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In der Diagnostik und Therapie des Neuroblastoms wird radioaktiv markiertes Metaiodbenzylguanidin (mIBG) eingesetzt. [123I]mIBG dient der szintigraphischen Darstellung des Tumors. [131I]mIBG wird in der Therapie des Neuroblastoms genutzt. Durch strukturelle Ähnlichkeit zu Noradrenalin (NA) wird die Substanz ebenfalls aktiv über den Noradrenalintransporer (NAT) aufgenommen, welcher von den meisten Neuroblastomen exprimiert wird. Allerdings kommt es durch eine Inkorporation über den Organischen Kationentransporter (OCT) zusätzlich zur Anreicherung von mIBG in nicht-tumoralen Körperzellen, wodurch die diagnostischen Bedingungen deutlich erschwert werden. Bayer et al. zeigte in Messungen mit radioaktiv markierten Katecholaminen, dass das Glucocorticoid (GC) Corticosteron die Aufnahme in den OCT hemmt, während Neuroblastomzellen kaum beeinflusst werden. Schlussfolgernd wird weniger mIBG in nicht-maligne Zellen inkorporiert und es kann zu einer Verlagerung des radioaktiven Uptake in die Tumorzellen kommen. Da Corticosteron nicht im klinischen Alltag verwendet wird, war es Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob auch andere klinisch relevante GC diesen Einfluss auf den OCT haben, während die Neuroblastomzellen weitgehend unbeeinflusst bleiben. Im Rahmen von Screening- und Hauptversuchen wurden eine OCT3-exprimierende Zelllinie sowie NAT-exprimierende Neuroblastomzelllinien mit verschiedenen GC sowie [³H]Dopamin ([³H]DA) bzw. [³H]NA versetzt, um schließlich die radioaktive Aufnahme im β-Counter zu quantifizieren. Es bestätigte sich eine statistisch signifikante Reduktion der Katecholaminaufnahme in die OCT3-Zellen unter Einfluss der verwendeten GC. Hingegen konnten bei den Neuroblastomzelllinien unter gleichen Versuchsbedingungen keine signifikanten Veränderungen registriert werden. Um einen Überblick über die wesentlichen Schlussfolgerungen der vorliegenden Arbeit zu geben, werden diese im Folgenden zusammengefasst: 1. Eine GC-abhängige Hemmung der mIBG Aufnahme in die extraneuronalen OCT3-exprimierenden Zellen, welche sich indirekt aus den Ergebnissen dieser Arbeit erschließen lässt, könnte die Sensitivität und Spezifität der Neuroblastom Szintigraphie steigern. 2. Prednisolon und Hydrocortison zeigten die beste inhibitorische Wirkung auf die OCT3-Zellen. 3. Nebenwirkungen, welche möglicherweise im Zusammenhang mit einer mIBG-Aufnahme in gesunde Körperzellen stehen, könnten durch eine spezifische Hemmung des OCT3 reduziert werden. 4. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass radioaktiv markiertes 6-[18F]Fluordopamin (6-[18F]FDA) in Zukunft als mögliche Alternative zu mIBG in der Neuroblastomdiagnostik genutzt werden könnte. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit für einen möglichen Einsatz der klinisch verwendeten GC Prednisolon und Hydrocortison vor der Neuroblastomdiagnostik/-therapie mit radioaktiv markiertem mIBG. Dennoch lassen sich in vitro Versuche nur bedingt auf in vivo Versuche übertragen. Zur Validierung der hier aufgestellten Schlussfolgerungen sind somit weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet notwendig.

In der vorliegenden Doktorarbeit wurde der Einsatz von Antikörpern, die gegen das beim Neuroblastom stark exprimierte Gangliosid GD2 gerichtet sind an Neuroblastomzellen in vitro untersucht. Dabei wurde vergleichend die Granulozyten ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity) im Vergleich zur CDC (Complement dependent cytotoxicity) analysiert. Für diese Untersuchungen wurden zwei Antikörper verwendet, die sich nur dadurch unterschieden, dass der eine von beiden keine Complementbindungsstelle besitzt. Zusammenfassend kann für diese in vitro Versuche gesagt werden, dass der Verlust der Complement-Aktivierungsstelle eine deutliche Reduzierung der cytotoxischen Aktivität von AK- im Vergleich zu AK+ darstellt, während der Beitrag der Granulozyten ADCC im Vergleich dazu eher gering ist. Biobran® könnte ein aussichtsreicher BRM sein, vorausgesetzt, dass die positiven Effekte der Granulozyten-ADCC bei der Abwehr von Tumor (Neuroblastom)- Zellen die negativen (potentielle Wirkung als Suppressorzelle) überwiegen.

Die hier vorliegende medizinische Doktorarbeit über neutrophile Granulozyten ist in zwei Teile gegliedert. Im ersten Teil wird eine eingehende Charakterisierung der neutrophilen Granulozyten vorgenommen. Dabei wird – neben der Beschreibung der klassischen Funktionen der Granulozyten (Mechanismen der Chemotaxis, der Phagozytose und der Abtötungsmechanismen von Mikroorganismen) – auf verschiedene neue Aspekte eingegangen, die in den letzten Jahren das Bild dieser Zellen der unspezifischen Immunabwehr entscheidend erweitert haben (alternative Interpretationen der Rolle von ROS bei der Abtötung der Mikroorganismen; extrazelluläres killing durch NETs; Präsens von T-Zell-Rezeptoren bei einer Subpopulation der Neutrophilen; Rolle der Neutrophilen als Supressorzellen). Im zweiten, dem experimentellen Teil der Arbeit, wird insbesondere der Frage nachgegangen, welchen Einfluss die Isolierung und anschließende kurzzeitige Lagerung der Granulozyten auf ihre Eigenschaften und Funktionen aufweist. In Gegensatz zu anderen Blutzellen sind neutrophile Granulozyten recht labile, kurzlebige Zellen, eine Tatsache, die bei experimentellen Arbeiten, aber auch hinsichtlich der klinischen Anwendungen (Granulozyten-Transfusionen) zu berücksichtigen ist. Untersuchungen am Blutbildanalysator ADVIA120, der die Leukozyten u.a. über die lysosomale Myeloperoxidase (MPO) der neutrophilen Granulozyten charakterisiert, haben gezeigt, dass es bereits während ihrer Isolierung aus dem Vollblut zu einer massiven Degranulation kommt. Da Neutrophile ihren Energiestoffwechsel (ATP-Produktion aus Glukose) praktisch ausschließlich über die anaerobe Glykolyse durchführen, wurden der Glykogenstatus, der Glukoseumsatz, die Laktatproduktion sowie der ATP-Satus nach bis zu 24-stündiger Lagerung untersucht: Während innerhalb der ersten Stunden kaum Abweichungen im Vergleich zur direkten Bestimmung nach der Isolierung zu verzeichnen waren, sind nach 24 Stunden gravierende Abnahmen zu verzeichnen. Ähnlich stellt sich die Situation bei Funktionsprozessen (Messung des „oxidativen bursts“ nach Aktivierung mit opsonisiertem Zymosan) dar. Die Lagerung in Gegenwart von G-CSF bzw. GM-CSF führte nur zu einer geringfügigen Stabilisierung der meisten untersuchten Parameter über die Lagerungsdauer. Insgesamt kann aus diesen Untersuchungen abgeleitet werden, dass a) die Entfernung der Granulozyten aus dem Vollblut trotz der relativ schonenden Isolierung (Histopaque®-Gradientenzentrifugation) bereits zu einer Beeinträchtigung der Stabilität (Degranulation) führt, und b) die isolierten Granulozyten in den ersten Stunden danach relativ stabil bleiben und erst bei längerer Inkubationszeit (> 4 - 24 Stunden) massive Funktionsverluste zeigen. Untersuchungen mit Granulozyten sollten somit so schnell wie möglich nach ihrer Isolierung durchgeführt werden. In einem weiteren Versuchsblock wurde abschließend der Frage nachgegangen, ob und wie die nach obigen Schema gewonnenen Granulozyten in der Lage sind, in der ADCC-Reaktion (engl.: „antibody dependent cellular cytotoxity“) Neuroblastomzellen abzutöten. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass der bereits klinisch angewandte Antikörper „CHIMERIC Antibody CH 14.18” (= AK+), der gegen das Gangliosid GD2 gerichtet ist, in Gegenwart von G-CSF bzw. GM- CSF Neuroblastomzellen im Rahmen der Granulozyten-ADCC abtöten kann, wobei dieser Prozess ohne die Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen abläuft. Versuche mit diesem gegen das Gangliosid GD2 gerichteten AK mit Komplementbindungsstelle (AK+) haben jedoch gezeigt, dass dazu allerdings recht hohe E:T-Verhältnisse und ebenso eine Voraktivierung der Granulozyten mit G- CSF bzw. GM-CSF erforderlich sind (Bruchelt et al, 1989). Im klinischen Alltag führte der Einsatz von AK+ zu massiven Nebenwirkungen (u.a. Schmerzen; Yu et al, 1998) bei den Patienten. Deshalb wurde ein Antikörper hergestellt, der diese Komplementbindungsstelle nicht besitzt (MoAb Hu 14.18, = AK-). In den durchgeführten Untersuchungen wurde mit Hilfe des Europium-Assays untersucht, ob nun auch AK- diese ADCC-Reaktionen auslösen kann, und welchen Einfluss eine Voraktivierung mit Biobran® auf diese Reaktion hat. Ferner wurde untersucht, ob AK- seine Wirkung ohne die Bildung von ROS ausübt, wie das für AK+ bereits bekannt ist. Hierbei zeigte sich, dass sowohl das Ausmaß der ADCC als auch der Wirkungsmechanismus (keine Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen) ähnlich wie bei Einsatz des Antikörpers AK+ waren.

Neutrophile Granulozyten spielen sowohl bei der Sepsis als auch bei der Zystischen Fibrose (CF) eine herausragende Rolle. In klinischen Studien wurden verschiedene Granulozytenparameter in Blut und nativem Sputum wie Oberflächenmoleküle, verschiedene reaktive Sauerstoffverbindungen, Chemotaxis, Degranulation und Apoptose untersucht. Besonderes Augenmerk wurde auf das eventuelle Vorliegen einer Myeloperoxidasedefizienz bei Sepsis gelegt. Bei der CF-Studie wurde ein entzündungshemmendes Medikament ( Amitriptylin ) getestet. Neutrophil granulocytes play an important role for sepsis as well as for cystic fibrosis. In clinical trials different granulocyte parameters were investigated in blood and native sputum, like surface molecules, different reactive oxygen species, chemotaxis, degranulation and apoptosis. Attention was payed for eventually myeloperoxidase deficiency in sepsis. For the CF-study an anti-inflammatory treatment ( amitriptyline ) was tested.

Ziel dieser Arbeit war es das Sphingolipid Galaktocerebrosid-3-sulfat mit Hilfe der Isotachophorese quantitativ im Urin zu bestimmen. Dieses sogenannte Sulfatid wird beim Gesunden durch das körpereigene Enzym Arylsulfatase A abgebaut. Die Arylsulfatase A ist bei Patienten mit Metachromatischer Leukodystrophie (MLD) defekt, sodass das Galaktocerebrosid-3-sulfat in Zellen angehäuft wird und auch im Urin in ca. 30-40fach höherer Konzentration als beim Gesunden vorkommt. Der qualitative Nachweis von Sulfatid im Urin mittels Dünnschichtchromatographie stellt eine Standardmethode zur Diagnostik der MLD dar. Der Vorteil einer quantitativen Bestimmung des Sulfatids mit der Isotachophorese wäre, dass es eventuell möglich würde die Effekte einer Enzymersatztherapie der MLD zu überprüfen. Des weiteren könnte die Diagnostik der MLD vereinfacht und der Materialbedarf gegenüber der Dünnschichtchromatographie verringert werden. Mit Hilfe der Isotachophorese wurde das aus Galaktocerebrosid-3-sulfat abgespaltete Sulfat quantitativ bestimmt. Dazu musste zunächst das im Urin enthaltene freie Sulfat entfernt werden und anschließend das Sulfatid vollständig in Galaktocerebrosid und Sulfat gespaltet werden, damit man von der Konzentration des Sulfats in der Probe auf die des ursprünglich im Urin vorhandenen Sulfatid schließen konnte. Die Sulfatabspaltung erfolgte mit einer rekombinant hergestellten Arylsulfatase A, die auch im Rahmen der Enzymersatztherapie der MLD eingesetzt wird. Durch eine geeignete Aufarbeitung war es möglich, das endogene Sulfat im Urin nachweislich zu entfernen und durch einen geeigneten Puffer konnte eine vollständige Abspaltung des Sulfats von Galaktocerebrosid-3-sulfat durch die rekombinante Arylsulfatase A erreicht werden. Damit konnte das Ziel der Arbeit, das Sulfatid quantitativ im Urin nachzuweisen erreicht werden. Allerdings erwies sich die Konzentration des Galaktocerebrosid-3-sulfats im Urin als zu gering, um eine genaue Bestimmung der Sulfatkonzentration bei einem Probenvolumen von 5 ml Urin zu ermöglichen. Eine Unterscheidung zwischen pathologischem Urin und der Urinprobe eines Gesunden ließ sich aber eindeutig darstellen. Ein größeres Urinvolumen einzusetzen würde dieses Problem möglicherweise beheben, war aber nicht zielführend, da damit die Forderung nach einem geringeren Materialeinsatz gegenüber der Dünnschichtchromatographie nicht mehr gegeben wäre und sich die Massenspektrometrie zunehmend zu einer Standardmethode entwickelt, mit der auch eine Bestimmung des Galaktocerebrosid-3-sulfats durchgeführt werden kann. The purpose of this analysis was to determine the quantity of the sphingolipid galactocerebroside-3-sulfate in urine by using isotachophoresis. In human cells this so-called sulfatide is degraded by the endogenous enzyme arylsulfatase A. This arylsulfatase A is defective in patients who suffer from metachromatic leukodystrophy (MLD) which causes an accumulation of galactocerebroside-3-sulfate in the cells and leads to a concentration of galactocerebroside-3-sulfate in urine which is 30 to 40 times higher than in a healthy person’s urine. The qualitative analysis of sulfatide in urine by utilizing thin layer chromatography is a standard method for MLD diagnosis. As an advantage of a quantitative analysis of sulfatide by isotachophoresis, it might be possible to monitor the effects of an enzymatic replacement therapy of MLD. Furthermore the diagnosis of MLD could be simplified and material requirements could be reduced in contrast to thin layer chromatography. The fraction of sulfate which was split off the galactocerebroside-3-sulfate was determined quantitatively using isotachophoresis. For that purpose, the free sulfate contained in urine had to be removed first. The next step was to completely split up the sulfatide into galactocerebroside and sulfate. Finally, by measuring the concentration of sulfate in the sample, it was possible to determine the original quantity of sulfatide in the urine. The sulfatide was cleaved using a recombinant compounded arylsulfatase A, which is used also in enzymatic replacement therapy of MLD. By using an appropriate reprocessing technique, it was possible to verifiable remove the endogenous sulfate entirely. With a suitable buffer a complete cleavage of sulfate from the galactocerebroside-3-sulfate by arylsulfatase A could be achieved. In conclusion the purpose of this analysis, which was to quantitatively determine the sulfatide in urine, has been accomplished. However the concentration of galactocerebroside-3-sulfate in urine was too low to perform an exact determination of the concentration of sulfate in a 5 ml sample. It was nevertheless possible to clearly distinguish between pathological and non-pathological urine samples. Using a larger sample might have solved this problem, but this would have gone beyond the scope of this analysis as one of the requirements was to use less material than in thin layer chromatography. Additionally, mass spectrometry which also allows a quantitative determination of galactocerebroside-3-sulfate has recently been developing into a standard method.

Die metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine lysosomale Speicherkrankheit, die durch den Funktionsverlust des Enzyms Arylsulfatase A verursacht wird und zur Anreicherung von 3-Sulfo-Galactocerebrosid (Sulfatid) in den Geweben, insbesondere in Oligodendrozyten und Schwann-Zellen, führt. Als Therapie der MLD wird neben der Stammzelltransplantation versuchsweise auch die Enzymersatztherapie mit der rekombinanten humanen Arylsulfatase A (rhASA) eingesetzt. Aufgabe dieser Arbeit war es, die Aktivität und Spezifität der rhASA mit Hilfe der analytischen Isotachophorese (ITP) zu untersuchen und mit derjenigen von Sulfatasen in Leukozytenextrakten, die mittels Dextransedimentation gewonnen wurden, zu vergleichen. Dazu wurden zuerst Untersuchungen zum Abbau des künstlichen Substrats p-Nitrocatecholsulfat (pNCS) durch rhASA unter verschiedenen Inkubationsbedingungen mit Hilfe der Photometrie, einem Standardverfahren zur Diagnose von Speicherkrankheiten, durchgeführt und danach der Abbau von Sulfatid durch rhASA anhand der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen. Schliesslich wurde der Umsatz verschiedener Substrate durch rhASA und Leukozytenextrakte mit Hilfe der ITP miteinander verglichen und so die Spezifität der rhASA untersucht. Mit Hilfe der ITP wurde der Umsatz der 3 Substrate pNCS, Ascorbylsulfat und Galactose-6-sulfat durch rhASA und Leukozytenextrakte untersucht. Mit dieser Methode konnte nachgewiesen werden, dass pNCS und Ascorbylsulfat sowohl durch rhASA als auch durch Leukozytenextrakte, Galactose-6-sulfat jedoch nur durch Leukozytenextrakte abgebaut wird, was darauf zurückzuführen ist, dass Galactose-6-sulfat kein Substrat der Arylsulfatase A ist, von anderen Sulfatasen, die in den Leukozytenextrakten vorhanden sind, jedoch sehr wohl umgesetzt wird. Die ITP erlaubt also durch die Auswahl geeigneter Substrate (Sulfate) die Charakterisierung der Aktivität verschiedener Sulfatasen und kann so z.B. durch Verwendung der oben angeführten Substrate in einem einzigen Analysenlauf eine Differenzierung zwischen metachromatischer Leukodystrophie (MLD) und multiplem Sulfatase-Mangel (MSD) ermöglichen, da mit ihr der Abbau mehrerer Substrate simultan verfolgt werden kann. Metachromatic leukodystrophy (MLD) is a lysosomal storage disease (LSD), which is caused by a functional loss of the enzyme arylsulfatase A and leads to the accumulation of the sphingolipid galactocerebroside-3-sulfate (sulfatide) in tissues, especially in oligodendrocytes and Schwann cells. In lieu of stem cell transplantation, enzyme replacement therapy with recombinant human arylsulfatase A (rhASA) is experimantally being used as a treatment of MLD. The purpose of this thesis is to investigate the activity and specificity of rhASA by using analytical isotachophoresis (ITP) and to compare it with those of sulfatases in leukocyte extracts won by dextransedimentation. To begin with, this thesis investigated the degradation of the artificial substrate p-nitrocatecholsulfate (pNCS) through rhASA under different incubation conditions using photometry, a standard method to diagnose storage diseases and, after that, the degradation of sulfatide through rhASA was verified using thin layer chromatography. Finally, the specificity of rhASA has been investigated by comparing the degradation of different substrates through rhASA and leukocyte extracts using ITP. Degradation of the three substrates pNCS, ascorbylsulfate and galactose-6-sulfate through rhASA and leukocyte extracts was investigated using ITP. This method verified that pNCS and ascorbylsulfate degrade through rhASA as well as through leukocyte extracts, whereas galactose-6-sulfate degrades only through leukocyte extracts, which is due to galactose-6-sulfate not being a substrate of arylsulfatase A but still degrading through other sulfatases existing in leukocyte extracts. Hence ITP allows characterising the activity of different sulfatases through selection of suitable substrates (sulfates), and facilitates, e.g. by using the substrates mentioned above, a differentiation between metachromatic leukodystrophy (MLD) and multiple sulfatase deficiency (MSD) in only one analysis stage, since degradation of several substrates can be analysed simultaneously.

Im Gegensatz zu Normalzellen findet in vielen Tumorzellen eine hohe Laktatproduktion auch in Gegenwart von Sauerstoff statt („aerobe Glykolyse“, Warburg Effekt). In der vorliegenden Arbeit wurden Sauerstoffverbrauchsmessungen (Clark Elektrode) an den humanen Neuroblastomzelllinien Kelly, SK-N-SH und LS sowie ihren isolierten Mitochondrien durchgeführt und der Effekt von Glukose auf die Zellatmung wurde näher untersucht. Ergänzend wurde die Laktatproduktion der Zellen bestimmt, um Aufschlüsse über das Vorliegen des Warburg Effekts zu erlangen. Zur morphologischen Charakterisierung wurden von den isolierten Mitochondrien elektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt. Die gemessenen Respirationsraten der drei humanen Neuroblastomzelllinien Kelly, SK-N-SH und LS war proportional zur eingesetzten Zellzahl. Die Zellatmung wurde zunächst in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration bestimmt. Dabei zeigte sich, dass bei Verwendung von PBS++ als Inkubationsmedium die Zellen dann die höchste Atmungsrate aufwiesen, wenn keine Glukose im System vorhanden war. Wahrscheinlich greifen die Zellen dabei auf endogene Glukosespeicher (Glykogen) zurück. Mit zunehmender Glukosekonzentration (1mM bis 5mM) im Inkubationsmedium ging der zelluläre Sauerstoffverbrauch zurück. Unter diesen Bedingungen metabolisierten die Zellen Glukose offensichtlich vermehrt über die aerobe Glykolyse, was sich durch einen Anstieg der Laktatkonzentration bemerkbar machte. Bei Kelly- und SK-N-SH-Zellen wurden bei zunehmendem Glukoseangebot niedrigere Respirationsraten und parallel hierzu eine ansteigende Laktatproduktion festgestellt. LS-Zellen hingegen zeigten mit vermehrtem Glukoseangebot sowohl einen Anstieg der Atmungsrate als auch der Laktatbildung. Wurde statt des glukosehaltigen PBS++ RPMI 1640 verwendet, das zusätzlich zu Glukose auch andere zum Zellwachstum erforderliche Komponenten wie Glutamin (2 mM) enthält, dann wurden höhere Respirationsraten erzielt. Möglicherweise ist dies auf eine vermehrte Glutaminolyse zurück zuführen, die durch anapleurotische Reaktionen Zwischenstufen des Citratzyklus bereitstellt. Die angefertigten elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigten morphologische Unterschiede von Kelly- und SK-N-SH-Mitochondrien im Vergleich zu LS-Mitochondrien. Bei der Messung der mitochondrialen Atmungsrate wiesen allen drei Zelllinien eine Steigerung der basalen Respirationsrate nach Succinat-Zugabe auf. Da Tumorzellen unter Normalbedingungen Glukose in einem erheblichen Umfang über die aerobe Glykolyse verstoffwechseln, besteht einer der neuen therapeutischen Ansätze darin, diesen Basisstoffwechselweg medikamentös, z.B. mit Dichloracetat, in Richtung der oxidativen Phosphorylierung zu verschieben: Durch vermehrten Sauerstoffverbrauch soll bei Tumorzellen, die den Warburg Effekt aufweisen, u.a. durch das damit verbundene gesteigerte Auftreten von reaktive Sauerstoffverbindungen Apoptose bzw. eine Proliferationshemmung ausgelöst werden, wie an einigen Systemen bereits gezeigt werden konnte. Wachstumshemmende Effekte und die Umlenkung hin zu einem vermehrten Sauerstoffverbrauch durch Dichloracetat waren bei Kelly-Zellen zu verzeichnen, allerdings waren die dabei erzielten Effekte nicht sehr ausgeprägt. Trotzdem ist dieser Ansatz ein möglicher Weg zu einer Tumortherapie unter Einbeziehung des Warburg Effektes. In contrast to normal mammalian cells, many cancer cells convert glucose preferentially to lactic acid even in the presence of oxygen („aerobic glycolysis“, Warburg effect). This work presents the results of oxygen consumption measurements (Clark electrodes) of the neuroblastoma cell lines Kelly, SK-N-SH, LS and their isolated mitochondria. The effect of glucose concentration on cell respiration rate was investigated. Additionally, the lactic acid production of the examined cell lines was estimated. Electron microscopic pictures were taken for a morphologic characterization of the isolated mitochondria. Respiration rates of the three human neuroblastoma cell lines increased linearly with cell concentration. The glucose dependency of the oxygen consumption in the cell culture was determined. It was shown that cells in glucose free PBS medium displayed the highest respiration rate. Presumably in this case the cells use their endogenous glucose storage (glycogen) to fuel glycolysis. The augmentation of glucose concentration (1mM till 5 mM) led to reduced cell respiration rates. Under these circumstances an increased amount of glucose is metabolized via aerobic glycolysis which is indicated by increasing lactate concentration in the cell medium. With increasing glucose supply Kelly and SK-N-SH cells displayed lower respiration rates and higher lactic acid production. LS cells, on the other hand, showed an augmentation of oxygen consumption and lactic acid production with increased glucose concentration. Cells in RPMI 1640 showed higher respiration rates as cells in glucose supplemented PBS medium. This is probably caused by higher glutaminolysis providing Krebs cycle intermediates through anaplerotic reactions. The cell culture medium RPMI 1640 contains additionally to glucose also other components like glutamine (2mM), which are important for cell-growth. Electron microscopy of isolated mitochondria revealed morphological differences between Kelly and SK-N-SH- compared to LS cells. The mitochondria of all three cell lines showed an increase in basic respiration rate after addition of succinic acid. Under normal conditions, cancer cells metabolize glucose through aerobic glycolysis. By using new chemotherapeutic agents like dichloroacetate (DCA) new therapeutic strategies target glucose metabolism by shifting cell metabolism away from lactate production towards oxidative phosphorylation. In cancer cells exhibiting the Warburg effect it is believed that increased oxygen consumption results in an increase in oxygen radicals. These subsequently inhibit cell proliferation and induce cell death, as verified in several cell systems. The results presented here, while not conclusive, suggest that in Kelly cells dichloroacetate increases cell oxygen consumption, and inhibits cell proliferation. Therefore, the Warburg effect could be used as a potential target in anticancer therapy.

Die Rolle von Ascorbat (AA) in der Krebstherapie wird seit Jahrzehnten kontrovers diskutiert. Kürzlich erregten drei Publikationen in PNAS zu hochdosiertem AA aus Mark Levines Arbeitsgruppe am NIH Aufsehen: Zunächst wurde eine H2O2-vermittelte zytotoxische Wirkung von hochdosiertem AA auf humane Lymphom- und Mamma-Karzinom-Zelllinien in vitro gezeigt (Chen et al. 2005). Anschließend wurden in vivo in der Extrazellulärflüssigkeit von Ratten nach i.v.-Gabe von Hochdosis-AA Ascorbylradikale und daraus gebildetes H2O2 nachgewiesen (Chen et al. 2007). Zuletzt erwies sich hochdosiertes AA im Mausmodell als wirksam gegenüber verschiedenen malignen Tumoren (Chen et al. 2008). In Anwesenheit niedriger (physiologischer) Ascorbatspiegel erfolgt in malignen Zellen in vitro ein gesteigerter Abbau von HIF-1 alpha (Knowles et al. 2003). Dies führt zu einer Umlenkung der glykolytischen Energiegewinnung in Richtung oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), was einen vermehrten Anfall von reaktiven Sauerstoffverbindungen (ROS) nach sich zieht. Krebszellen zeichnen sich häufig durch eine gesteigerte aerobe Glykolyserate aus und werden üblicherweise in AA-freiem Milieu kultiviert. Entsprechend ist dieser Befund gerade für in vitro-Untersuchungen an Krebszellen von Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurde (1) die Zytotoxizität von hochdosiertem AA und H2O2 auf die Neuroblastomzelllinien Kelly (N-myc-Amplifikation) und SK-N-SH (keine N-myc-Amplifikation) bestimmt. Weiterhin wurde analysiert, wie sich niedrigdosiertes AA oder 2-Deoxy-D-Glukose (dG) auf Vitalität und Wachstum der Zellen auswirken (2). Schließlich wurde (3) der Effekt von Dichloressigsäure (DCA) auf Wachstum und Glykolyserate von Kelly-Zellen untersucht. Ad 1: Gemäß Mark Levines Publikationen wirkten steigende Konzentrationen AA (bis 10 mmol/l) oder H2O2 (bis 200 µmol/l) zunehmend zytotoxisch auf Kelly- und SK-N-SH-Zellen. Dehydroascorbat (bis 10 mmol/l) besaß einer der AA-Wirkung vergleichbare Zytotoxizität. Beide Zelllinien konnten als Bolus zugegebenes oder kontinuierlich gebildetes (Glukose/ Glukose-Oxidase) H2O2 mit steigender Zellzahl und Inkubationszeit effizienter entgiften. Ad 2: Bei Kelly-Zellen fiel ein reduziertes Wachstum in AA-haltigem Medium (50 µmol/l) auf, was auf eine verminderte Glykolyserate zurückzuführen sein könnte: Diese Zellen zeigten im Vergleich zu Zellen aus AA-freier Kultur eine etwas geringere Glukoseutilisation und Laktatproduktion. Für SK-N-SH-Zellen konnte dies nicht gezeigt werden. dG wirkte mit steigender Konzentration (bis 2 mmol/l) zunehmend zytotoxisch auf beide Zelllinien, wobei bei Kelly-Zellen eine höhere Resistenz von Zellen in AA-haltigem Milieu (50 µmol/l) auffiel. Die glykolysehemmende Wirkung von dG konnte anhand des Glukoseverbrauchs und der Laktatproduktion jedoch nicht demonstriert werden. Ad 3: DCA (500 µmol/l - 2 mmol/l) führte zu einer ca 20%igen Wachstumshemmung bei Kelly-Zellen. Gemäß dem Wirkmechanismus der Substanz (Aktivierung des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes, Umlenkung der Glykolyse in Richtung OXPHOS) wurden zeitgleich eine Abnahme von Glukoseverbrauchs und Laktatproduktion gemessen. In der vorliegenden Arbeit wurden Hinweise gefunden, dass Neuroblastomzellen mit N-myc Amplifikation zur Energiegewinnung bevorzugt die aerobe Glykolyse nutzen. Durch Umlenkung des Stoffwechsels von der Glykolyse in Richtung OXPHOS (z.B. durch DCA), was mit einer vermehrten Bildung zytotoxischer ROS verbunden ist, könnten sich neuartige Therapiestrategien ergeben. Von besonderem Interesse - gerade hinsichtlich der Behandlung schwer therapierbarer Krebserkrankungen wie des Neuroblastoms - ist auch die Rolle von hochdosiertem, prooxidativ wirksamen AA. Nach vielversprechenden Versuchen am Mausmodell sind am NIH klinische Studien in Vorbereitung. For decades there has been a controversy on the benefit of using ascorbate (AA) in cancer therapy. Lately, three articles in PNAS by Marc Levine et al. (NIH) generated new interest in the use of high dose ascorbate: First, high doses of ascorbate were shown to be cytotoxic to human lymphoma and mamma carcinoma cell lines in vitro. Cytotoxicity was mediated by H2O2 (Chen et al. 2005). Secondly, ascorbyl radical and H2O2 could be detected in the extracellular fluid of rats after intravenous application of high ascorbate doses. H2O2 was formed from ascorbate via ascorbyl radical (Chen et al. 2007). Thirdly, it was shown that high doses of ascorbate could reduce the growth rates of various malignant tumours in the mouse model (Chen et al. 2008). In vitro, in the presence of low (physiological) ascorbate concentrations the degradation of HIF-1 alpha is increased in malignant cells (Knowles et al. 2003). Energy metabolism is shifted from glycolysis to oxidative phosphorylation (OXPHOS). As a consequence, higher amounts of reactive oxygen species (ROS) are formed. An increased rate of aerobic glycolysis is characteristic for many malignant cells. Usually, these cells are cultivated in the absence of ascorbate. So this result is of importance, especially for in vitro-experiments with cancer cells. We examined (1) the cytotoxicity of high ascorbate concentrations and H2O2 to the neuroblastoma cell lines Kelly (N-myc-amplification) and SK-N-SH (N-myc not amplified). Furthermore, we analysed the effect of low concentrations of ascorbate or 2-deoxy-D-glucose (dG) on the vitality and the growth of both cell lines (2). At last (3), we examined the effect of dichloroacetate (DCA) on the growth and on the rate of glycolysis of Kelly cells. Ad 1: In accordance to the results of Mark Levine, AA (up to 10 mmol/l) or H2O2 (up to 200 µmol/l) were cytotoxic to Kelly and SK-N-SH cells. The cytotoxicity increased with the concentration of the substances. The cytotoxicity of dehydroascorbate (up to 10 mmol/l) was similar to the cytotoxicity of AA. Kelly cells and SK-N-SH cells were able to metabolise H2O2 if it was given as bolus and if it was formed continuously (glucose/ glucose-oxidase). The higher the cell number and the longer the incubation time, the higher was the efficiency of the metabolisation. Ad 2: In cell culture medium with AA (50 µmol/l) the growth of Kelly cells was reduced. This could be due to a decreased rate of glycolysis. In comparison to Kelly cells that were cultivated in the absence of ascorbate, glucose consumption and lactate production by Kelly cells was a little smaller in the presence of the AA. For SK-N-SH cells, this could not be shown. dG (up to 2 mmol/l) was cytotoxic to Kelly and SK-N-SH cells and the cytotoxicity increased with the substance concentration. Kelly cells, that were grown in the presence of AA (50 µmol/l), were more resistant to dG than Kelly cells cultivated in the absence of AA. By analysis of glucose consumption and lactate production, it could not be shown that dG inhibits glycolysis. Ad 3: By treatment with DCA (500 µmol/l – 2 mmol/l) growth of Kelly cells was reduced by 20%. In accordance with the molecular function of the substance (activation of the pyruvate-dehydrogenase-complex, shift of the energy metabolism from glycolysis to OXPHOS), glucose consumption and lactate production decreased at the same time. Our results suggest that neuroblastoma cells with N-myc-amplification may preferentially use aerobic glycolysis for energy production. If the energy metabolism of the cells is shifted from glycolysis to OXPHOS (by DCA, e.g.), more ROS are formed, that are cytotoxic. This could be the basis for new strategies in the therapy of cancer. Furthermore, the role of high dose, prooxidative AA is of particular interest – especially for the therapy of cancer with limited therapeutic options such as neuroblastoma. Based on the promising results in the mouse model, clinical trials are being planned at the NIH.

Phäochromozytome sowie ein Großteil der Neuroblastome exprimieren neuronale Katecholamintransporter, v.a. den Noradrenalin- (NAT) sowie evt. wenige Dopamin-transporter (DAT). Durch die Fähigkeit des NAT zur spezifischen Aufnahme von meta-Iodbenzyguanidin (mIBG), hat er in der Diagnostik und Therapie von Tumoren eine große Bedeutung. Nebenwirkungen sind u.a. durch die Aufnahme von radioaktivem mIBG in gesundes Gewebe bedingt, die wahrscheinlich über Serotonintransporter (SERT) sowie die breit im Organismus verteilten extraneuronalen Katecholamin-transporter (extraneuronale Monoamintransporter (EMT) und organische Kationen-transporter 1+2 (OCT 1+2)) stattfindet. Ziel dieser Dissertation war es, die Aufnahme von mIBG über die EMT und OCT nachzuweisen und mit spezifischen Inhibitoren zu blockieren, um eine noch selektivere Anreicherung der Radioaktivität über die NAT in die Tumorzellen zu erreichen. Hierbei dienten als Modell für die neuronalen Transporter die Neuroblastomzelllinie SK-N-SH und die Phäochromozytomzelllinie PC 12, während die CAKI-Zelllinie, sowie EMT-, OCT 1- bzw. OCT 2-exprimierende, transformierte HEK 293-Zellen das Modell für die extraneuronalen Transporter darstellten. Die Versuche wurden sowohl mit Suspensionskulturen durchgeführt, als auch mit Co-Kulturen im Transwell-system, um mit letzterem die direkte Konkurrenzsituation zwischen neuronalen und extraneuronalen Katecholamintransportern darzustellen. Untersucht wurden Desipramin als spezifischer Inhibitor der NAT und GBR 12909 als spezifischer Inhibitor der DAT. Die Hemmeffekte auf die [³H] Dopamin- bzw. [³H] Noradrenalin-aufnahme durch den kompetitiven Inhibitor mIBG wurden ermittelt, um eine indirekte Aussage über die mIBG-Aufnahme in die verschiedenen Zellen zu erhalten, da [131I] mIBG für direkte Aufnahmeversuche nur einmal zur Verfügung stand. Hierbei ergab sich nach der Stärke des mIBG-Hemmeffektes folgende absteigende Zelllinienreihenfolge: SK-N-SH = OCT 2 > PC 12 = EMT >> CAKI = OCT 1. Als weiterer kompetitiver Inhibitor wurde 6-Fluordopamin (6-FDA) verwendet, da Studien laufen, um 6-[18F] FDA zur routinemäßigen Darstellung von Neuroblastomen bzw. Phäochromozytomen mittels PET einzusetzen. Bei diesen Untersuchungen wurden EMT = SK-N-SH > PC 12 >> OCT 2 = OCT 1 > CAKI inhibiert. Im Vergleich zu mIBG konnte ein stärkerer Hemmeffekt von 6-FDA, auf die [³H] Dopaminaufnahme in neuronale SK-N-SH- und PC 12-, sowie in CAKI-Zellen beobachtet werden, während die extraneuronalen EMT-, OCT 1- und OCT 2-exprimierenden HEK 293-Zellen stärker mIBG als 6-FDA aufnahmen. Corticosteron, das in der Literatur als spezifischer Inhibitor der EMT bekannt ist, bewirkte eine nur schwache Hemmung der Katecholaminaufnahme in Neuroblastom- und Phäochromozytomzellen, jedoch eine intensive Schwächung der Aufnahme über extraneuronale Katecholamin-transporter in EMT- = CAKI- > OCT 1- = OCT 2-Zellen. Die durch Corticosteron hervorgerufenen Hemmeffekte konnten auch bei der direkten Aufnahme von [131I] mIBG bestätigt werden. Somit ergeben sich mit diesem Corticosteroid, evt. in Kombination mit weiteren Substanzen (z.B. Fluvoxetin, einem spezifischen Inhibitor des SERT), über die hin-reichende klinische Erfahrungen bezüglich der geringen Nebenwirkungen vorhanden sind, neue Ansätze für die Diagnostik und Therapie des Neuroblastoms bzw. des Phäo-chromozytoms. Durch die spezifische Blockade der extraneuronalen Katecholamin-transporter besteht die Möglichkeit, die Aufnahme von radioaktiv markiertem mIBG bzw. 6-FDA selektiver in Richtung der neuronalen NAT- bzw. DAT-exprimierenden Tumorzellen zu lenken. Dadurch könnte evt. die diagnostische Spezifität verbessert sowie die akuten und späten Nebenwirkungen vermindert werden. Somit wäre eine Erhöhung der radioaktiven Dosis denkbar, mit der Hoffnung eines längeren therapeu-tischen Tumoransprechens sowie einer verbesserten diagnostischen Sensitivität. For imaging of neuroblastoma and phaeochromocytoma, [123I]meta-Iodobenzylguanidine ([123I]mIBG) is routinely used, whereas [18F]6-fluorodopamine ([18F]6-FDA) is sporadically applied for positron emission tomography in Pheochromocytoma. Both substances are taken up by catecholamine transporters (CATs). In competition, some other cell types are able to take up catecholamines and related compounds probably by organic cation (OCT) [extraneuronal monoamine (EMT)] transporters (OCT1, OCT2, OCT3=EMT). In this study, we investigated the uptake of radioiodine-labeled meta-iodobenzylguanidine (mIBG) as well as [3H]dopamine (mimicring 6-fluorodopamine) and [3H]noradrenaline. SK-N-SH (neuroblastoma) and PC-12 (phaeochromocytoma) cells were used and compared with HEK-293 cells transfected with OCT1, OCT2 and OCT3, respectively. In order to gain a more selective uptake in CAT expressing tumor cells, different specific inhibitors were measured. Uptake of mIBG into OCT-expressing cells was similar or even better as into both CAT-expressing cell lines, whereas dopamine and noradrenaline uptake was much lower in OCT-expressing cells. In presence of corticosterone (f.c. 10-4 M], catecholamine and mIBG uptake into SK-N-SH and PC-12 cells was only slightly reduced. In contrast, this process was significantly inhibited in OCT2 and OCT3 transfected HEK-293 as well as in Caki-1 cells, which naturally express OCT3. We conclude that the wellknown corticosteroid corticosterone might be used in combination with [18F]6-FDA or [123I]mIBG to improve specific imaging of neuroblastoma and pheochromocytoma and to reduce irradiation dose to nontarget organs in [131I]mIBG treatment.

Das Neuroblastom, der häufigste extrakranielle solide Tumor des frühen Kindesalters, ist ein maligner embryonaler Tumor, der aus Zellen der Neuralleiste entsteht. Als routinemäßig eingesetztes Verfahren in der Diagnostik dieses Tumors hat sich die [123I]-mIBG Szintigrafie mittels SPECT etabliert. Das radioaktiv markierte Noradrenalin-Analogon mIBG wird von den Neuroblastomzellen über die Noradrenalintransporter (NAT) aufgenommen. Daneben gelangt diese Substanz auch in organische Kationentransporter (OCTs) exprimierende Zellen. Substanzen wie [18F]-6-DOPA und [18F]-6-Dopamin werden als Radiopharmaka bei der Positronen-Emissions-Tomografie in Kombination mit der Computertomografie (PET/CT) u.a. bei einigen neuroendokrin aktiven Tumoren in der Diagnostik und der Therapieverlaufskontrolle eingesetzt. Dopamin gelangt dabei über die NATs und die DATs in die Zellen, die aromatische Aminosäure DOPA wird über die L-Typ Aminosäuretransporter (LAT) zellulär aufgenommen. Die LATs werden von einer großen Anzahl verschiedener Gewebe exprimiert, während die NATs und die DATs ausschließlich in neuronalen Zellen vorkommen. Exemplarisch für das Neuroblastom wurden in dieser Arbeit die beiden Zelllinien SK-N-SH und Kelly und für die OCT-exprimierenden Zellen die Zelllinien Caki-1, OCT1-HEK 293, OCT2-HEK 293 und EMT (= OCT3)-HEK 293 verwendet. Als Substanzen wurden unmarkiertes 6-FDOPA und 6-FDA und radioaktives [14C]-DOPA, durch enzymatische Decarboxylierung synthetisiertes [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin eingesetzt. Die aufgenommenen Konzentrationen an 6-FDOPA und 6-FDA und die weiteren Stoffwechselprodukte wurde mittels HPLC bestimmt. Bei den radioaktiv markierten Substanzen wurde mittels beta-Counter die Aufnahmeleistung der Zelllinien für die einzelnen Substanzen mit und ohne Inhibition gemessen. Alle Zelllinien nahmen diese Substanzen auf, wobei die Aufnahme von Dopamin in die Neuroblastomzellen über die NAT (DAT) und bei den OCT-exprimierenden Zellen über die OCT erfolgte. Die aufgenommenen DOPA Konzentrationen waren höher als die von Dopamin. Innerhalb weniger Minuten wurde das von den Neuroblastom-Zelllinien aufgenommen 6-FDOPA zu 6-FDA und wahrscheinlich auch zu 6-Fluoro-Noradrenalin (6-FNA) verstoffwechselt; ebenso wurde auch das zu den Zellen gegebene 6-FDA rasch weiter metabolisiert. Da die OCT-exprimierenden Zellen über keine Enzyme der Katecholaminsynthese verfügen, konnte bei diesen Zelllinien eine solche Verstoffwechselung nicht nachgewiesen werden. Weiter wurden für die Aufnahme von [14C]-DOPA, [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin Hemmversuche mit 6-FDOPA, Tyrosin, 6-FDA und Desipramin durchgeführt. Die Aminosäuren 6-FDOPA und Tyrosin hemmten kompetitiv die Aufnahme von [14C]-DOPA. Ebenso kam es durch 6-FDA zu einer kompetitiven Hemmung der Aufnahme von [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin. Desipramin, ein selektiver Inhibitor des NAT, hemmte potent die Aufnahme von Dopamin beim Neuroblastom. Welche der beiden Substanzen als Tracer im klinischen Einsatz vorteilhafter ist, ist nicht eindeutig vorherzusagen und weitere Versuch am Kleintier-PET mit Neuroblastom-tragenden Mäusen müssen diesen Untersuchungen folgen. DOPA wird in höheren Konzentrationen unspezifischer aufgenommen als Dopamin und gelangt für diese Entität unnötigerweise durch die Bluthirnschranke, während Dopamin diese nicht überwinden kann und sich selektiv in peripheren neuronalen Zellen anreichert. Neuroblastoma, the most common extracranial solid tumor in early infancy, is a malignant embryonal tumor derived from neural-crest cells. [123I]-MIBG scintigraphy by SPECT has established as a routine method in the diagnosis of this tumor. The radiolabeled noradrenaline analog MIBG is taken up by the neuroblastoma cells via noradrenaline transporters (NATs). Additionally, the substance enters cells which express organic cation transporters (OCTs). Substances like 6-[18F]-DOPA and 6-[18F]-dopamine are used as radiopharmaceuticals with the combined positron emission/computer tomography (PET/CT), inter alia in the diagnosis and therapy follow-up of some neuroendocrine tumors. Dopamine passes into the cells via the NATs and the DATs while the aromatic amino acid DOPA is taken up via the L-type amino acid transporters (LATs). LATs are expressed in a large variety of tissues, while NATs and DATs occur exclusively in neural cells. In this dissertation the two cell lines SK-N-SH and Kelly were used for the neuroblastoma while the cell lines Caki-1, OCT1-HEK 293, OCT2-HEK 293 and EMT (= OCT3)-HEK 293 were used for OCT-expressing cells. The substances used were unlabeled 6-FDOPA and 6-FDA as well as radioactive [14C]-DOPA, [14C]-dopamine synthesised by enzymatic decarboxylation, and [3H]-dopamine. The 6-FDOPA and 6-FDA uptake concentrations as well as the other metabolism products were determined by HPLC. The uptake capacity of the cell lines for the radioactively labeled substances was measured with and without inhibitors by means of a beta-counter. The substances were taken up by all cell lines, with the dopamine being taken up by neuroblastoma cells via the NATs (DATs) and by the OCT-expressing cells via the OCTs. The uptake concentrations of DOPA were higher than those of dopamine. Within few minutes the 6-FDOPA taken up by the neuroblastoma cells was metabolised to 6-FDA und probably also to 6-fluoro-noradrenaline (6-FNA); similarly the 6-FDA given to the cells was quickly metabolised. As OCT-expressing cells do not have any enzymes of the catecholamine synthesis, such a metabolism could not be detected in these cell lines. In further inhibition tests the uptake of [14C]-DOPA, [14C]-dopamine and [3H]-dopamine was determined using 6-FDOPA, tyrosine, 6-FDA and desipramine. The amino acids 6-FDOPA and tyrosine competitively inhibited the admission of [14C]-DOPA. A competitive inhibition of [14C]-dopamine and [3H]-dopamine by 6-FDA was also observed. Desipramine, a selective NAT inhibitor, potently inhibited the uptake of dopamine into the neuroblastoma. Which of the two substances is more advantageous as a tracer in clinical practice, cannot be clearly predicted and additional tests need to be carried out with neuroblastoma-bearing mice in the small-animal PET scanner. In higher concentrations the uptake of DOPA is more unspecific than that of dopamine. For this entity DOPA unnecessarily passes the blood-brain barrier while dopamine cannot pass it and accumulates selectively in peripheral neural cells.

Der Prozess der Glykosylierung stellt eine bedeutende posttranslationale Modifikation von Proteinen dar. Veränderungen im Glykosylierungsmuster von Zellen entstehen zu einem frühen Zeitpunkt der malignen Transformation und tragen zu zahlreichen Prozessen der Tumorigenese wie Adhäsion, Migration und Immunevasion bei. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Glykosylierungsmuster von Tumorzellen und der Einfluss der Sialylierung auf die Modulation von Immunantworten untersucht. Sialinsäurereste stellen die häufigsten terminalen Karbohydrate dar und binden an Siglecs, inhibitorische Rezeptoren, die sich auf Effektorzellen des Immunsystems finden. In der vorliegenden Arbeit wurden durch Klonierung der extrazellulären Domäne von Siglec-7 rekombinante Fusionsproteine generiert. Da die Affinität zwischen einem einzelnem Glykan und Lektin nur sehr gering ist, wurden die rekombinanten Siglec-7 Fusionsproteine in Analogie zu MHC-Tetrameren oligomerisiert und dadurch verlässliche durchflusszytometrische Untersuchungen des zellulären Sialylierungsmusters ermöglicht. Liganden für Siglec-7 konnten auf humanen T-Zellen, Monozyten, NK-Zellen und einer Untergruppe von B-Zellen, die aktivierte und Gedächtnis B Zellen beinhaltet, detektiert werden. Vergleichend hierzu wurden phänotypische Untersuchungen maligner Zellen durchgeführt. Analysen mit Hilfe von Glykanarrays ergaben keine Unterschiede im Glykosylierungsmuster zwischen B Zellen und cALL Blasten. Durchflusszytometrische Untersuchungen mit Siglec-Tetrameren zeigten jedoch, dass T-ALL-Blasten im Gegensatz zu cALL Blasten eine Expression von Siglec-7 Liganden aufweisen. Da Kinder mit T-ALL eine schlechtere Prognose aufweisen als Kinder, die an cALL erkrankt sind, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Sialoglykane auf der Oberfläche maligner Zellen als Liganden für Siglecs dienen und eine Inhibition von attackierenden Effektorzellen bewirken können. Als Modellsystem zur Untersuchung der Hypothese wurden K562, die ein klassisches NK Zell Target darstellen und Liganden für Siglec-7 exprimieren, eingesetzt. In Kompetitionsassays wurde die spezifische Lyse von K562 durch NK-Zellen nach Vorinkubation mit rekombinantem Siglec-7 gesteigert. Ähnliche Ergebnisse konnten erzielt werden, wenn primäre leukämische T-ALL Blasten als Zielzellen dienten. Um Vorarbeiten für die Übertragung dieser Ergebnisse auf weitere maligne Erkrankungen zu leisten, wurden Analysen des Sialylierungsmusters von Zelllinien aus Neuroblastomen, Mamma-und Ovarialcarcinomen durchgeführt. Zellen der Neuroblastomlinie SY5Y ergaben eine Expression von alpha2,3-Sialinsäuren, nicht jedoch von alpha2,6-Sialinsäuren. Wurden die Zellen mit den Neurotrophinrezeptoren Trk A oder Trk B transfiziert, so konnte eine erniedrigte Expression von alpha2,3- Sialinsäuren auf Trk B transfizierten Zellen und eine erhöhte Expression von alpha2,6-Sialinsäuren auf Trk A und Trk B transfizierten Zellen im Vergleich zu Transfektionen mit dem Leervektor als Kontrolle detektiert werden. Liganden für Siglec-7 konnten - auch nach Stimulation mit IFNgamma - nur schwach detektiert werden. Mamma- und Ovarial-Carcinom-Linien exprimierten alpha2,3-Sialinsäuren, eine Expression von alpha2,6-Sialinsäuren war hingegen nur auf 2 von 4 untersuchten Ovarial-Carcinom- und 2 von 12 Mamma-Carcinom-Zelllinien zu finden. Liganden für Siglec-7 fanden sich auf 2 Mamma-Carcinom-Linien und auf 3 Ovarial-Carcinom-Linien. In ersten vorläufigen funktionellen Assays wurde eine erhöhte spezifische Lyse von Zellen der Mamma-Carcinom-Linie KS 24.22 nach Zugabe von rekombinantem Siglec-7 in T-Zell-vermittelten Zytotoxizitätsassays detektiert. Darüber hinaus ergaben Analysen des Sialylierungsmuster immunregulatorischer Zellen, dass regulatorische T Zellen und multipotente, mesenchymale Stromazellen Liganden für Siglec-7 auf der Oberfläche aufweisen. Dendritische Zellen regulierten im Laufe ihrer Reifung Liganden für Siglec-7 herunter. Insgesamt wurde die Arbeitshypothese bestätigt, indem gezeigt wurde, dass Sialoglykane auf leukämischen Blasten als Liganden für Siglec-7 auf der Oberfläche von NK-Zellen, dienen können. Dies könnte einen neuen Mechanismus der Immunevasion von malignen Zellen darstellen. Nähere Erkenntnisse sind für die Immuntherapie unterschiedlicher maligner Erkrankungen von Interesse. Glycosylation is an important posttranslational modification of proteins. Changes in the glycosylation pattern of cell surface proteins occur during early stages of malignant transformation. These alterations in the glycan repertoire may contribute to numerous processes of tumour cell survival such as adhesion, migration and immune evasion. The glycosylation pattern of tumour cells and the influence of sialylation on the modulation of immune responses have been analysed in this dissertation. Sialic acid is the most common terminal carbohydrate moiety of glycan structures in humans binding to a family of receptors termed sialic acid binding immunoglobulin-like lectins (siglecs). Siglecs are expressed on virtually all effector cells of the immune system and several members function as inhibitory receptors. In order to analyse the expression of siglec ligands by malignant cells, the extracellular domain of human siglec-7 was cloned. As the interaction of a single glycan and lectin is of low affinity, siglec-7 was oligomerized in analogy to MHC-tetramers in order to increase avidity. This strategy allowed for reliable use of siglec-7 fusion protein in flow cytometry. Expression of siglec-7 ligands was detected on CD4+ and CD8+ T cells as well as on monocytes, NK cells and a subgroup of B cells comprising of activated and memory B cells. Subsequently, the sialylation pattern of malignant cells was analysed. Glycanarray experiments could not detect any differences in the glycosylation pattern of B cells and primary lymphatic blasts from childhood leukaemias. Flow cytometric analyses however revealed that T-ALL blasts express ligands for siglec-7, whereas these ligands were absent from cALL blasts. As cALL is known to have a better prognosis than T-ALL, it was hypothesized that siglec-7 ligands on the surface of leukaemic blasts inhibit NK cells. To test the functional relevance of siglec-7 ligand expression for NK cell-mediated cytotoxicity the myeloid leukaemia cell line K562, which expresses siglec-7 ligands, was used as a model. In competition assays NK cell-mediated specific lysis increased in the presence of soluble siglec-7. Similar results were obtained using primary leukaemic T-ALL blasts as targets. Further experiments implied analyses of neuroblastoma, mamma carcinoma and ovarial carcinoma cell lines. Cells of the neuroblastoma cell line SY5Y expressed alpha2,3-linked sialic acid but no alpha2,6-linked sialic acid or siglec-7 ligands on their surface. After transfection with neurotrophin receptors Trk A or Trk B expression of alpha2,3-linked sialic acid decreased whereas expression of alpha2,6-linked sialic acid increased in comparison to mock transfected cells. Stimulation with IFNgamma did not influence the sialylation pattern of these cells. Mamma- and ovarial carcinoma cell lines expressed alpha2,3-linked sialic acid. Expression of alpha2,6-linked sialic acid could only be detected on 2 of 4 ovarial carcinoma cell lines and on 2 of 12 mamma carcinoma cell lines. Preliminary cytotoxicity assays showed an increased T cell-mediated specific lysis of cells of the mamma carcinoma cell line KS24.22 in the presence of recombinant soluble siglec-7. Analyses of the sialylation pattern of immunoregulatory cells revealed that regulatory T cells as well as multipotent mesenchymal stroma cells express siglec-7 ligands on their surface. Dendritic cells downregulated ligands for siglec-7 after maturation with proinflammatory cytokines. Taken together these results show that engagement of inhibitory siglecs on the surface of effector cells with sialic-acid conjugated proteins on malignant cells might contribute to immune escape mechanisms. Further results could have important implications for the immune therapy of malignant diseases.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) machen im Knochenmark einen sehr geringen Anteil von 0,005 - 0,01% aus. Neben dem Knochenmark gibt es aber auch weitere Gewebe, wie das Fettgewebe oder die Synovialflüssigkeit, aus denen MSC gewonnen werden können. Aus diesen Geweben isolierte MSC wurden auf ihre Morphologie und ihre Oberflächenmarker hin verglichen. So wurden die verschiedenen MSC-Populationen zuerst immunphänotypisiert. Hierbei zeigte sich eine weitreichende Ähnlichkeit der einzelnen Zellpopulationen. Die Wirkung der Zellen auf aktivierte PBMC wurde in anschließenden Experimenten analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass MSC in vitro keine Alloreaktivität der PBMC auslösen, sondern vielmehr proliferierende PBMC in ihrem Wachstum gehemmt werden können, wenn MSC anwesend sind. In einem weiteren Schritt wurde der Einfluss von MSC auf verschiedene Subpopulationen von PBMC näher betrachtet. Sowohl CD4+ als auch CD8+ Zellen werden von MSC inhibiert, NK-Zellen sind aber nicht in gleicher Weise betroffen. Bei dieser Population fand lediglich eine Hemmung der CD56dim NK-Zellen statt. CD56bright NK-Zellen konnten durch die Anwesenheit von MSC nicht gehemmt werden und zeigten sogar eine verstärkte Proliferation. Durch weitere Experimente wurde untersucht, ob ein Zell-Zell-Kontakt notwendig ist oder nicht, damit MSC ihre inhibitorischen Fähigkeiten aufzeigen können. Die Ergebnisse hierzu weisen auf den Einfluss sowohl eines löslichen als auch eines zellmembranständigen Faktors hin. Zusätzlich wurden MSC von Patienten mit schwerer aplastischer Anämie oder aus Gelenkpunktaten von Patienten mit Juveniler idiopathischer Arthritis analysiert. Die aus den Punktaten gewonnenen MSC wurden zusätzlich auf ihre Differenzierungsfähigkeit in Adipozyten und Osteoblasten untersucht. Dabei konnte die Umwandlung der Zellen in Adipozyten wiederholt erfolgreich durchgeführt werden. Die Differenzierung in Osteoblasten hingegen war eingeschränkt. In sieben Einzelheilversuchen hat die Kinderklinik Tübingen MSC erstmals bei Kindern zur Therapie einer GvHD oder Transplantatversagen nach Stammzelltransplantation komplikationslos und erfolgreich einsetzen können. Die Ergebnisse dieser Transplantationen werden ebenfalls in der Arbeit vorgestellt. Mesenchymal stem cells (MSC) comprise a rare population (between 0.001% and 0.01%) in human bone marrow. Except for bone marrow, MSC can be isolated from fatty tissue and synovial fluid. MSC isolated from those tissues were compared in terms of their morphology and their surface antigens. First, different MSC populations were immunophenotyped. In this context a close resemblance of those populations was seen. Subsequently, the effect of MSC on activated PBMC was tested. MSC from either source did not elicit alloreactivity by PBMC. Moreover, proliferation of PBMC was inhibited in the presence of MSC. In another set of experiments the influence of MSC on PBMC subpopulations was analysed. Whereas CD4+ as well as CD8+ T cells were inhibited, NK cells behaved different. IL-2 induced proliferation of CD56dim NK cells was partially inhibited, whereas CD56bright were not inhibited by MSC. The necessity of cell-cell-contact in this inhibitory effect of MSC was investigated. A soluble and a membrane-associated factor are involved in the mechanism. In addition to MSC of leukaemia patients, MSC from severe aplastic anaemia patients and MSC isolated from synovial fluid of juvenile idiopathic arthritis patients were analysed. Whereas the diffentiation of MSC from these sources into adipocytes was as expecected, the osteogenic potential was limited. As a therapy of GvHD or graft failure, allogeneic MSC were transplanted in seven children. There were no acute adverse effects or toxicity during the observation period. Safety and feasibility of these transplantations are also discussed in this work.

Dendritische Zellen (DC) sind potente antigenpräsentierende Zellen und können gegen das jeweilige Antigen entweder eine Immunantwort oder aber für dieses immunologische Toleranz induzieren. Bisher sind hauptsächlich Protein-Protein-Wechselwirkungen untersucht worden, ohne dass schlüssig der Mechanismus der Toleranzinduktion bei unreifen DC und regulatorischen T-Zellen aufgeklärt werden konnte. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Sialylierung von Oberflächenproteinen mit den Lektinen SNL und MAL II, sowie die Spezifität von CD83 als Lektin untersucht. Von Monozyten abgeleitete DC reduzieren im Laufe ihrer Reifung die alpha2,6-Sialinsäuredichte auf der Zelloberfläche. Dies geht einher mit der Umstellung von Toleranzinduktion auf Immunstimulation dieser antigenpräsentierenden Zellen. Darüber hinaus wurden andere wichtige Suppressorzellen in unserem Immunsystem, die regulatorischen T-Zellen (Treg), analysiert. Auch hier wurde eine Zunahme der alpha2,6-Sialinsäuredichte auf der Zelloberfläche durch polyklonale Stimulierung gefunden. Da CD8+ T-Zellen inhibitorische Sialinsäure-bindende Rezeptoren exprimieren, kann diesem Phänotyp funktionelle Bedeutung zukommen. Im Gegensatz zu den regulatorischen Zellen zeigten immunomagnetisch aufgereinigte CD8+ zytotoxische T-Zellen bei Stimulierung eine Verringerung der alpha2,6-Sialinsäuredichte. Interessanterweise wurde die Dichte von alpha2,6-verknüpfter Sialinsäure auf CD8+ zytotoxischen T-Zellen jedoch nicht verringert, wenn sie zusammen mit CD4+ T-Zellen inkubiert wurden. Dies weist auf die inhibitorische Wirkung der CD4+CD25+ Treg in dieser Kultur hin. Die Dichte an alpha2,3-verknüpfter Sialinsäure blieb unabhängig von den Kulturbedingungen weitgehend gleich. Für die Vermittlung des inhibitorischen Signals, das von der Sialinsäure ausgeht, ist die Rezeptorfamilie der Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobuline-like lectins) wichtig. Die meisten der elf Mitglieder, die mit einer Ausnahme auf Zellen des Immunsystems exprimiert werden, besitzen ein intrazelluläres ITIM-ähnliches Motiv, das ein inhibitorisches Signal generiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Verfahren zur Expression von rekombinanten Siglec-Fusionsproteinen etabliert werden. Bisher sind DC mit den etablierten Stimulationsverfahren zu ineffektiv, um eine wirksame T-Zellantwort gegen Malignome im Menschen zu generieren. Deshalb wurde begonnen, das Oberflächenprotein CD83 zu analysieren, das reife, aktivierte DC exprimieren. Der Ligand von CD83 ist unbekannt und auch eine ihn exprimierende Zellpopulation konnte bisher aufgrund der niedrigen Affinität des CD83-Moleküls für seinen Liganden nicht eindeutig identifiziert werden. Die extrazelluläre Domäne des humanen CD83-Moleküls wurde kloniert, rekombinant in eukaryotischen 293-Zellen exprimiert und aufgereinigt. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen CD83 und der Siglec-Familie wurde bereits früh angenommen, dass der Ligand ein glykosyliertes Molekül ist. Da die Affinität zwischen Lektinen und ihren glykosylierten Liganden oft sehr gering ist, wurde das CD83-Fusionsprotein tetramerisiert um die Avidität zu erhöhen. Mit diesem Instrument konnte der Ligand auf apoptotischen und nekrotischen Zellen, insbesondere auf Thymozyten und Lymphozyten, nachgewiesen werden. Ein Glycan Array und Versuche mit dem N-Glykosylierungshemmer Tunicamycin geben Hinweise darauf, dass es sich beim Liganden von CD83 um ein N-glykosyliertes Molekül handelt. Die Ergebnisse des Glycan Array lassen darauf schließen, dass Fucose und Sialinsäure mögliche Bestandteile des Bindungsmotivs sind. Immunstimulatorische und toleranzinduzierende Zellen des Immunsystems unterscheiden sich deutlich in ihrem Sialylierungsmuster. Das bessere Verständnis der Sialylierung einerseits und Sialinsäure-bindender Rezeptoren andererseits kann dazu beitragen, die Effizienz immuntherapeutischer Verfahren zu steigern. Dendritic cells (DC) are potent antigen presenting cells and can induce either immune response or tolerance towards an antigen. To date mainly protein-protein interactions have been under investigation. The results cannot fully explain the mechanism of tolerance induction of immature DC and regulatory T cells. The sialylation of cell surface proteins with the lectins Sambucus nigra lectin and Maackia amurensis lectin II was investigated, as well as the specificity of CD83 as a lectin. During their maturation monocyte-derived dendritic cells reduce the density of alpha2,6-linked sialic acid on their cell surface. During the same time there is a switch from tolerance induction to immune stimulation of these antigen presenting cells. On another tolerogenic population, the CD4+CD25+ regulatory T cells, the density of alpha2,6-linked sialic acid was found to be increased under polyclonal stimulation in the presence of high amounts of IL-2. Since CD8+ T cells can have inhibitory sialic acid binding receptors on their surface (siglec-7 and siglec-9), this phenotype can be important. In contrast to regulatory cells, cytotoxic CD8+ T cells which have been isolated by immunomagnetic cell separation showed a reduction of the alpha2,6-linked sialic acid density under stimulatory conditions. Interestingly, the density of the alpha2,6-linked sialic acid density on cytotoxic CD8+ T lymphocytes was not reduced when they were coincubated with CD4+ T cells in a mixed lymphocyte reaction. This might indicate an inhibitory function of CD4+CD25+ T cells present in this culture. The density of alpha2,3-linked sialic acid remained largely unchanged, independent of the cell culture conditions. It is known that siglecs (Sialic acid-binding immunoglobuline-like lectins) mediate the inhibitory signal originating from sialic acid residues. All except one of the eleven siglecs are expressed on cells of the immune system and most of them have an intracellular ITIM-like motif generating an inhibitory signal. A protocol to express recombinant siglec fusion proteins was established during this work. Until now the techniques to generate DC, which are supposed to induce effective T cell responses against malignancies in humans, are still not effective enough. Therefore the cell surface protein CD83 expressed by mature activated DC was analysed. The ligand of CD83 is still unknown. The extracellular domain of human CD83 has been cloned and expressed in eucaryotic 293 cells. Due to the homology between CD83 and the siglec family it was assumed that the ligand for CD83 is a glycosylated molecule. The affinity of lectins towards their ligands is often very low. Therefore CD83 was tetramerized in order to have a greater avidity. With this instrument it was possible to detect the CD83 ligand on thymocytes and lymphocytes in the apoptotic and necrotic state. A Glycan Array and experiments with the N-glycosylation inhibitor tunicamycin showed that CD83 ligand is likely to be an N-glycosylated molecule. Sialic acid and fucose are part of the binding motif. Immunstimmulatory and tolerance inducing cells in the immune system differ in their sialylation pattern. Better understanding of the sialylation on one side and sialic acid binding receptors on the other side can contribute to make immunotherapeutic strategies of malignancies more effective.

Das Neuroblastom ist der zweithäufigste solide Tumor des Kindesalters. In fortgeschrittenen Stadien befällt er meist das Knochenmark und hat dann trotz Hochdosischemotherpie mit autologer Stammzelltransplantation eine ungünstige Prognose. Charakteristisch an den Neuroblastomzellen ist ihre Katecholaminsynthese und die Tatsache, dass sie den Noradrenalin-Transporter besitzen. Mit 6-Fluordopamin wurde eine Substanz entwickelt, die selektiv vom Noradrenalintransporter aufgenommen werden kann und in der Zelle über die Zwischenstufe 6-Hydroxydopamin in sein Chinon zerfällt und reaktive Sauerstoffverbindungen freisetzt, die ein Absterben der Zelle bewirken. Dieser Prozess kann theoretisch durch Reduktionsmittel wie Ascorbat verzögert werden, wodurch die Aufnahme von 6-Fluordopamin in die Zelle erhöht werden kann. Bei der Durchführung der Arbeit zeigte sich, dass 6-Fluordopamin nach einer einstündigen Einwirkzeit tatsächlich nur für die Neuroblastomzellen toxisch war, die den Noradrenalin-Transporter besaßen. Neuroblastomzellen ohne Noradrenalin-Transporter wurden hingegen wenig beeinträchtigt. Allerdings hatte 6-Fluordopamin auf das Wachstum und die Koloniebildung von hämatopoetischen Stammzellen eine stark hemmende Wirkung. Dies kann eventuell dadurch erklärt werden, dass 6-Fluordopamin über den Dopamin-Transporter der hämatopoetischen Stammzellen aufgenommen wird. Durch Zugabe von Ascorbat wurde die Freisetzung reaktiver Sauerstoffverbindungen so deutlich reduziert, dass es zu keiner wesentlichen Wachstumshemmung mehr kam. Letztendlich haben die Ergebnisse dieser Untersuchung zum Schluß geführt, das ursprünglich vorgesehene Konzept der Verwendung von 6-FDA zur Therapie des Neuroblastoms zu verwenden, fallen zu lassen. Erstaunlicherweise zeigten jedoch die hämatopoetischen Stammzellen, die zu Vergleichszwecken ausschließlich mit Ascorbat behandelt wurden ein höheres Koloniewachstum als die Kontrollgruppe. Da das Koloniewachstum mit der Regenerationsfähigkeit des reinfundierten autologen Knochenmarks nach Hochdosischemotherapie korrelliert, könnte Ascorbat in vivo womöglich die Regenerationsfähigkeit des Knochenmarks nach Hochdosischemotherapie steigern. Mit Blick auf die klinische Anwendung - die Gabe von Ascorbat ist nebenwirkungsarm und ein schnelleres Anwachsen der hämatopoetischen Stammzellen kann das Risiko schwerer Nebenwirkungen wie Infektionen vermindern - sind weitere Untersuchungen dazu aussichtsreich. Neuroblastoma is the second most common malignant tumour in children before the age of 6. In advanced stages it usually affects bone marrow and has an unfavourable prognosis, in spite of high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation. Characteristically, neuroblastoma cells produce catecholamines and some express the noradrenaline transporter. The catecholamine-analogous substance 6-fluorodopamine (6-FDA) is selectively transported into neuroblastoma cells by the noradrenaline and/or dopamine transporter. Within the cell it can be transformed to 6-hydroxydopamine (6-OHDA), a highly cytotoxic compound which produces reactive oxygen compounds. If neuroblastoma cells are incubated in vitro with 6-FDA, parts of it are transformed to 6-OHDA before a significant portion can be taken up by the catecholamine transport systems. This process can be delayed in the presence of ascorbate. Therefore, the time to incorporate 6-fluorodopamine can be prolongued. It was speculated to use 6-FDA for purging of bone marrow cells from contaminating neuroblastoma cells prior to autologous bone marrow transplantation. Experiments presented in this doctoral thesis showed, that 6-fluorodopamine was cytotoxic to neuroblastoma cells expressing the noradrenaline transporter after one hour incubation time in vitro. Neuroblastoma cells not expressing the noradrenaline transporter were less sensitive. Unexpectely, 6-fluorodopamine strongly reduced the growth and colony building capacity of hematopoetic stem cells,too. The reason for these strong effects are unknown. Recently, it was shown by several research groups, that also hematopoetic cells can express catecholamine transporters and, therefore, they sould also be able to take up 6-FDA. The effect of ascorbic acid was dose-dependent. Using relative small concentrations (10-25µM), ascorbate prevented the transformation of 6-FDA to 6-OHDA outside the cells and, therefore, led to a more selective cytotoxicity on neuroblastoma cells expressing the catecholamine transporter. However, by using higher concentrations (~100µM) ascorbic acid was able to prevent the cytotoxicity on catecholamine transporters expressing neuroblastoma cells- as well as on neuroblastoma cells lacking transporter expression. Due to the results obtained by these investigations, we rejected the concept for using 6-FDA for bone marrow purging from neuroblastoma cells. Amazingly, hematopoetic stem cells which were treated with ascorbate in the course of our investigations grew better and formed more hematopoetic colonies than the control groups. Since colony formation in vitro correlates with the ability of hematopoetic stem cells to regenerate bone marrow after autologous stem cell transplantation, ascorbate may also increase the regeneration of bone marrow cells in vivo.

Sphingolipidosen sind Lipidspeichererkrankungen mit häufig letalem Ausgang. Die Diagnose dieser Erkrankungen kann mit Hilfe von enzymatischen Bestimmungen in Extrakten aus Leukozyten erfolgen, wobei die Enzymaktivität pro Zellzahl als Messparameter verwendet wird. Ausgangsmaterial für routinemäßige Bestimmungen sind Leukozyten, die aus Vollblut mittels Dextransedimentation gewonnen werden. Aus einem Kollektiv gesunder Probanden werden Referenzbereiche ermittelt, deren Unterschreiten Hinweise auf eine Sphingolipidose ergeben. Diagnostische Probleme können in unteren Grenzbereichen auftreten. Um diesen unteren Grenzbereich exakter bestimmen zu können, wurden in dieser Arbeit zwei Ansätze verfolgt: Erstens wurde untersucht, zu welchen Anteilen die betreffenden Enzyme in den unterschiedlichen Leukozytenfraktionen (getrennt über Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation) vorhanden sind, um anstelle der Gesamtleukozyten als Bezugssystem die Zusammensetzung der isolierten Leukozyten über Gewichtungsfaktoren mitberücksichtigen zu können. Dabei zeigte sich, dass im Durchschnitt nach der Zellisolierung in den Monozyten ca. 4-5mal, in den Granulozyten ca. 2mal höhere Enzymaktivitäten enthalten sind als in Lymphozyten. Ein weiteres Problem in diesen Grenzbereichen kann sich dadurch ergeben, dass die häufig per Post versandten Blutproben bei der Untersuchung nicht ganz frisch sind und dadurch bereits vor der Zellisolierung, oder vermehrt bei der Zellisolierung durch Degranulation, einen Teil ihrer Enzyme verlieren, was zu falsch erniedrigten Werten führt. Deshalb wurde der Einfluss der Degranulation genauer untersucht. Hier war es v.a. hilfreich, dass die Blutzellbestimmung mit Hilfe des Bayer ADVIA 120 routinemäßig durchgeführt wurde, da dieses Gerät Granulozyten und Monozyten von den übrigen Leukozyten über deren Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität unterscheidet: Kommt es zu einer Degranulation, also u.a. zu einem Verlust der MPO, so ist das an einer Linksverschiebung der Granulozyten- und Monozytenwolken erkennbar (X-Achse: MPO-Aktivität). Degranulationsprozesse wurden sowohl bei der Zellisolierung (mechanischer Stress) als auch durch spezielle Faktoren (Cytochalasin B und N-fMLP) analysiert. Neben diesen Messungen am Bayer ADVIA 120 wurde parallel die Ausschüttung der MPO aus den Granulozyten/Monozyten mit Hilfe eines ELISAs bestimmt sowie die von vier sphingolipidabbauenden Enzymen (Beta-Galaktosidase-Defekt bei GM1-Gangliosidose, Morquio B; Arylsulfatase-A-Defekt bei metachromatischer Leukodystrophie; Hexosaminidase-A-Defekt bei Morbus Tay-Sachs; Gesamthexosaminidase-Defekt bei Morbus Sandhoff). Die Ergebnisse zeigten eine gleiche Tendenz hinsichtlich des Degranulationsverhaltens der MPO und der sphingolipidabbauenden Enzyme, wodurch aus den Bayer ADVIA 120-Grafiken im Rahmen der routinemäßigen Blutbilderstellung Rückschlüsse über das Ausmaß der Degranulation gezogen werden können. Aufgrund dieser beiden erarbeiteten Fakten (relative Enzymaktivitäten in den einzelnen Zellfraktionen der Leukozyten und der Registrierung des Ausmaßes der jeweiligen Degranulation der Probe durch Messung am Bayer ADVIA 120) ist es möglich, durch entsprechende Gewichtungsfaktoren die Aktivitäten von sphingolipidabbauenden Enzymen in den unteren Grenzbereichen genauer und eindeutiger feststellen zu können. The course of spingolipid storage diseases is often lethal. The diagnosis of this disease can be made by enzymatic measurement made out of leucocyte extracts. Measurement is expressed as enzymatic activity per cell count. Basic material for the routine tests are leukocytes which are extracted out of peripheral venous blood by dextran sedimentation. Reference values are made out of median values of a community of healthy probands. Under-running of a crtitical value is a diagnostic hint for a spingolipid storage disease. Problems in this diagnostic procedure happen in the lower threshold. To further investigate this threshold and to make more exact reference values was the aim of this work. Therefore two appendages were made: First we investigated the distribution of the measured enzyme activities (beta-galactosidase deficiency in GM1 gangliosidosis, Morquio B; arylsulfatase A deficiency in metachromatic leucodystrophy; hexosaminidase A deficiency in Tay-Sachs disease; beta-hexosaminidases A and B deficiency in Sandhoff’s disease) between the different leucocytes (seperated by density gradient centrifugation and adjacent separation by MACS method) to be able to use the different subgroup distribution of leucocytes as frame of reference via weighting factor. We could show that monocytes have 4-5 times, granulocytes approx. 2 times higher enzymatic activity than lymphocytes. Another problem is the fact that most samples arrive via mail and may therefore be in transit for some days. This means loss of enzymes into plasma before leucocytes are separated and enzymatic activity (in the cells) is measured and in consequence the attained values are false low. We therefore further investigated the influence of degranulation process. Blood cell count is made routinely by using ADVIA 120 (Bayer). This machine is able to distinguish granuloytes and monocytes from the rest of leucocyte subgroups by using their myeloperoxidase (MPO) activity. If degranulation happens - associated with loss of MPO – ADVIA diagram shows a left shift of granulocytic and monocytic pall (x-axis: MPO acitivity). Degranulation process was investigated under two conditions: cell separation (mechanic stress) and chemical stressors (cytochalasin B and N-fMLP). In addition to ADVIA 120 measurement we determined MPO distribution from granulocytes/monocytes by using ELISA as well as the distribution of the four enzymes involved in sphingolipid degradation. Our results show tendency of parallel behaviour between degranulation habits of MPO and enzymes involved in sphingolipid degradation. Using this concept it is now possible to combine results from routine cell count measurements made by Bayer ADVIA 120 and MPO measurement to make a statement concerning extent of degranulation. Conclusions: By considering the two results of this work (different distribution of enzymatic activity in leucocyte subgroups and measurement of degranulation degree by using MPO acitivity index) it is now possible to further distinguish and determine the lower threshold of sphingolipid-degradation enzymatic activites by using corresponding weighting factors.

Neutrophile Granulozyten stellen die erste zelluläre Barriere bei der Abwehr pathogener Keime dar. Ihre mikrobizide Fähigkeit beruht zu großen Teilen auf der Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen im "oxidativen burst". Dieser ist in erster Linie das Ergebnis des Zusammenspiels der Enzyme Myeloperoxidase und NADPH-Oxidase. Von beiden Enzymen sind angeborene Defekte bekannt. Dabei bleibt die Myeloperoxidasedefizienz klinisch meist inapparent, während die NADPH-Oxidase-Defizienz zum schweren Krankheitsbild der Septischen Granulomatose führt. Durch H2O2-generierende Glucose-Oxidase-haltige Liposomen (GOL) kann die Funktionalität neutrophiler Granulozyten in vitro rekonstituiert werden. Die GOL sind in wässriger Lösung allerdings nur von begrenzter Haltbarkeit. Die Lyophilisation stellt einen Ansatz zur Verbesserung der liposomalen Haltbarkeit dar. Im Rahmen des ersten Teils dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Wirkungen lyophilisierter GOL auf Neutrophile mit denen konventionell hergestellter vergleichbar sind. In Aufnahmeuntersuchungen mittels FACS-Analyse konnte gezeigt werden, dass lyophilisierte Liposomen in vergleichbarem Maße wie konventionell hergestellte Liposomen selektiv durch phagozytäre Zellen aufgenommen wurden. Weiterhin wurden Untersuchungen zur Abklärung der intrazellulären Lokalisation von Liposomen durchgeführt. Mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Liposomen innerhalb des Neutrophilen mit vorher phagozytierten Staphylococcus aureus kolokalisiert sind. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich schließlich die intraphagolysosomale Lage der Bakterien und Liposomen. In photometrischen Assays und mittels Chemilumineszenz konnte gezeigt werden, dass NADPH-Oxidase-defiziente Granulozyten nach Inkubation mit lyophilisierten Liposomen in ähnlichem Maße wie konventionell hergestellte zur Bildung von reaktiven Sauerstoffverbindungen, insbesondere von HOCl, in der Lage sind. Bei Betrachtung der unerwünschten Wirkungen der GOL zeigte sich, dass die chemotaktischen Fähigkeiten der Neutrophilen durch lyophiliserte GOL – ähnlich wie durch konventionell hergestellte lediglich gehemmt, nicht aber aufgehoben wurden. Auch die Bildung von Lipidperoxidationsprodukten lag in Größenordnungen, die durch physiologische Aktivierung von Neutrophilen erreicht wird. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Wirkungen der GOL nicht auf der Degranulation von Granulainhalten ins Außenmedium beruhen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Stabilität der Glucose-Oxidase (GO) gegenüber zellulären Einflüssen, insbesondere pH-Wert-Änderungen, oxidativen Stress und granulozytären Inhaltsstoffen. Hier konnte gezeigt werden, dass es innerhalb des Untersuchungszeitraums von zwei Stunden bei keiner der untersuchten Einflüssen zu einer nennenswerten Aktivitätsminderung kam. Die Lyophilisation stellt einen durchaus beachtenswerten Ansatz zur Verlängerung der Haltbarkeit von GOL dar und kann für eine Anwendbarkeit in vivo in Betracht gezogen werden. Die GO scheint gegenüber aktivitätsmindernden Einflüssen relativ stabil zu sein und ist daher für die H2O2-Bildung im aggressiven Milieu des Phagolysosoms sehr gut geeignet. Neutrophils constitute the first cellular barrier against pathogen germs. Their microbiocidal properties are overwhelmingly derived from the ability to produce reactive oxygen species in the ocidative burst. The oxidative burst is first and foremost the result of the interacting enzymes myeloperoxidase and NADPH-oxidase. Hereditary defects are known for either of the enzymes. While myeloperoxidase deficiency stays clinically inapparent in most cases NADPH-oxidase deficiency results in a serious illness referred to as chronic granulomatous disease. By administration of glucose-oxidase-containing liposomes (GOL) that generate H2O2 neutrophil function can be restored in vitro. GOL, however, are of limited shelflife when stored in aquaeos solution. Lyophilization of liposomes provides an approach to improvement of liposomal shelflife. The first part of this thesis deals with the effects of lyophilized GOL as compared to conventional ones. FACS-analysis showed that lyophilized liposomes were taken up selectively by phagocytes and uptake rates were comparable to those of conventional liposomes. Confocal laser microscopy provided data proving co-localisation of liposomes and phagocytosed stapylococcus aureus within neutrophils. Moreover, electron microscopy showed bacteria and liposomal containts within the same phagolysosome. Using both photometric assays and chemiluminescence it was shown that incubation of NADPH-oxidase-deficient neutrophils with lyophilized liposomes restored cellular ability to produce reactive oxygen species, especially hypochlorite, in a range comparable to that of conventional liposomes. Experiments focusing on potential side effects of showed that chemotactic properties of neutrophils were only hampered but not fully neutralized by incubation with lyophilized GOL – as shown earlier for conventional GOL. Additionally, constitution of lipid peroxidation products did not exceed levels reached by physiologic neutrophil activation. Finally, it was shown that the effects cause by GOL were not due to degranulation of neutrophil granule containts into extracellular matrix. Within the second part of this thesis stability of glucose oxidase (GO) against cellular agents and intracellular environments, namely changes in pH-value, oxidative stress and granulocyte containts was examined. It became apparent that within the examination time of two hours no significant loss of enzyme activity was detected. Concludingly, lyophilization does indeed provide a remarkable approach to shelf life improvement of GOL and can therefore be taken into consideration for in vivo suitability examinations. GO seems to be relatively stable towards potential activity altering agents and is thus very suitable for providing H2O2 within the aggressive environment of the phagolysosome.

Apoptose ist ein physiologischer Prozeß, der unter anderem für die embryonale Entwicklung, das Gleichgewicht von Zellwachstum und Zelluntergang, die Immunregulation und die Tumorregression von zentraler Bedeutung ist. Bei der Induktion von Apoptose spielen diverse Mitglieder der TNFa-Familie eine zentrale Rolle. Fünf der bisher bekannten Rezeptoren (TNF-R, TRAIL-R1, TRAIL R2, TRAMP und CD95/Apo-1) sind durch eine intrazelluläre „Todes-Domäne“ charakterisiert, welche für die Weiterleitung des Apoptose-Signals notwendig ist. Zwei weitere Rezeptoren (TRAIL-R3 und TRAIL-R4) weisen keine derartige intrazelluläre Domäne auf, so daß ihnen eine protektive Funktion zugeschrieben wird. RANK, der membrangebundene Rezeptor für RANKL, besitzt keine Todesdomäne, aktiviert jedoch NF-kB. Die bisher bekannten zytotoxischen Liganden (TNF a, CD95-L, TRAIL) binden an den jeweiligen Rezeptor und aktivieren über eine Rezeptor-Trimerisierung den intrazellulären Apoptose-Effektor-Weg. Mutationen in einigen der genannten Moleküle wurden als pathoäthiologischer Mechanismus für verschiedene lymphoproliferative Syndrome identifiziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass RANKL eine Schlüsselrolle bei der Doxorubicin-induzierten Apoptose spielt. Für die in vitro-Untersuchungen wurden CEM und PBMC mit 1 mM Doxorubicin inkubiert. Die funktionelle Analyse mittels FACS zeigte, dass 50-60% der untersuchten Zellen innerhalb von 12 Stunden Apoptose begangen hatten. Auch rRANKL, rTRAIL, aCD95 mAb und Staurosporin waren in der Lage, Apoptose zu induzieren. Auf RNA-Ebene konnten in CEM wie auch in PBMC folgende der bisher bekannten Rezeptoren und Liganden der TNFa-Familie sowie der TNFa-Rezeptorenfamilie nachgewiesen werden: TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAMP, CD95, CD95-L und RANKL. Während sich bei den Rezeptoren sowie bei TRAIL unter Inkubation mit Doxorubicin keine Veränderung der Expression zeigte, unterlagen CD95-L und RANKL einer Hochregulation mit einem Maximum nach 4-6 Apoptosis or programmed cell death is a physiologic process, which is involved in various processes such as embryologic development, homeostasis, immune-regulation or tumor regression. Members of the TNFa-family play a key role the induction of apoptosis. Five of the receptors (TNF-R, TRAIL-R1, TRAIL R2, TRAMP and CD95/Apo-1) are characterized by an intracellular death domain, which is necessary for the transmission of the apoptotic signal to the nucleus. Other members of this receptor family (TRAIL-R3 and TRAIL-R4) lack an intracellular death domain, they are thought to have a protective function. RANK, the membrane-bound receptor for RANKL, also lacks a death domain, but activates NF-kB. The ligands of the emerging TNFa-family (TNF a, CD95-L, TRAIL and RANKL) bind to the corresponding receptor and, by trimerization of the receptor, activate the intracellular apoptosis effector-pathway. Mutations in some of the molecules mentioned here have been identified as pathoethiologic substrate of diverse lymphoproliferative syndromes. The results of this thesis show, that RANKL plays an important role in Doxorubicin-induced apoptosis. For induction of apoptosis CEM und PBMC were incubated with 1 mM Doxorubicin. The detection of apoptosis by FACS showed, that 50-60% of the incubated cells had undergone apoptosis within 12 hours. rRANKL, rTRAIL, acivating aCD95 mAb and Staurosporin were also capable of inducing apoptosis in different degrees. TRAIL, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAMP, CD95, CD95-L and RANKL were detectable on the level of RNA in CEM as well as in PBMC under resting conditions. CD95-L and RANKL were up-regulated in the presence of Doxorubicin with a maximum after 4-6- hours, whereas the expression of TRAIL and the receptors was not affected by the incubation with an anthracycline. In PBMC up-regulation was only detected in the case of RANKL, expression of CD95-L remained constant. TRAIL-R3, in contrast to other publications, was also detectable in maligna