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An in-vitro model system of micropropagated shoots of the commercial clone ‘Villafranca’ of Populus alba (L.) was used to investigate polyamine (PA) biosynthesis and accumulation in response to high concentrations of zinc (Zn) and copper (Cu). Based on leaf symptoms, rate of adventitious root formation and ethylene production, 0.5-1 mM Zn was transiently toxic while 2–4 mM Zn concentrations were increasingly toxic. Free and conjugated putrescine and spermidine accumulated in a dose-response manner and proportionally to toxicity. The expression profiles of the PA biosynthetic genes were analyzed by RT-PCR in plants exposed to Zn. In both leaves and stems, PaADC and PaODC transcript levels were early enhanced by all Zn concentrations, while those of PaSAMDC did not. In adventitious roots, free and conjugated PA levels also rose, although their composition and reciprocal ratios were different from those of leaves and no changes in transcript levels of PA biosynthetic genes were detected. Several Cu concentrations (5-500 μM) were tested in shoots showing severe leaf toxicity, strongly impaired adventitious root formation and high ethylene production. No changes in PA levels were detected until culture end. The different timing of the PA response to Zn and Cu, despite their rapid uptake and translocation already at 24 h, is discussed in relation to the extent of leaf toxicity.

Poplar is a good candidate for use in phytoremediation of contaminated soil, but its tolerance to heavy metals has not been fully investigated yet. In the present work, an in-vitro model system with shoot cultures was used to investigate the tolerance to high concentrations of zinc (Zn) of a commercial clone (Villafranca) of Populus alba. Based on chlorophyll content (leaf chlorosis) and the rate of adventitious root formation from shoot cuttings as parameters of damage, 0.5 – 4 mM zinc concentrations were all toxic albeit to different extents. Northern blot and reverse transcriptase (RT)-PCR analyses were used to examine the expression profiles of type 1, 2 and 3 PaMT genes in stems, leaves and roots of plants exposed to Zn treatments. In leaves, MT1 and MT3 mRNA levels were enhanced by Zn, while MT2 transcripts were not affected. The PaMT expression profiles were differentially affected by Zn in an organ-specific manner, and the relationship with Zn concentration and exposure time was rarely linear. The developmental and molecular data reveal that the in vitro model is a sensitive and reliable system to study heavy metal stress responses.

Le piante del genere Passiflora, originarie delle zone tropicali e sub-tropicali del Centro- e Sud America, comprendono diverse centinaia di specie. Alcune di queste sono coltivate come piante da frutto, altre, come ad es. Passiflora incarnata L., sono note da tempo per le loro proprietà sedative e farmacologiche e per questo sono state studiate in modo approfondito per quanto riguarda la composizione chimica e le attività biologiche. I principali composti bioattivi descritti nelle piante appartenenti a questo genere sono rappresentati da derivati glicosidici dei flavonoidi luteolina e agipenina, quali orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina, shaftoside e isoshaftoside [1]. Le tecniche delle colture di cellule vegetali rappresentano uno strumento utile per studiare la produzione e l’accumulo di costituenti attivi. Le colture in vitro presentano alcuni vantaggi rispetto alla pianta intera per gli studi di biosintesi, in particolare sono relativamente semplici da coltivare e possono essere mantenute in condizioni nutritive e ambientali strettamente controllate. Inoltre, la produzione di composti del metabolismo secondario può essere modulata ottimizzando alcuni fattori fisico-chimici che svolgono un ruolo importante nella sintesi di tali composti. In particolare l’elicitazione con fattori biotici o abiotici rappresenta una delle strategie più utilizzate per incrementare la produzione di alcuni metaboliti che vengono scarsamente prodotti oppure per indurre la sintesi di altri che normalmente non vengono sintetizzati [2]. Scopo di questo lavoro è di valutare la capacità di produzione di alcuni glicosil-flavonoidi (isoorientina, orientina, isovitexina e vitexina) in colture in vitro ottenute da due specie di Passiflora e di analizzare la risposta di tali colture al trattamento con elicitori quali il metilgiasmonato (MJ) e la luce UV-B. Le colture in vitro di P. quadrangularis producono livelli molto bassi di flavonoidi. Tra quelli testati sono presenti solo orientina ed isorientina. Il trattamento con luce UV-B determina un incremento fino ad oltre 100 volte nei livelli di questi flavonoidi e un’induzione di isovitexina e vitexina, e tale aumento risulta strettamente dipendente dalla dose e dalla durata dell’irraggiamento. Anche l’elicitazione con MJ provoca un aumento nella produzione di flavonoidi nelle colture di P. quadrangularis, seppure di entità inferiore rispetto a quello indotto dalla luce UV-B. Le colture di callo di P. quadrangularis trattate con la dose UV-B in grado di stimolare maggiormente la produzione di flavonoidi mostrano un aumento dell’attività antiossidante. Anche l’enzima fenilalanina ammonio-liasi (PAL) risulta regolato dal trattamento con luce UV-B. La risposta delle colture in vitro di P. palmeri all’elicitazione con luce UV è più attenuata rispetto all’altra specie e addirittura assente nel caso del MJ. I risultati confermano l’inducibilità della biosintesi di flavonoidi da parte della luce UV-B e, in misura minore, del MJ in colture di callo di P. quadrangularis. Le differenze riscontrate nella risposta all’elicitazione tra le due specie prese in esame suggeriscono meccanismi specie-specifici nell’attivazione delle vie biosintetiche e/o di trasmissione del segnale in risposta ad uno stimolo.

Effetti di zinco e rame sull’espressione genica delle metallotioneine e sul contenuto di poliammine in Populus alba L. in micropropagazione S. BIONDI1, C. FRANCHIN1, T. FOSSATI2, E. PASQUINI1, V. ZIOSI1, P. TORRIGIANI1, S. CASTIGLIONE2, 1 Dipartimento di Biologia, Università di Bologna, Via Irnerio 42, 40126 Bologna; 2 Dipartimento di Biologia, Università di Milano, via Celoria 26, 20133 Milano Vi sono molte evidenze a favore di un possibile coinvolgimento delle metallotioneine (MT) nelle risposte a stimoli ambientali, in particolare si ipotizza che queste proteine siano strettamente correlate alla capacità di molti organismi di tollerare dosi elevate di metalli pesanti. Nelle piante le MT sono classificate in quattro classi (COBBETT, GOLDSBROUGH, 2002)) e in Arabidopsis, pomodoro e cotone vi sono famiglie geniche di MT (ZHOU & GOLDSBROUGH, 1994; GIRITCH et al., 1998; HUDSPETH et al., 1996). Per chiarire le funzioni delle MT nelle piante, sono stati effettuati numerosi studi sull’espressione di questi geni sia durante lo sviluppo che in risposta a stress biotico e abiotico con risultati ancora contrastanti. Pertanto informazioni certe sull’attività endogena delle MT non sono ancora state raggiunte e il loro ruolo rimane elusivo. Nei vegetali le poliammine (PA) si accumulano in risposta a vari stimoli biotici e abiotici (BOUCHEREAU et al., 1999), compresi gli inquinanti ambientali quali i metalli pesanti (WEINSTEIN et al., 1986; HAUSCHILD, 1993). Esse svolgono probabilmente un ruolo nella resistenza allo stress ossidativo, stabilizzando gli acidi nucleici e le membrane biologiche. Il rapido accrescimento, l’elevata produzione di biomassa, l’apparato radicale esteso, la facile propagazione vegetativa e la possiblità di utilizzo nelle coltivazioni a breve rotazione fanno del pioppo un ottimo candidato come pianta arborea da usare nel fitorisanamento di siti inquinati. Tuttavia, sono molte scarse le informazioni circa le sue capacità di accumulo e di tolleranza nei confronti dei metalli. Inoltre, il pioppo è di recente assurto a “pianta arborea modello” in quanto il suo genoma è stato interamente sequenziato, aprendo la via a studi molecolari di ampio respiro (TUSKAN et al., 2004). Nel presente lavoro, è stata esaminata la risposta di un clone commerciale di Populus alba, la cv Villafranca, allevato in vitro attraverso la micropropagazione ed esposto per tempi diversi, fino a un massimo di 15 giorni, a dosi elevate di ZnSO4 o CuCl2. Sono stati valutati i sintomi visivi di tossicità, i livelli endogeni di poliammine libere e coniugate, e i livelli di trascritto di tre geni codificanti MT (MT1, MT2 e MT3). I risultati hanno evidenziato un’evidente clorosi fogliare già dopo 1 giorno in piante esposte a concentrazioni di Zn di 1, 2 e 4 mM, ma non 0.5 mM. Un forte ingiallimento e senescenza delle foglie si osservava soltanto con le due dosi più alte a partire dal 7° giorno. Tali sintomi di tossicità, associati a un calo significativo nel contenuto di clorofille, si palesavano in piante trattate con Cu anche a concentrazioni molto più basse (0.1 mM). La formazione di radici avventizie sui germogli trattati con Zn era inibita in maniera dose dipendente, arrivando fino al 50%. Al contrario, in presenza di Cu la rizogenesi era totalmente inibita a partire dalla concentrazione 0,1 mM e fortemente ridotta anche a dosi molto più basse (5 mM). Pur essendo già noto l’effetto fortemente inibente del Cu sulla crescita radicale (MURPHY & TAIZ, 1995) i dati mostrano che anche la rizogenesi è molto sensibile alla tossicità di questo metallo. Del resto, il Cu è uno dei metalli più tossici conosciuti. Nel suolo, la sua biodisponibilità è bassa, ma in soluzione acquosa la sua tossicità viene messa in evidenza provocando stress ossidativo (FERNANDES & HENRIQUES, 1991). Come riportato in Figura 1, il contenuto totale di PA, sia libere che coniugate, misurate dopo 15 giorni di esposizione a tre diverse concentrazioni di Zn (0,5, 1 e 2 mM) ...

I giasmonati (JA) costituiscono un segnale importante nell’elicitazione di risposte a stress mediante induzione di JA-induced proteins (JIPs); tra queste, gli enzimi biosintetici delle poliammine. E’ stato riportato un ruolo attivo dei JA anche nei processi di sviluppo, quali la crescita e la maturazione dei frutti, e in post-raccolta. In polpa di mela e ciliegia i livelli di JA mostrano un picco di concentrazione durante le fasi precoci di crescita (divisione cellulare); in mela tali livelli salgono nuovamente all’inizio del climaterio etilenico. Dati esogenamente questi composti inducono una serie di risposte biologiche: stimolano la produzione di beta-carotene in pomodoro, riducono il danno da freddo in post-raccolta in mango, riducono la muffa verde in pompelmo e promuovono lo sverdimento in mela. Tuttavia, le relazioni reciproche tra JA ed etilene non sono ben stabilite. In mela il metilgiasmonato (MJ) stimola la produzione di etilene in frutti pre-climaterici e la inibisce in quelli post-climaterici. Alcuni Autori suggeriscono che l’effetto del MJ sullo sverdimento della mela sia almeno in parte indipendente dall’etilene. Risultati contraddittori sono stati ottenuti anche in altri sistemi modello. Una relazione ben stabilita è quella tra JA e poliammine. I JA infatti stimolano fortemente il metabolismo delle poliammine con forti riflessi sui loro coniugati fenolici. I livelli di poliammine, che sono importanti regolatori della crescita, variano durante lo sviluppo del frutto e il trattamento del frutto in maturazione con poliammine libere riduce l’emissione di etilene e il rammollimento della polpa. Questo lavoro riporta i risultati di un’indagine atta a stabilire quali siano le relazioni reciproche tra JA ed etilene allo scopo di chiarire i meccanismi fisiologici coinvolti nel controllo della maturazione e della post-raccolta nelle nettarine. A seguito della somministrazione esogena di JA in campo (MJ e propilgiasmonato, PJ) al frutto in S3, l’emissione di etilene al climaterio, così come l’evoluzione dei principali parametri di qualità del frutto, viene inibita da PJ ma non da MJ. L’espressione di ACO1 è influenzata solo da MJ. I livelli di poliammine libere sono significativamente incrementati sia nell’esocarpo che nel mesocarpo da entrambi i trattamenti. L’espressione dell’enzima che decarbossila l’S-adenosilmetionina (SAM), precursore comune dell’etilene e delle poliammine, non è influenzata dai trattamenti. L’inibizione dell’emissione di etilene e il rallentamento della maturazione che ne consegue sono associati ad incrementi nel contenuto di poliammine che potrebbero contribuire all’effetto antisenescente dei trattamenti. Si conferma così il ruolo dei JA nel controllo della maturazione del frutto e il coinvolgimento delle poliammine in tale processo.