidad de proteína en los extractos enzimáticos obtenidos y posteriormente se evaluó la actividad enzimática de los mismos extractos por medio de la degradación de sustratos hidrosolubles como el p-nitrofenil acetato, obteniendo la mayor actividad para el mismo medio con un valor de 0,19 μmol min-1. Adicionalmente, se realizó la inmovilización de los extractos enzimáticos haciendo uso de la metodología de unión a soporte en nanopartículas magnéticas de Fe3O4 (NpM), logrando un porcentaje de inmovilización de 89,14%. Se observó, que el proceso de inmovilización en NpM le confiere una mayor estabilidad de pH y temperatura a los extractos inmovilizados en comparación con los extractos libres. De esta manera, la enzima libre mostró mayor actividad con un pH óptimo de 9 (0,040 μmol/min-1) y una temperatura de 30°C (0,081 μmol/min-1), mientras que con el extracto inmovilizado los valores de actividad aumentaron en unas condiciones óptimas de pH 9 (0,149 μmol/min-1) y 50°C (0,102 μmol/min-1)., Candida palmioleophila is a lipolytic yeast formerly known as Torulopsis candida, it has been reported for its ability to assimilate crude palm oil and the presence of lipolytic enzymes with a size of 63kDa and 28kDa has been found in its protein profiles (Cáceres Villamizar, 2019). Lipases are proteins present in animals, plants and microorganisms (Pedroza Padilla et al., 2017). The main function of lipases is the hydrolysis of triacylglycerols producing fatty acids and glycerol; in addition, these enzymes catalyze in vitro reactions, such as esterification, transesterification and interesterification in hydrophobic media (Fernández Jerí et al., 2013). These advantages have been promoted within the group of enzymes with the highest production in the field of biotechnological applications. However, although there is evidence of the possible production of lipolytic enzymes by C. palmioleophila, there are no reviews on the hydrolytic activity of enzymatic extracts of this yeast, allowing in this way to identify other industrial processes in which this microorganism can be used. A strategy used to optimize the stability and activity of enzymes in order to be used in industrial processes is immobilization, this is a process in which it is sought to confine the enzyme in a defined region of space, to give rise to insoluble forms that retain their catalytic activity and allow their reuse (D. M. Arroyo, 1998). Therefore, in this work the biochemical characteristics of enzymatic extracts of C. palmioleophila free and immobilized in iron oxide nanoparticles were studied. Different culture media supplemented with carbon sources based on fatty acids were evaluated, of these the MBS2 / Oleic acid (1%) medium was selected because it was the one that favored the highest amount of protein in the enzymatic extracts obtained and subsequently the enzymatic activity of the same extracts through the degradation of water-soluble substrates such as p-nitrophenyl acetate, obtaining the highest activity for the same medium with a value of 0.19 μmol min-1. Additionally, the immobilization of the enzymatic extracts was carried out using the methodology of attachment to the support in magnetic nanoparticles of Fe3O4 (NpM), achieving an immobilization percentage of 89,14%. It was observed that the immobilization process in NpM confers greater stability of pH and temperature to the immobilized extracts compared to the free extracts. In this way, the free enzyme showed greater activity with an optimal pH of 9 (0.040 μmol/min-1) and a temperature of 30°C (0.081 μmol/min-1), while with the immobilized extract the activity values increased under optimal conditions of pH 9 (0.149 μmol/min-1) and 50°C (0.102 μmol/min-1)., Maestría, Magíster en Biotecnología, Introducción ................................................................................................................................... 19 1. Problema de Investigación ................................................................................................. 22 2. Pregunta de Investigación .................................................................................................. 24 3. Justificación ........................................................................................................................ 25 4. Objetivos ............................................................................................................................ 27 5. Marco de Referencia ......................................................................................................... 28 6. Marco Teórico .................................................................................................................... 33 6.1 Candida palmioleophila ..................................................................................................... 33 6.2 Enzimas .............................................................................................................................. 33 6.3 Lipasas ................................................................................................................................ 35 6.4 Inmovilización Enzimática ................................................................................................. 37 6.5 Nanopartículas de Óxido de Hierro como Soporte para Inmovilización ........................... 40 6.6 Medición de la Actividad Enzimática ................................................................................ 42 6.7 Factores que Influyen en la Actividad Enzimática ............................................................. 43 6.8 Aplicaciones Biotecnológicas ............................................................................................ 45 7. Metodología ....................................................................................................................... 48 7.1 Microorganismos y Condiciones de Cultivo ...................................................................... 48 7.2 Obtención de Extractos Enzimáticos .................................................................................. 48 7.2.1 Cultivo de C. palmioleophila ............................................................................................. 48 7.2.2 Concentración de Proteínas .............................................................................................. 49 7.2.3 Perfil Proteico por Electroforesis SDS-PAGE ................................................................... 50 7.3 Medición de Actividad Lipolítica por el Método de Fluorescencia en Placa .................... 50 7.4 Determinación de la Actividad Enzimática ........................................................................ 51 7.5 Inmovilización en Nanopartículas de Óxido de Hierro ...................................................... 52 7.5.1 Preparación del Soporte de Nanopartículas Magnéticas .................................................. 52 7.5.2 Inmovilización de Extractos Enzimáticos de C. palmioleophila en NpM .......................... 52 7.6 Evaluación del Efecto del pH y la Temperatura Sobre la Actividad Enzimática de un Extracto de C. palmioleophila ........................................................................................................ 53 8. Resultados y Discusión ...................................................................................................... 55 8.1 Obtención de Extractos Enzimáticos .................................................................................. 55 8.1.1 Cultivo de C. palmioleophila ............................................................................................. 55 8.1.2 Concentración de Proteínas .............................................................................................. 55 8.1.3 Perfil Proteico por Electroforesis SDS-PAGE ................................................................... 58 8.2 Medición de Actividad Lipolítica por el Método de Fluorescencia en placa .................... 61 8.3 Determinación de la Actividad Enzimática ........................................................................ 62 8.4 Inmovilización en Nanopartículas de Óxido de Hierro ...................................................... 64 8.4.1 Caracterización del Soporte de Nanopartículas Magnéticas ............................................ 64 8.4.2 Inmovilización de Extractos Enzimáticos de C. palmioleophila en NpM .......................... 65 8.5 Evaluación del Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática de un Extracto de C. palmioleophila ........................................................................................................ 69 8.5.1 Evaluación del pH .............................................................................................................. 69 8.5.2 Estabilidad de la Temperatura ........................................................................................... 71 9. Conclusiones ...................................................................................................................... 76 10. Recomendaciones ............................................................................................................... 77 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................. 78 Apéndices ....................................................................................................................................... 88

Digital, Los biosensores son sistemas basados en nanomateriales y biomoléculas que exhiben notables propiedades, tales como: simplicidad, portabilidad, eficiencia y facilidad de usar para la detección de patógenos como Escherichia coli. En este trabajo se informa por primera vez sobre el diseño de nuevos péptidos basados en la proteína TIR, un receptor de la proteína de membrana intimina característica de E. coli. Estos nuevos péptidos se utilizaron como elementos de reconocimiento para la detección de E. coli. Para este estudio, utilizando la herramienta LigPlot, se realizó un análisis de interacción entre intimina y TIR utilizando la estructura PDB: 2ZQK. Posteriormente, la secuencia asociada a la zona de interacción de TIR fue modelada con PEP-FOLD. Finalmente, a partir de los modelos obtenidos se realizó un estudio de Docking molecular y análisis de interacción, que permitieron definir dos moléculas de reconocimiento denominadas PEPTIR 1 y PEPTIR 2.0, las cuales fueron inmovilizadas en un transductor electroquímico basado en nanomateriales y se evaluó su capacidad de detección de E. coli mediante técnicas electroquímicas. El biosensor basado en PEPTIR 1.0 mostró la capacidad de detectar E. coli, exhibiendo un rango de trabajo lineal entre 0 a 500 UFC / mL y límites de detección y cuantificación de 2 y 6 UFC / mL, respectivamente. Además, el dispositivo mostró la capacidad de detectar de manera selectiva E. coli en presencia de otros microorganismos como P. aeruginosa y S. aereus. Por lo que se destacan la posibilidad de que este dispositivo pueda ser utilizado en la detección rápida, sensible y selectiva de E coli en matrices acuosas. Mientras que el biosensor basado en PEPTIR 2.0 mostró un gran potencial para ser evaluado en su capacidad para detectar con un mayor espectro, microorganismos gramnegativos en una matriz acuosa., Biosensors are systems based on nanomaterials and biomolecules that exhibit remarkable properties, such as: simplicity, portability, efficiency and ease of use for the detection of pathogens such as Escherichia coli. This work reports for the first time on the design of new peptides based on the TIR protein, a receptor for the intimin membrane protein characteristic of E. coli. These new peptides are used as recognition elements for the detection of E. coli. For this study, using the LigPlot tool, an interaction analysis between intimin and TIR was performed using the PDB: 2ZQK structure. Subsequently, the sequence associated with the TIR interaction zone was modeled with PEP-FOLD. Finally, from the obtained models, a molecular docking study and interaction analysis were carried out, which allowed defining two recognition molecules called PEPTIR 1 and PEPTIR 2.0, which were immobilized in an electrochemical transducer based on nanomaterials and their capacity was evaluated. detection of E. coli by electrochemical techniques. The biosensor based on PEPTIR 1.0 showed the ability to detect E. coli, exhibiting a linear working range between 0 to 500 CFU / mL and detection and quantification limits of 2 and 6 CFU / mL, respectively. Furthermore, the device showed the ability to selectively detect E. coli in the presence of other microorganisms, such as P. aeruginosa and S. aereus. Therefore, the possibility that this device can be used in the rapid, sensitive and selective detection of E coli in aqueous matrices stands out. While the biosensor based on PEPTIR 2.0 showed great potential to be evaluated in its ability to detect with a wider spectrum, gram-negative microorganisms in an aqueous matrix., Maestría, Magister en Biotecnología, 1 ed., Introducción .................................................................................................................................. 17 1. Marco de Referencia ................................................................................................................. 22 1.1 Marco de Antecedentes ................................................................................................... 22 1.2 Marco Legal ..................................................................................................................... 25 1.3 Marco Teórico ................................................................................................................. 29 1.3.1 E. coli O157:H7 y sus Proteínas de Adhesión: Intimina y TIR .................................... 29 1.3.2 Biosensores Electroquímicos ........................................................................................ 32 1.3.3 Nanopartículas de Oro (AuNPs) en el Diseño de Biosensores Electroquímicos ......... 32 1.3.4 Péptidos ........................................................................................................................ 35 1.3.5 Proteínas de Membrana Externa ................................................................................... 35 1.3.6 Bioinformática Estructural ........................................................................................... 36 2. Objetivos ................................................................................................................................... 37 2.1 Objetivo General .............................................................................................................. 37 2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................... 37 3. Péptido Bioinspirado en la Proteína Tir como Molécula de Reconocimiento en Biosensores Electroquímicos Modificados con Aunps para la Detección de E. Coli O157: H7 en Matrices Acuosas ......................................................................................................................................... 38 3.1 Resumen .......................................................................................................................... 38 3.2 Metodología ..................................................................................................................... 39 3.2.1 Reactivos, Materiales e Instrumentos ........................................................................... 39 3.2.2 Diseño de Péptidos Análogos a la Proteína TIR de E. Coli O157:H7 Mediante Herramientas Bioinformáticas ............................................................................................... 40 3.2.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando el Péptido Diseñado ............... 42 3.2.4 Evaluación de la Capacidad de Detección de E. coli O157:H7 del Biosensor Electroquímico Utilizando los Péptidos Diseñados............................................................... 47 3.3 Resultados ........................................................................................................................ 49 3.3.1 Diseño de Péptidos Análogos a la Proteína TIR de E. coli O157:H7 Mediante Herramientas Bioinformáticas ............................................................................................... 49 3.3.2 Docking Molecular entre la Proteína Intimina y el Péptido Diseñado ......................... 53 3.3.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando el Péptido Diseñado ............... 56 3.3.4 Evaluación de la Capacidad de Detección de E. Coli O157:H7 del Biosensor Electroquímico Utilizando los Péptidos Diseñados............................................................... 61 3.4 Conclusiones Parciales .................................................................................................... 69 5. Nueva Molécula de Reconocimiento Diseñada a Partir de Peptir 1.0 para la Detección de E. Coli O157: H7 en Matrices Acuosas Mediante Biosensores Electroquímicos ............................. 70 5.1 Resumen .......................................................................................................................... 70 5.2 Metodología ..................................................................................................................... 72 5.2.1 Reactivos, Materiales e Instrumentos ........................................................................... 72 5.2.2 Modelado de Secuencias Análogas a la Molécula Peptir 1.0 ....................................... 72 5.2.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando AuNPs y la Molécula de Reconocimiento Peptir 2.0 .................................................................................................... 74 5.2.4 Evaluación de la Capacidad de Detección del Biosensor Electroquímico Utilizando Peptir 2.0 como Molécula de Reconocimiento ...................................................................... 74 5.3 Resultados ........................................................................................................................ 75 5.3.1 Modelado de Secuencias Análogas a la Molécula Peptir 1.0 ....................................... 75 5.3.2 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando AuNPs y la Molécula de Reconocimiento Peptir 2.0 .................................................................................................... 79 5.3.3 Evaluación de la Capacidad de Detección del Biosensor Electroquímico Utilizando Peptir 2.0 como Molécula de Reconocimiento ...................................................................... 82 5.4 Conclusiones Parciales .................................................................................................... 87 6. Conclusiones Generales ............................................................................................................ 89 7. Recomendaciones ..................................................................................................................... 91 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 93 Apéndice ..................................................................................................................................... 105

Digital, Actualmente, la encapsulación es un método de gran importancia científica debido a las ventajas que estas poseen. En la industria farmacéutica, se ha encontrado la forma de controlar la dosificación de los antibióticos usando esta metodología para proteger los sistemas bioactivos, y manejar el tiempo de entrega y concentración de este. El Alginato y el Chitosan, son algunos de los biopolímeros de mayor uso para esta metodología, gracias a que no son tóxicos, y se puede dosificar repetidas veces sin ocasionar efectos adversos. En el caso de E. coli O157:H7, es un microorganismo de gran importancia, ya que causa grandes cifras de morbimortalidad al año, y no existe tratamiento específico para este. La estreptomicina, es un antibiótico que se ha usado en algunos cuadros para E. coli O157:H7, por lo que el objetivo de este proyecto es la inmovilización de estreptomicina en micropartículas poliméricas de Alginato-Chitosan para la inhibición de E. coli O157:H7. Se probaron distintas formulaciones de micropartículas, alterando la concentración de Alginato y CaCO3. Se utilizó SEM para la visualización de las micropartículas formuladas y se probó su actividad antimicrobiana mediante la técnica de microdilución. Se obtuvo un tamaño promedio de 0.5-5 μm de las micropartículas y se logró una CMI de 12.5μM de estreptomicina contra E. coli O157:H7, con la estreptomicina inmovilizada en las micropartículas. No se encontró actividad antimicrobiana por parte de las micropartículas de Alginato-Chitosan, por lo que la actividad de inhibición se le atribuye a la estreptomicina inmovilizada., Currently, encapsulation is a method of great scientific importance due to its advantages. In the pharmaceutical industry, a way has been found to control the dosage of antibiotics using this methodology to protect bioactive systems, and manage the delivery time and concentration of this. Alginate and chitosan are some of the most widely used biopolymers for this methodology, thanks to the fact that they are not toxic, and can be dosed repeatedly without causing adverse effects. In the case of E. coli O157: H7, it is a microorganism of great importance, since it causes large numbers of morbidity and mortality per year, and there is no specific treatment for it. Streptomycin is an antibiotic that has been used in some cases for E. coli O157: H7, so the objective of this project is the immobilization of streptomycin in polymeric alginate-chitosan microparticles for the inhibition of E. coli O157: H7. Different microparticle formulations were tested, altering the concentration of alginate and CaCO3. SEM was used to visualize the formulated microparticles and their antimicrobial activity was tested using the microdilution technique. An average size of 0.5-5 μm of the microparticles was obtained and a MIC of 12.5 μM of streptomycin against E. coli O157: H7 was achieved, with streptomycin immobilized on the microparticles. No antimicrobial activity was found by the alginate-chitosan microparticles, so the inhibition activity is attributed to immobilized streptomycin., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Planteamiento del Problema ........................................................................................... 18 2. Justificación .................................................................................................................... 20 3. Objetivos ......................................................................................................................... 22 3.1 Objetivo General ............................................................................................................. 22 3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 22 4. Pregunta de Investigación ............................................................................................... 23 5. Hipótesis ......................................................................................................................... 24 5.1 Hipótesis de Investigación .............................................................................................. 24 5.2 Hipótesis Nula ................................................................................................................ 24 5.3 Hipótesis Alterna ............................................................................................................ 24 6. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 25 7. Marco Legal .................................................................................................................... 29 8. Marco Referencial .......................................................................................................... 30 8.1 Propiedades de los Biopolímeros .................................................................................... 30 8.2 Chitosan .......................................................................................................................... 31 8.2.1 Características Estructurales del Chitosan ...................................................................... 31 8.2.2 Características Físico-Químicas del Chitosan ................................................................ 32 8.2.3 Propiedades Funcionales del Chitosan ........................................................................... 32 8.3 Alginato .......................................................................................................................... 34 8.3.1 Estructura del Alginato ................................................................................................... 35 8.3.2 Características Físico-Químicas del Alginato ................................................................ 36 8.3.3 Propiedades del Alginato ................................................................................................ 36 8.4 Micropartículas Poliméricas ........................................................................................... 37 8.4.1 Clasificación de la Microencapsulación ......................................................................... 38 8.4.2 Métodos de Preparación de las Micropartículas ............................................................. 39 8.4.2.1 Gelificación Iónica. ......................................................................................................... 39 8.5 Encapsulación en Emulsión ............................................................................................ 41 8.6 Escherichia coli .............................................................................................................. 42 8.6.1 E. coli O157:H7 .............................................................................................................. 42 8.6.1.1 Síntomas E. coli O157:H7.. ............................................................................................ 42 9. Marco Metodológico ...................................................................................................... 44 9.1 Lugar de Realización ...................................................................................................... 44 9.2 Técnicas y Métodos ........................................................................................................ 44 9.2.1 Preparación de Soluciones .............................................................................................. 44 9.2.1.1 Solución de Alginato Sódico (Solución A) ..................................................................... 44 9.2.1.2 Solución de Chitosan (Solución B). ................................................................................ 44 9.2.1.3 Solución de Estreptomicina. ........................................................................................... 45 9.3 Preparación de Micropartículas Alginato-Chitosan ........................................................ 45 9.4 Inmovilización de Estreptomicina en las Micropartículas de Alginato- Chitosan ......... 46 9.5 Determinación de Porcentaje de Inmovilización ............................................................ 46 9.6 Caracterización de las Micropartículas ........................................................................... 47 9.7 Determinación de la Actividad Antimicrobiana ............................................................. 47 10. Resultados ....................................................................................................................... 48 11. Conclusión ...................................................................................................................... 58 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 59

Digital, Las enzimas han surgido como una alternativa prometedora en la catálisis de las reacciones químicas, dado que, a nivel biotecnológico, acarrean ahorro en los costos de producción, mejoran la productividad, la calidad de productos intermedios y son seguras para el medio ambiente. Dentro de ellas, se encuentran las lipasas, enzimas encargadas de catalizar in vivo la hidrólisis de triacilglicéridos, e in vitro la hidrólisis o síntesis de ésteres y la resolución de mezclas racémicas con una selectividad alta, teniendo como sustratos principales ácidos grasos como el ácido oleico. Estas enzimas son potencialmente producidas por microorganismos, donde sobresalen las levaduras del género Candida. En el presente estudio se evaluó la actividad de conversión del ácido oleico en presencia de etanol, usando extractos enzimáticos de la levadura Candida palmioleophila de referencia Nakase & Itoh DBVPG 8040, en la que han sido identificados genes lipolíticos de los cuales se está estudiando su potencial hidrolítico y enantioselectivo. Se llevó a cabo la estandarización de las condiciones óptimas para dicha reacción, empleando lipasa comercial de Candida rugosa, mediante un montaje de reflujo, con seguimiento por titulación de ácidos grasos y con fluorescencia de rodamina. Se obtuvieron los extractos enzimáticos de C. palmioleophila, se concentraron, y caracterizaron por electroforesis SDS Page, y se evaluó su capacidad de convertir el ácido oleico disuelto en etanol a 40°C en las condiciones estandarizadas. El perfil electroforético obtenido sugirió la presencia de posibles lipasas, por las bandas reportadas con pesos moleculares entre 35 kDa y 72 kDa, lo cual respalda la actividad de conversión de los extractos. Los extractos enzimáticos presentaron una actividad de 2,768 U/mg sobre el sustrato, a una concentración de 0,16 mg/mL, en relación ácido oleico:etanol de 1:4.5, llegando a consumir 9,824 * 10 3 μMoles tras 210 minutos de actividad., Enzymes have emerged as a promising alternative in the catalysis of chemical reactions, since, at the biotechnological level, they bring savings in production costs, improve productivity, the quality of intermediate products and are safe for the environment. Among them are lipases, enzymes responsible for catalyzing the hydrolysis of triacylglycerides in vivo, and in vitro the hydrolysis or synthesis of esters and the resolution of racemic mixtures with high selectivity, having as main substrates fatty acids such as oleic acid. These enzymes are potentially produced by microorganisms, where the yeasts of the genus Candida stand out. In the present study, the conversion activity of oleic acid in the presence of ethanol was evaluated, using enzymatic extracts of the reference yeast Candida palmioleophila Nakase & Itoh DBVPG 8040, in which lipolytic genes of which their potential is being studied have been identified. hydrolytic and enantioselective. The standardization of the optimal conditions for said reaction was carried out, using commercial lipase from Candida rugosa, by means of a reflux assembly, with monitoring by fatty acid titration and with rhodamine fluorescence. Enzyme extracts of C. palmioleophila were obtained, concentrated, and characterized by SDS Page electrophoresis, and their ability to convert dissolved oleic acid into ethanol at 40 ° C under standardized conditions was evaluated. The obtained electrophoretic profile suggested the presence of possible lipases, due to the bands reported with molecular weights between 35 kDa and 72 kDa, which supports the conversion activity of the extracts. The enzymatic extracts presented an activity of 2,768 U / mg on the substrate, at a concentration of 0.16 mg / mL, in a ratio of oleic acid: ethanol of 1: 4.5, reaching a consumption of 9.824 * 10 3 μMol after 210 minutes of activity ., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Objetivos ......................................................................................................................... 21 1.1 Objetivo General ............................................................................................................. 21 1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 21 2. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 22 2.1 Lipasas del Género Candida ........................................................................................... 22 2.1.1 Lipasas de Candida rugosa ............................................................................................ 23 2.1.2 Lipasas de Candida antarctica ....................................................................................... 23 2.1.3 Lipasas de Yarrowia lipolytica ....................................................................................... 23 2.2 C. palmioleophila .......................................................................................................... 24 3. Marco Teórico ................................................................................................................ 26 3.1 Ácidos Grasos ................................................................................................................. 26 3.1.1 Ácido Oleico ................................................................................................................... 26 3.2 Lipasas ............................................................................................................................ 27 3.2.1 Definición ....................................................................................................................... 27 3.2.2 Características ................................................................................................................. 28 3.2.2.1 Peso Molecular y Punto Isoeléctrico.. ............................................................................ 28 3.2.2.2 Estructura.. ...................................................................................................................... 29 3.2.2.3 Activación Interfacial.. ................................................................................................... 29 3.2.2.4 Especificidad y Selectividad.: ......................................................................................... 30 3.2.3 Actividad ......................................................................................................................... 31 3.2.3.1 Factores que Afectan la Actividad. ................................................................................. 32 3.2.4 Fuentes Naturales ............................................................................................................ 33 3.2.5 Aplicaciones Biotecnológicas ......................................................................................... 35 3.3 Género Candida .............................................................................................................. 36 4. Marco Legal .................................................................................................................... 37 4.1 Principios de la Bioética ................................................................................................. 37 4.1.1 Autonomía ...................................................................................................................... 37 4.1.2 Beneficencia ................................................................................................................... 38 4.1.3 No Maleficencia .............................................................................................................. 38 4.1.4 Justicia ............................................................................................................................ 38 5. Metodología .................................................................................................................... 39 5.1 Cuantificación de Proteínas por el Método de Bradford ................................................ 39 5.2 Estandarización de la Actividad Enzimática de la Lipasa de C. rugosa en la Conversión de Ácido Oleico ............................................................................................................................ 39 5.2.1 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Titulación Ácido - Base ..... 41 5.2.2 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Fluorescencia de Rodamina 43 5.3 Obtención de extractos enzimáticos de C. palmioleophila ............................................. 44 5.3.1 Cultivo de C. palmioleophila .......................................................................................... 44 5.3.2 Concentración de Proteínas de los Extractos Enzimáticos de C. palmioleophila .......... 46 5.3.3 Cuantificación de Proteínas Presentes en Extractos Enzimáticos de C. palmioleophila 46 5.3.4 Caracterización del Extracto Enzimático por Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (SDS-PAGE). ................................................................................................................................ 47 5.4 Evaluación de la Actividad Enzimática de los Extractos Enzimáticos Concentrados de C. palmioleophila en la Conversión de Ácido Oleico .................................................................. 48 5.4.1 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Titulación Ácido - Base ..... 48 5.4.2 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Fluorescencia de Rodamina 49 6. Resultados ....................................................................................................................... 50 6.1 Estandarización de la Actividad Enzimática de Lipasa de C. rugosa. ........................... 50 6.1.1 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Titulación Ácido - Base ..... 50 6.1.2 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Fluorescencia de Rodamina 52 6.2 Cultivo Celular de C. palmioleophila - Obtención de Extractos Enzimáticos ............... 53 6.2.1 Cuantificación de Proteínas Presentes en Extractos Enzimáticos .................................. 53 6.2.2 Caracterización de las Proteínas Presentes en los Extractos Enzimáticos Producidos por C. palmioleophila (Electroforesis SDS-PAGE). ........................................................................... 54 6.3 Actividad Enzimática de los Extractos Enzimáticos Producidos por C. palmioleophila. .. ........................................................................................................................................ 55 6.3.1 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Titulación Ácido - Base ..... 55 6.3.2 Seguimiento de la Conversión de Ácido Oleico Mediante Fluorescencia de Rodamina 56 7. Discusión ........................................................................................................................ 58 8. Conclusiones ................................................................................................................... 64 9. Recomendaciones ........................................................................................................... 65 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 66 Apéndice ....................................................................................................................................... 78

Digital, Escherichia coli enterohemorrágica (O157:H7) es un microorganismo Gram negativo y uno de los patógenos más importantes para el ser humano. Su principal mecanismo de patogenicidad es la expresión de la toxina shiga, ya que ocasiona graves daños al epitelio intestinal. Actualmente existen diversos mecanismos para la detección de este microorganismo; entre ellos está la filtración por membrana y la cuantificación molecular. Sin embargo, cada una de estas técnicas tiene limitaciones como el tiempo que se requiere para obtener algún resultado, la capacitación que del personal y los altos costos del equipamiento. Por lo anterior surge la necesidad de nuevos métodos que permitan la detección rápida y sensible de este microorganismo. Por lo cual, en este trabajo se desarrolló de un aptasensor electroquímico cuya molécula de reconocimiento consiste en un aptámero diseñado “in silico” que permite la detección de Escherichia coli en matrices acuosas. Para esto se realizó una revisión bibliográfica sobre artículos científicos, que trataran de aptasensores diseñados para la detección de Escherichia coli y a partir de ellos se construyó una base de datos con la información más importante de cada uno. Todos estos datos se analizaron y a partir de las mejores secuencias se inició la construcción, agregando fragmentos necesarios para que fuera un aptámero “in silico” completamente funcional. El aptámero diseñado fue inmovilizado sobre electrodos serigrafiados modificados con nanopartículas de oro y la detección electroquímica se realizó a través de EIS (Espectroscopía de impedancia electroquímica), CV (Voltametría cíclica) y SWV (Voltametría de onda cuadrada). De los cuales se obtuvo que los electrodos que mostraron mejor comportamiento fueron el 1 y 2 por lo que se podría concluir que la electrodeposición de oro a +0.05mV beneficia la detección de Escherichia coli O157:H7, además es importante mencionar que el método “in silico” puede ser una gran alternativa para diseñar y obtener aptámeros., Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157: H7) is one of the most important human pathogens. Its main pathogenicity mechanism is the expression of shiga toxin, since it causes serious damage to the intestinal epithelium and produces hemolytic uremic syndrome. Currently there're various mechanisms for the detection of this microorganism in aqueous matrices; among them are membrane filtration and molecular quantification. However, each of these techniques has limitations such as the time required to obtain a result, the training required by the personnel and the high costs of the equipment. Therefore, arises the need to design new methods that allow the rapid and sensitive detection of this microorganism. In this work, an electrochemical aptasensor was developed, whose recognition molecule consists of an “in silico” designed aptamer that allows the detection of E. coli in aqueous matrices. For this, a bibliographic review was carried out on scientific articles, which dealt with aptasensors designed for the detection of E. coli and from them, a database was built with the most important information of each one, such as the type of biosensor, the dissociation constant, the complete sequence that made up the aptamer. All these data were analyzed and from the best sequences the construction began, adding fragments necessary to make it a fully functional “in silico” aptamer. The designed aptamer was immobilized on silkscreened electrodes modified with gold nanoparticles and electrochemical detection was carried out through EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy), CV (Cyclic Voltammetry) and SWV (Square Wave Voltammetry). It was found that the electrodes that showed the best behavior were 1 and 2, so it could be concluded that the electrodeposition of gold at + 0.05mV benefits the detection of E. coli O157: H7. In addition, it's important to mention that the “in silico” method can be a great alternative to design and obtain aptamers., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Resumen ........................................................................................................................................ 12 Abstract ......................................................................................................................................... 14 Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Objetivos ......................................................................................................................... 18 1.1 Objetivo General ............................................................................................................. 18 1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 18 2. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 19 2.1 Detección por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). ........................................ 19 2.2 Colorimetría .................................................................................................................... 20 2.3 Fluorescencia .................................................................................................................. 21 2.4 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 22 3. Marco Teórico ................................................................................................................ 25 3.1 Enfermedades Transmitidas por Alimentos .................................................................... 25 3.2 Escherichia coli O157:H7 .............................................................................................. 25 3.2.1 Generalidades y Taxonomía ........................................................................................... 25 3.2.2 Patogenicidad .................................................................................................................. 26 3.3 Métodos de Detección .................................................................................................... 27 3.3.1 Filtración por Membrana ................................................................................................ 27 3.3.2 Métodos Moleculares (qPCR) ........................................................................................ 28 3.3.3 Método del Número Más Probable ................................................................................. 29 3.4 Biosensores ..................................................................................................................... 30 3.4.1 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 32 3.4.2 Técnica Electroquímica .................................................................................................. 33 3.5 Aptámeros ....................................................................................................................... 36 3.5.1 Ventajas y Limitantes ..................................................................................................... 38 4. Marco Legal .................................................................................................................... 40 5. Metodología .................................................................................................................... 42 5.1 Diseño de Aptámero “in silico” ..................................................................................... 42 5.2 Acondicionamiento de Electrodos Serigrafiados ............................................................ 43 5.3 Inmovilización del Aptámero ......................................................................................... 45 5.4 Detección Electroquímica de Escherichia coli O157:H7 ............................................... 46 6. Resultados y Discusión ................................................................................................... 49 6.1 Diseño “in silico” del Aptámero 917A. .......................................................................... 49 6.2 Caracterización de los Electrodos Iniciales .................................................................... 52 6.3 Inmovilización del Aptámero sobre el Electrodo Modificado con AuNP ...................... 58 6.4 Detección de Escherichia coli O157:H7 por medio de Aptasensor. .............................. 63 7. Conclusiones ................................................................................................................... 69 8. Recomendaciones ........................................................................................................... 70 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 71 Apéndices ...................................................................................................................................... 75

Digital, El diseño de biosensores electroquímicos basados en electrodos serigrafiados (SPEs) ha demostrado su aplicabilidad en una serie de áreas relacionadas con la salud pública, que requieren el desarrollo de técnicas y dispositivos para la detección de microorganismos patógenos debido a su simplicidad y alta sensibilidad. Por consiguiente, se desarrolló un biosensor electroquímico para la detección analítica rápida de Escherichia coli mediante la modificación de un electrodo serigrafiado (SPE) con nanopartículas de oro y péptidos PEPTIR como elemento biológico de reconocimiento. En este estudio se analizó la influencia de diferentes parámetros experimentales como la síntesis de nanopartículas, inmovilización del péptido y concentración de E. coli en la respuesta del biosensor para mejorar la respuesta. Para el diseño del biosensor, se utilizaron péptidos diseñados en el grupo de investigación CIBAS; PEPTIR 1,0 CQKVNIDELGNAIPSGVLKDD y PEPTIR 2,0 CQKVNIAELGNAIPSGVLKDD. El péptido 1 corresponde a un péptido análogo a la proteína TIR (Translocated Intimin Receptoren) y el péptido 2,0 corresponde a un péptido análogo a la proteína TIR modificado con el cambio de una Asparagina por una Alanina. Se encontró que los electrodos modificados con AuNPs a potencial de reducción de -0,05 V por 100 s favorecía el proceso de síntesis de nanopartículas sobre la superficie del electrodo. Por su parte, cuando se utilizó una concentración baja de péptido (100 nM) para la inmovilización se presentaron los mejores resultados en la detección de E. coli. Cuando se utilizó PEPTIR 1,0 para la modificación de los electrodos se presentó una tendencia lineal en la curva de cuantificación en un rango de concentración de E. coli entre 10 y 250 UFC/mL, que indica que la concentración de la bacteria es directamente proporcional al ΔINormalizado obtenido de la señal del sensor. Este trabajo demuestra que los electrodos modificados con nanopartículas de oro y péptidos PEPTIR como elemento de reconocimiento molecular en la detección de bacterias es una plataforma prometedora para el desarrollo de biosensores electroquímicos., The design of electrochemical biosensors based on screen-printed electrodes (SPEs) has demonstrated its applicability in a series of areas related to public health, which require the development of techniques and devices for the detection of pathogenic microorganisms due to its simplicity and high sensitivity. Consequently, an electrochemical biosensor was developed for the rapid analytical detection of Escherichia coli by modifying a silkscreened electrode (SPE) with gold nanoparticles and PEPTIR peptides as a biological recognition element. In this study, the influence of different experimental parameters such as nanoparticle synthesis, peptide immobilization and E. coli concentration on the response of the biosensor to improve the response was analyzed. For the design of the biosensor, peptides designed in the CIBAS research group were used; PEPTIR 1,0 CQKVNIDELGNAIPSGVLKDD and PEPTIR 2,0 CQKVNIAELGNAIPSGVLKDD. Peptide 1 corresponds to a peptide analogous to the TIR protein (Translocated Intimin Receptors) and peptide 2,0 corresponds to a peptide analogous to the TIR protein modified with the change of an Asparagine for an Alanine. Electrodes modified with AuNPs at a reduction potential of -0,05 V per 100 s were found to favor the nanoparticle synthesis process on the electrode surface. For its part, when a low concentration of peptide (100 nM) was used for immobilization, the best results were presented in the detection of E. coli. When PEPTIR 1,0 was used for the modification of the electrodes, a linear behavior was presented in the quantification curve in an E. coli concentration range between 10 and 250 CFU / mL, which indicates that the concentration of the bacteria is directly proportional to the Normalized ΔIN obtained from the sensor signal. This work shows that electrodes modified with gold nanoparticles and PEPTIR peptides as an element of molecular recognition in the detection of bacteria is a promising platform for the development of electrochemical biosensors., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Capítulo 1. Introducción ..............................................................................................................1 Capítulo 2. ..................................................................................................................................7 Objetivos .................................................................................................................................7 Objetivo general ......................................................................................................................7 Objetivos específicos ...............................................................................................................7 Capítulo 3. Marco de antecedentes ..............................................................................................8 Capítulo 4. Marco teórico .......................................................................................................... 26 Capítulo 5. Marco legal ............................................................................................................. 36 Capítulo 6. Metodología ............................................................................................................ 38 Capítulo 7. Resultados y discusión ............................................................................................ 48 Conclusiones ............................................................................................................................. 80 Recomendaciones ..................................................................................................................... 82 Referencias bibliograficas ......................................................................................................... 84

156 p, Due to environmental requirements, the treatment of water from industrial processes has become a priority and under this premise phenol has served as a model compound to test new treatment processes mainly because it is a molecule that represents a family of chemical compounds with high toxicity and known and also these compounds are produced by many important industrial processes such as the oil, pharmaceutical, food industry, among others. Many processes have been tested to reduce the amount of phenols in water, but it has been found over the years that biodegradation is the simplest, most economical and easiest application process for the large volumes of industrial water produced. The objective of this research was to evaluate the biodegradation of phenol in aqueous medium by double-encapsulated bacteria in PVA-Alg and silica matrices. Different ratios of PVA and Alg and sodium and ludox® silicate were evaluated to find the best matrix for the study of phenol biodegradation. Likewise, a microorganism with the ability to degrade hydrocarbons was isolated. The results obtained allowed us to show that the best PVA-Alg matrix was P4-A1, since it presented the best results in the feasibility, shape, size and stability tests. It was found that the best matrix of sodium and ludox® silicate was S1-L5 because it presented, possibly a smaller pore size compared to the other matrices evaluated. Finally, regarding the biodegradation test, it was found that the phenol removal capacity by the free-isolated and encapsulated microorganism in the P4-A1 matrix was greater than the phenol removal capacity by Pseudomonas putida ATCC 49128 with 12 and 14% removal by the isolated microorganism and 7 and 10% by Pseudomonas putida ATCC 49128., Por exigencias medioambientales se ha vuelto prioritario el tratamiento de las aguas provenientes de procesos industriales y bajo esta premisa el fenol ha servido como compuesto modelo para probar nuevos procesos de tratamiento debido principalmente a que es una molécula que representa una familia de compuestos químicos con toxicidad alta y conocida y además estos compuestos son producidos por muchos procesos industriales importantes como la industria del petróleo, farmacéutica, alimenticia, entre otros. Se han probado muchos procesos para reducir la cantidad de fenol en aguas, pero se ha encontrado a lo largo de los años que la biodegradación es el proceso más sencillo, económico y de más fácil aplicación para los grandes volúmenes de aguas industriales que se producen. El objetivo de esta investigación fue evaluar la biodegradación de fenol en medio acuoso por bacterias doblemente encapsuladas en matrices de PVA-Alg y sílice. Se evaluaron diferentes relaciones de PVA y Alg y silicato de sodio y ludox® para encontrar la mejor matriz para el estudio de biodegradación de fenol. Así mismo, se aisló un microorganismo con capacidad para degradar hidrocarburos. Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que la mejor matriz de PVA-Alg fue P4-A1, pues presentó los mejores resultados en las pruebas de viabilidad, forma, tamaño y estabilidad. Se encontró que la mejor matriz de silicato de sodio y ludox® fue S1-L5 pues presentó, posiblemente un tamaño de poro inferior respecto a las demás matrices evaluadas. Finalmente, en cuanto a la prueba de biodegradación, se encontró que la capacidad de remoción de fenol por el microorganismo aislado de forma libre y encapsulada en la matriz P4-A1 fue mayor que la capacidad de remoción de fenol por Pseudomonas putida ATCC 49128 con una remoción de 12 y 14% por el microorganismo aislado y 7 y 10% por Pseudomonas putida ATCC 49128., Pregrado, Microbiólogo Industrial, Introducción .............................................................................................................................. 19 1. Planteamiento del problema ............................................................................................... 23 2. Justificación ....................................................................................................................... 26 3. Marco teórico ..................................................................................................................... 30 3.1. El fenol y sus derivados: origen y contaminación ............................................................... 30 3.1.1. Propiedades físicas y químicas .................................................................................... 31 3.1.2. Origen industrial ......................................................................................................... 32 3.1.3. Contaminación por el fenol y sus derivados en matrices acuosas ................................. 33 3.1.3.1. Fuentes de contaminación natural ............................................................................ 33 3.1.3.2. Fuentes de contaminación antropogénica ................................................................. 34 3.1.4. Toxicidad .................................................................................................................... 34 3.1.5 Métodos de tratamiento para la eliminación del fenol y sus derivados en matrices acuosas.36 3.1.5.1. Tratamientos físicos ................................................................................................. 37 3.1.5.2. Tratamientos químicos............................................................................................. 38 3.1.6. Inmovilización de microorganismos para el tratamiento de matrices acuosas contaminadas con fenol y sus derivados........................................................................................................... 47 3.1.6.1. Materiales de soporte orgánicos ............................................................................... 48 3.1.6.2. Materiales de soporte inorgánicos ............................................................................ 49 3.1.6.3. Materiales de soporte compuestos ............................................................................ 49 3.1.7. Técnicas de inmovilización ......................................................................................... 50 3.1.7.1. Encapsulación de microorganismos ......................................................................... 50 4. Marco Referencial .............................................................................................................. 53 5. Hipótesis ............................................................................................................................ 61 6. Objetivos ........................................................................................................................... 62 6.1. Objetivo general ................................................................................................................. 62 6.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 62 7. Metodología ....................................................................................................................... 63 7.1. Adaptación del microorganismo de referencia ATCC al fenol como fuente de carbono ....... 63 7.2. Aislamiento de microorganismos con capacidad para degradar hidrocarburos .................... 64 7.3. Determinación de la concentración máxima tolerable de fenol ............................................ 65 7.4. Encapsulación de microorganismos en matrices de polivinil alcohol-alginato (PVA-Alg) ... 66 7.4.1. Preparación del inóculo ............................................................................................... 66 7.4.2. Preparación de los polímeros de PVA-Alg .................................................................. 66 7.5. Evaluación y selección de las mejores condiciones de encapsulación en matrices de PVA-Alg para pruebas posteriores ............................................................................................................ 68 7.5.1. Prueba de viabilidad .................................................................................................... 69 7.5.2. Prueba de la forma y tamaño ....................................................................................... 69 7.5.3. Prueba de estabilidad................................................................................................... 70 7.6. Recuento de microorganismos en la mejor relación de la matriz de PVA-Alg ..................... 70 7.7. Encapsulación en sílice de microorganismos en matrices de PVA-Alg (doble encapsulación)72 7.7.1.Preparación de los geles de sílice ...................................................................................... 72 7.7.2. Prueba de difusión del colorante rojo fenol en matrices de sílice .................................. 74 7.7.3. Doble encapsulación de microorganismos en PVA-Alg y sílice ................................... 74 7.8. Curva de calibración de fenol ............................................................................................. 76 7.8.1. Preparación de las soluciones estándar de fenol ........................................................... 76 7.8.2. Establecimiento de la longitud de onda de máxima absorción ...................................... 76 7.8.3. Medición espectrofotométrica de las soluciones de fenol y establecimiento del rango de trabajo…………………………………………………………………………………..77 7.9. Prueba de biodegradación de fenol en medio acuoso por bacterias doblemente encapsuladas en matrices de PVA-Alg y sílice .................................................................................................... 77 7.9.1. Montaje de la prueba ................................................................................................... 77 7.9.2. Medición de la concentración de fenol ........................................................................ 80 8. Resultados.......................................................................................................................... 81 8.1. Adaptación del microorganismo de referencia al fenol como fuente de carbono .................. 81 8.2. Aislamiento de microorganismos con capacidad para degradar hidrocarburos .................... 82 8.3. Definición de la concentración máxima tolerable ................................................................ 85 8.4. Definición de las variables para la primera encapsulación (PVA-Alg) ................................ 87 8.4.1. Prueba de viabilidad .................................................................................................... 87 8.4.2. Prueba de la forma de las matrices de PVA-Alg .......................................................... 89 8.4.3. Prueba de estabilidad................................................................................................... 91 8.5. Recuento de microorganismos en la perla P4-A1 ................................................................ 96 8.5.1. Recuento de Pseudomonas putida ATCC 49128 ......................................................... 96 8.5.2. Recuento del microorganismo aislado (CNP) .............................................................. 96 8.6. Definición de las variables para la doble encapsulación en sílice......................................... 97 8.6.1. Preparación de los geles de sílice ................................................................................. 97 8.6.2. Prueba de difusión del colorante rojo fenol en matrices de sílice .................................. 98 8.7. Doble encapsulación de microorganismos en matrices de PVA-Alg y sílice ..................... 100 8.8. Prueba de biodegradación de fenol en medio acuoso por bacterias doblemente encapsuladas en matrices de PVA-Alg y sílice .................................................................................................. 101 9. Discusión ......................................................................................................................... 108 Conclusiones ........................................................................................................................... 118 Recomendaciones ................................................................................................................... 119 Bibliografía ............................................................................................................................. 120 Anexos .................................................................................................................................... 142, Ej. 1

En la actualidad el mercado de los servicios se ha desarrollado con fuerza por la globalización. El deseo de los ciudadanos por obtener un mejor servicio por parte del Estado se orienta a exigir servicios de calidad. Las bases fundamentales del éxito en las organizaciones dependen de la calidad en la atención del cliente, ya que, son la razón de ser del negocio sea este público o privado. La atención al usuario es fundamental en la razón de ser del servicio público. Los servicios ciudadanos de calidad mejora la gestión de la administración pública. Las estrategias de servicio al usuario colaboran a alcanzar los objetivos planteados por la organización dentro de su visión. El objetivo de este trabajo busca mejorar las estrategias de atención al usuario de la Dirección de Defensa del Consumidor del Ministerio de Industrias y Productividad ubicado en la ciudad de Guayaquil. Este mejoramiento de la calidad, permitirá que se desarrolle el ambiente necesario para alcanzar la calidad de atención requerida por el ciudadano. Palabras Claves: Atención al Usuario, Estrategias, Modelo de Gestión Diseño de un modelo de gestión por procesos para el Servicio de Atención al Usuario de la Dirección de Defensa del Consumidor del Ministerio de Industrias y Productividad en la ciudad de Guayaquil.