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Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico (NO), um neurotransmissor não convencional, tem papel importante em processos neurobiológicos de comportamento e de memória. Sua síntese é mediada por três isoformas de sintase do óxido nítrico (NOS): a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e induzível (iNOS). Este trabalho analisou o efeito do 7-nitroindazole (7-NI), um inibidor seletivo da nNOS, no condicionamento clássico aversivo em pombos. Foram usados 4 grupos: tratados com 7-NI (grupo 7-nitroindazole; G7-NI, n=5), tratados com óleo de amendoim (grupo veículo; GV, n=5), controle/sem tratamento (grupo controle; GC, n=5) e grupo não tratado/não condicionado (grupo manipulação; GM, n=5). A administração i.p. de 7-NI (25 mg/kg), ou do óleo de amendoim foi feita imediatamente após o treinamento. O G7-NI, o GV e o GC receberam três associações som-choque (5°, 10° e 15º minutos) numa sessão de 20 min. O teste a o contexto foi realizado 24 horas depois. As sessões foram gravadas para posterior transcrição e análise comportamental. A ocorrência da resposta de congelamento durante o treino não diferiu entre os grupos (p>0,05), mas durante o teste foi menor para o G7-NI em comparação ao treino (p0.05). During the test to the context the group 7-NI expressed significantly lower freezing as compared to Vehicle and Control (p

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.

The 894G>T polymorphism of the endothelial constitutive nitric oxide synthase gene consists of the substitution of a guanine base by a thymine at the 894th nucleotide of the gene. An association of this polymorphism with acute coronary syndromes has been described, only when in combination with other polymorphisms of this gene. The aim of the present study was to search for an association between this polymorphism and unstable angina in a southern Brazilian population. In a case-control study, 156 patients (group 1 (N = 83): unstable angina, group 2 (N = 73): stable angina) were genotyped by PCR and digestion of the product. Univariate analysis demonstrated that the minimal luminal diameter and the degree of stenosis of the culprit lesion differed between groups (P = 0.006 and 0.005, respectively). In addition, the frequencies of the T allele and of the T allele carriers (combined TT and TG genotypes) were significantly higher in the group with unstable angina (41.6 vs 28.8%; P = 0.025, Pearson chisquare test, and 73.5 vs 45.2%; P = 0.001, Pearson chi-square test, respectively). Multivariate logistic regression showed that the frequency of the T allele carriers was the only variable with a predictive value for unstable angina, when controlled for the other variables (6.1 (95% CI = 2.55-14.43); P < 0.001). Thus, in a homogenous group of patients, the endothelial constitutive nitric oxide synthase 894G>T polymorphism was associated with unstable angina. We suggest that this polymorphism may be a genetic risk factor for unstable angina.

Mucositis induced by antineoplastic drugs is an important, dose-limiting and costly side effect of cancer therapy, which pathophysiology is not completely understood. The aim of the present study was to investigate the role of nitric oxide (NO) on the pathogenesis of oral and intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil (5-FU) and methotrexate (MTX) and the effect of glutamine (GLU) and alanyl-glutamine (AL-GLU) on 5-FU-induced experimental mucositis. Oral mucosistis was induced by two intraperitoneal (i.p) administrations of 5-FU on the 1st and 2nd days (60 and 40 mg/kg, respectively) in hamsters. Animals were treated subcutaneously (s.c.) with the nitric oxide synthase (NOS) inhibitors N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidine (1400W; 1 mg/kg), aminoguanidine (AG; 5 or 10 mg/kg), Nφ-Nitro-L-Arginine Methyl Ester (L-NAME; 5, 10 or 20 mg/kg) or saline (0.4 ml), one hour before the injections of 5-FU and daily until sacrifice, on the 10th day. In another set of experiments, animals received saline, GLU or AL-GLU suspension (100 mM) one hour before the injections of 5-FU and daily until sacrifice, on the 10th or 14th day. Intestinal mucositis was induced by three administrations of MTX (2.5 mg/kg; s.c.) on the first three days of the experiment, in Wistar rats. Animals were treated i.p. with AG (10 mg/Kg), or L-NAME (20 mg/Kg), one hour before the injections of MTX and daily until sacrifice, on the 5th day. In the investigation of the role of NO on 5-FU induced oral mucositis, the following parameters were evaluated: microscopic and macroscopic analysis, myeloperoxidade (MPO) and NOS activities, nitrite level, immunohistochemistry for NOSi, salivary secretion, and cell death. In order to study the effect of GLU and AL-GLU, microscopic and macroscopic analysis, MPO activity, cell death, glutathione stores and the serum concentration of glutamine, were evaluated. In the MTX-induced intestinal mucositis, histopathological analysis was evaluated and the villus height in all three small intestine segments was measured. MPO activity, cell death, as well as, western blot and immunohistochemistry to evaluated the expression of the NOSi, were also conducted. 1400W or AG, but not L-NAME, reduced macroscopic and histological parameters of oral mucositis, and reduced the inflammatory cell infiltration as detected on histopathology and by MPO activity. Increased NOS activity and immunostaining for NOSi were detected. 5-FU induced a decrease in salivary secrection, observed on 4th day, and this effect was prevented by 1400W. The 5-FU-induced oral mucositis significantly decreased the serum GLU level as well as the cheek pouch glutathione stores, observed on day 10. GLU or AL-GLU reversed the 5-FU effects, restoring serum GLU levels and cheek pouch glutathione stores, observed on day 10, but did not prevent oral mucositis at this time. However, GLU and AL-GLU reduced macroscopic and histological parameters of oral mucositis, and reduced the MPO activity on day 14. In the MTX-induced mucositis, AG and L-NAME significantly prevented villous blunting, lamina propria cell death, and reduced crypt necrosis induced by MTX, decreasing neutrophil infiltration as detected by histopathology and by MPO activity. These data were associated with the detection of iNOS expression by Western blot and by immunohistochemistry in the jejunum tissue. These results suggest an important role of NO in the pathogenesis of oral and intestinal mucositis induced by 5-FU and MTX. The present study also demonstrated that GLU or AL-GLU hastens mucosal recovery increasing mucosal tissue glutathione stores, reducing inflammatory parameters and speeding reepithelization. A mucosite induzida por quimioterápicos é um efeito colateral importante e limitante da terapia do câncer, cuja fisiopatologia não é completamente compreendida. O presente estudo visa investigar o papel do óxido nítrico (NO) na patogênese das mucosites oral e intestinal induzidas por 5-fluorouracil (5-FU) e metotrexato (MTX) e os efeitos da glutamina (GLU) e alanil-glutamina (AL-GLU) na mucosite oral induzida por 5-FU. A mucosite oral foi induzida por duas administrações intraperitoneais (i.p.) de 5-FU nos 1° e 2º dias (60 e 40 mg/kg respectivamente), em hamsters. Os animais foram tratados subcutaneamente (s.c.) com os inibidores da óxido nítrico sintase (NOS), N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; 1 mg/kg), aminoguanidina (AG; 5 or 10 mg/kg), Nφ-Nitro-L-Arginina Methyl Ester (L-NAME; 5, 10 or 20 mg/kg) ou salina (0,4 ml), uma hora antes do 5-FU e, diariamente, até o sacrifício, no 10º dia. Em outro ciclo de experimentos, os animais receberam salina, suspensão de GLU ou de AL-GLU (100 mM) uma hora antes do 5-FU e, diariamente, até o sacrifício, nos 10º e 14º dias. A mucosite intestinal foi induzida pela administração de MTX (2,5 mg/kg; s.c.) nos primeiros três dias de experimentos, em ratos Wistar. Os animais foram tratados com AG (10 mg/Kg; i.p.), ou L-NAME (20 mg/Kg; i.p.), uma hora antes do MTX e, diariamente, até o sacrifício, no 5º dia. Na investigação do papel do NO na mucosite oral induzida por 5-FU, os seguintes parâmetros foram avaliados: análises micro e macroscópica, atividade de mieloperoxidade (MPO) e da NOS, níveis teciduais de nitrito, imunohistoquímica para NOSi e detecção de morte celular. O efeito do 5-FU na produção salivar também foi avaliado. No estudo dos efeitos da GLU e AL-GLU, análises micro e macroscópicas, atividade de MPO, detecção de morte celular, estoques teciduais de glutationa e concentração sérica de glutamina foram os parâmetros avaliados. No estudo do papel do NO na mucosite intestinal, foram realizados análise histopatológica, medida da altura de vilos nos três segmentos do intestino delgado, atividade de MPO, detecção de apoptose, assim como, western blot e imunohistoquímica para NOSi. 1400W e AG, contrariamente ao L-NAME, reduziram os parâmetros macro e microscópicos da mucosite oral e a infiltração de células inflamatórias, detectada na histopatologia e na atividade de MPO. Foram observados ainda, no 10º dia, maior atividade da NOS e marcação imunohistoquímica para NOSi. 1400W reverteu a diminuição da secreção salivar induzida por 5-FU. A mucosite oral induzida por 5-FU resultou na diminuição dos níveis séricos de glutamina, bem como dos estoques teciduais de glutationa, no 10º dia, efeitos que foram revertidos pela administração de GLU e AL-GLU. Apesar de não ter prevenido a mucosite oral no 10º dia, o tratamento com GLU ou AL-GLU reduziu os parâmetros macro e microscópicos da mucosite oral, e a atividade de MPO, no 14º dia. Na mucosite intestinal, AG e L-NAME preveniram o encurtamento de vilos e reduziram a necrose de criptas, assim como o infiltrado inflamatório, efeitos induzidos pelo MTX, sendo esse último constatado pela análise histopatológica e atividade de MPO. Foi detectado maior marcação imunohistoquímica para NOSi no jejuno de ratos submetidos à mucosite intestinal. Esses resultados sugerem o papel relevante do NO na fisiopatologia das mucosites oral e intestinal. O presente estudo demonstrou ainda que a GLU e AL-GLU aceleraram a recuperação da mucosa dos animais submetidos a mucosite oral por 5-FU, aumentando os níveis teciduais de glutationa, reduzindo a inflamação e promovendo reepitelização.

Irinotecan (CPT-11) is an inhibitor of DNA topoisomerase I and clinically effective against several cancers. A major toxic effect of CPT-11 is delayed diarrhea; however, the exact mechanism by which the drug induces diarrhea has not been established. Purpose: The aim of the present study was to elucidate the involvement of cytokines (TNF-α, IL-1β and KC), nitric oxide (NO) and prostaglandins (PGs) in the pathogenesis of CPT-11-induced mucositis and the effects of the cytokine production inhibitors, pentoxifylline (PTX) and thalidomide (TLD), as well as the effects of the selective cyclooxygenase (COX-2) inhibitor, celecoxib (CLX), in the CPT-11 induced intestinal mucositis, in mice. Materials and methods: the animals were treated with CPT-11 (50, 75 or 100 mg/kg, i.p.) or vehicle (0,5 ml, i.p.) daily for four days, in order to investigate the best dose able to induce intestinal mucositis without important mortality. In another set of experiments, the animals received PTX (1.7, 5, 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c.), CLX (3, 10, 30 mg/kg, oral gavage) or vehicle (0,5 ml, s.c. or oral gavage) one day before the 1st administration of CPT-11 (75 mg/kg; i.p.) and daily until the sacrifice, on the 5th or 7th day. The systemic parameters evaluated were: diarrhea, body mass variation, survival curve and leucogram. In addition, it was also performed histological analysis, myeloperoxidase (MPO) activity assay, duodenum levels of TNF-α, IL-1β and KC by ELISA and immunohistochemistry for TNF-α, IL-1β, iNOS and COX-2 in the duodenal segments. Results: CPT-11 induced an important diarrhea, weight loss, leucopenia and mortality increase. It was also observed histopathological changes, such as shortened villi, loss of the crypt architecture and inflammatory cells infiltration, observed in the lamina propria, as well as, an increase in MPO activity, TNF-α, IL-1β and KC tissue levels and a marked immuno-staining for TNF-α, IL-1β, iNOS and COX-2. The treatment with PTX inhibited the delayed diarrhea and reduced the following parameters: histopathological alterations, MPO activity, tissue levels of TNF-α, IL-1β and KC, and the immuno-staining for TNF-α, IL-1β and iNOS, however, did not prevent leucopenia, weight loss and mortality. TLD significantly reduced all the inflammatory parameters evaluated, but was not able to prevent diarrhea, leucopenia, weight loss and mortality. On the other hand, CLX did not inhibit the inflammatory nor the systemic alterations induced by CPT-11. Conclusion: These results suggest an important role of TNF-α, IL-1β, KC, NO and PGs in the pathogenesis of intestinal mucositis induced by CPT-11. PTX and TLD showed a protector effect in intestinal structures, however, only PTX reduced the severity of CPT-11-induced diarrhea. O cloridrato de irinotecano (CPT-11) é um inibidor da topoisomerase I, clinicamente efetivo no tratamento de vários tipos de câncer. Apesar da mucosite intestinal (MI) acompanhada de severa diarréia ser o efeito colateral mais limitante do uso terapêutico do CPT-11, os exatos mecanismos que levam a estes efeitos não são estabelecidos. Objetivo: avaliar o envolvimento de mediadores inflamatórios (citocinas, óxido nítrico – NO e prostaglandinas – PGs) na patogênese dos eventos que acompanham a MI induzida pelo CPT-11; e estudar o efeito de inibidores da síntese e liberação de citocinas, como pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD), e de um inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), o celecoxibe (CLX), na lesão intestinal induzida pelo CPT-11. Material e Métodos: camundongos Swiss, machos, foram tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg, i.p.) ou veículo (0,5 mL, i.p.), a fim de se obter a melhor dose capaz de induzir injúrias consistentes com o mínimo de letalidade. Os animais foram tratados com PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c), CLX (3, 10, 30 mg/kg, gavagem) ou veículo (0,5 mL, s.c. ou gavagem), um dia antes da primeira administração do CPT-11 (75 mg/kg), e diariamente, até o sacrifício, no quinto ou sétimo dia. Os seguintes parâmetros foram avaliados: diarréia, variação de massa corpórea, leucograma, sobrevida, análise histopatológica, atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de citocinas (TNF-α, IL-1β e KC) por ELISA e imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, iNOS e COX-2 nas mucosas duodenais. Resultados: CPT-11 induziu diarréia significante, acompanhada de perda acentuada de massa corpórea, leucopenia e redução da sobrevida. As alterações histopatológicas intestinais induzidas pelo CPT-11 caracterizaram-se pela presença de infiltrado inflamatório nas células da lâmina própria, perda da arquitetura das criptas e achatamento dos vilos. Observou-se ainda, aumento intestinal na atividade de MPO e dos níveis de TNF-α, IL-1β e KC, além do aumento significativo na marcação imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, iNOS e COX-2. O tratamento com PTX inibiu a diarréia tardia, reduziu as alterações histopatológicas, a atividade de MPO, e os níveis de TNF-α, IL-1β e KC, assim como a marcação imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β e iNOS na mucosa duodenal, entretanto, não preveniu significativamente a perda de massa corpórea, a leucopenia e tampouco a mortalidade dos animais. O tratamento com TLD reduziu as lesões histopatológicas induzidas pelo CPT-11 na mucosa intestinal, os níveis intestinais de MPO e TNF-α, bem como a marcação imunohistoquímica de TNF-α, mas não foi capaz de prevenir a diarréia, a perda de massa corpórea, a leucopenia e a sobrevida. O tratamento com CLX não foi capaz de reduzir os parâmetros inflamatórios e sistêmicos observados nos animais tratados com CPT-11. Conclusão: Estes resultados sugerem o envolvimento de TNF-α, IL-1β, KC, NO e PGs na patogênese da MI induzida pelo CPT-11. PTX e TLD preveniram significativamente as alterações histológicas e inflamatórias induzidas pelo CPT-11, entretanto, somente PTX foi capaz de inibir o curso da diarréia.

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: o sucesso da implantação e do desenvolvimento embrionário no útero de humanos e roedores decorre de interações íntimas entre as células de origem materna e fetal, com a intermediação de citocinas e mediadores químicos em fino balanço estabelecendo um diálogo entre as diferentes populações celulares da interface materno-fetal. Este diálogo envolve do lado fetal as células trofoblásticas e do lado materno o estroma decidualizado, vasos sanguíneos e células leucocitárias do endométrio, numa complexa rede de sinalizações cujos mecanismos são apenas parcialmente conhecidos. Desequilíbrios neste balanço de sinalizações podem resultar na interrupção da gravidez sendo particularmente intrigante a participação das células natural killer uterinas (uNK) que constituem uma população linfocitária que estão presentes em grande quantidade no ambiente uterino exclusivamente durante a gestação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão e participação das isoformas das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) como potencial indutor do desequilíbrio da homeostasia do microambiente uterino na interface materno-fetal envolvendo a produção do óxido nítrico (NO). Foram utilizados camundongos no 8° e 10° dia de gestação (dg) normal e grupos de animais cujos embriões foram lesionados mecanicamente por intervenção cirúrgica ou inoculados com lipopolissacarídios (LPS). Amostras uterinas de sítios embrionários foram coletadas nos períodos de 1, 2 e 6 horas pós-lesão mecânica, ou, 6 horas após inoculação com LPS e processados de acordo com as técnicas rotineiras para embebição em parafina, assim como, processados para obtenção de homogeneizados teciduais da região mesometrial destes sítios embrionários. Cortes de parafina foram submetidos à reação citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) e às reações imunocitoquímicas para as isoformas iNOS, eNOS e nNOS e, para IFNa. Foram realizadas SDS-PAGE dos homogeneizados teciduais e Western-blot com os anticorpos anti-iNOS, anti-eNOS e anti-nNOS. A região mesometrial dos sítios embrionários lesionados mecanicamente apresentou hiperemia após 1 hora de lesão que evoluiu para um quadro de hemorragia nos períodos posteriores. No grupo submetido ao tratamento com LPS foi observado um quadro de hiperemia no período de 6 horas. Pela citoquímica com a lectina DBA constataram-se alterações na morfologia das células uNK destes sítios, sendo notória a perda de reatividade no conteúdo dos grânulos lisosomo-secretores. As avaliações imunocitoquímica para iNOS indicaram que as células uNK, as células deciduais e as células trofoblásticas gigantes expressam iNOS constitutivamente na gestação normal, o mesmo ocorrendo com as isoformas eNOS e nNOS. Nos sítios de lesão embrionária, as células uNK apresentam acentuada redução na marcação pela imunocitoquímica para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas, com recuperação parcial após 6 horas. Estas variações não foram constatadas em outras células da interface materno-fetal. A eNOS apresentou marcações constantes nas células uNK e nas células musculares lisas, sem variações nos grupos experimentais de lesão embrionária. Pelo Western-blot foi constatada uma redução signficativa para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas pós-lesão mecânica. Estes resultados demonstraram que as células uNK respondem às alterações do ambiente uterino induzido pela lesão embrionária ou pelo LPS, com rápida mobilização das isoformas iNOS e nNOS possivelmente na produção do NO. O NO liberado por estas células pode ser a causa da alteração da permeabilidade ou lesão vascular da região mesometrial provocando a hiperemia e hemorragia. A mobilização da atividade da iNOS nas células uNK não parece ser dependente do IFN-a. e portanto não ocorre o envolvimento das células dendríticas nesta via de sinalização Abstract: The successful embryo implantation and development in human and rodents uteri is dependent of intimate interaction between maternal and fetal cells, with intervening of fine balance of cytokines and chemical mediators on cross-talks between cells in the maternal-fetal interface. This dialogue involves the cells of decidualized stroma, blood vessels and leukocytes from endometrium of maternal side and the trophoblast cells from embryo in a complex signaling network which mechanism is only partially understood. Unbalance of these signals could outcome in miscarriage being intriguing the participation of uterine natural killer cells (uNK) that com pose lymphocyte population accumulate in the uterine environment specifically during pregnancy. The aim of this work was to evaluated the participation of nitric oxide synthase (NOS) enzymes isoforms which arise in nitric oxide (NO) production, as potential inducer of unbalance of homeostasis in the uterine environment. It was used normal pregnant mice on 8° and 10° gestational days and groups of animais which embryos were surgically lesioned or inoculated with lipopolyssacharide (LPS). Uterine samples were colleted after 1, 2 and 6 hs of embryo lesion or 6hs after LPS inoculation and processed for conventional paraffin embedding, as so as, for tissue homogenates of mesometrial region from this uterine sites. Paraffin sections were processed for Dolichos biflorus (DBA) lectin cytochemistry and immunocytochemistry for iNOS, eNOS, nNOS and IFN-a. SDS-PAGE and Western blot were performed with tissue homogenates using anti-iNOS, anti-eNOS and antinNOS. The mesometrial region of embryo lesioned uterine sites showed hyperemia after 1 hr lesion and increased to hemorrhage after that. In the LPS treated animais was seen hyperemia after 6hr. The DBA cytochemistry showed morphological changes in the uNK cells found in this embryo lesioned sites being noticeable the lost of reactivity in the secretory-Iysosome granules contents. The immunocytochemical for iNOS pointed out the uNK, decidual and trophoblast cells expressing iNOS constitutively in the normal pregnancy, as did the eNOS and nNOS. In the embryo damaged sites the uNK cells showed remarkable reduction in the iNOS and nNOS labeling after 1 and 2 hr with partial recuperation after 6 hr. These variations were not seen in other cells. The eNOS showed constant labelling on uNK cells and smooth muscle cells without changes in the experimental groups of embryo lesion or treated with LPS. By Western blot, it was noted significant lowering for iNOS and nNOS in the periods of 1and 2 hr after lesion. These results showed acute response of uNK cells against the changes of uterine environment induced by embryo lesion and LPS treatment, with fast mobilization of iNOS and nNOS isoforms possibly in the production of NO. The NO released from these cells could be the cause of changes on vascular permeability or even lesion of blood vessels localized in the mesometrial region wich results in hyperemia and hemorrhage. The iNOS activation of uNK cells does not seem dependent of IFN-a and therefore without commitmentof dendritic cells in this signaling pathway Mestrado Histologia Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari, Claudio Antonio Barbosa de Toledo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O hipocampo exerce papel fundamental no processamento de aprendizagem e memória espaciais. Comparações das características funcionais, anatômicas e neuroquímicas do hipocampo são favorecidas por evidência oriunda de estudo sobre aprendizagem especial em mamíferos e aves. O objetivo do presente estudo foi analisar a marcação imunohistoquímica de células nNOS- positivas no hipocampo de pombos (C. lívia) após diferentes duração do treino em aprendizagem especial. Foram analisados grupos de animais não treinados (MAN), treinados em 1 sessão (EXP1), treinados em 5 sessões (EXP5), exposto à arena em 1 sessão (CONT1) ou em 5 sessões (CONT5). As sessões foram realizadas numa arena onde havia quatro comedouros, um dos quais com alimento. Em cada sessão, com seis tentativas, registrou-se a latência (seg) e a assertividade da escolha de um comedouro. Após os testes comportamentais, usou-se imunoistoquímica para a análise da marcação de células nNOS-positiva no hipocampo dorsal e ventral. O grupo EXP5 teve diminuição da latência de escolha ('F IND. 4,28¿= 23,74; p < 0,001) e aumento das respostas corretas ('F IND. 4,35¿= 8,66; p < 0,001) em função do treino. A marcação das células nNOS-positivas no hipocampo foi significativamente maior no hipocampo dorsal dos animais EXP5 em comparação com o hipocampo ventral ('F IND. 4,22¿= 104,79; p

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Orientador: Licio Augusto Velloso Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Durante as últimas décadas tem se observado um aumento surpreendente na prevalência de obesidade e diabetes mellitus em populações de várias regiões do mundo, inclusive no Brasil. Diversos estudos epidemiológicos apontam o consumo de dietas ricas em lípides como um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento dessas patologias. Em recente trabalho em nosso laboratório, foi demonstrado que a oferta de uma dieta rica em lípides leva a uma maior expressão hipotalâmica de proteínas participantes de respostas pró-inflamatórias como TNF-a, IL-2, IL-6 e IL-ß. A citocina TNFa, agindo no hipotálamo, modula a ingestão alimentar e o gasto energético através de mecanismos incompletamente elucidados. Neste trabalho exploramos a hipótese de que, para modular a sinalização anorexigênica induzida por insulina no hipotálamo, o TNFa deve requerer a síntese de óxido nítrico. O TNFa ativa sinalização intracelular canónica no hipotálamo, com pico na concentração de 10-8 M. Esse efeito é acompanhado pela indução da expressão das formas neuronal e induzível da enzima NOS, em ambos os casos com pico em 10-12 M. Em adição, TNFa estimula a atividade catalítica de NOS. O pré-tratamento com TNFa em baixa dose (10-12 M) inibe a sinalização anorexigênica insulino-dependente. Esse efeito é abolido em camundongos iNOS mas não em camundongos nNOS knockout. Portanto, o efeito inibitório exercido pela baixa dose de TNFa sob a inibição da ingestão alimentar induzida por insulina depende, pelo menos em parte, da expressão de iNOS. Embora nNOS hipotalâmica seja induzida por TNFa, esta não participa da modulação TNFa-dependente dos sinais anorexigênicos da insulina. Abstract: Obesity has reached epidemic proportion in several regions of the world. General changes in life-style, including consumption of fat-rich food, are amongst the most important factors leading to an unprecedented increase in the prevalence of this disease. In a recently work on our laboratory, we showed that high fat feeding (hyperlipidic diet) induced the expression of several pro-inflammatory cytokines and inflammatory responsive proteins in hypothalamus, like TNFa, IL-2, IL-6 e IL-lß. The cytokine TNFa, acting on the hypothalamus, modulates food intake and energy expenditure through mechanisms incompletely elucidated. Here, we explored the hypothesis that, to modulate insulin-induced anorexigenic signaling in hypothalamus, TNF-a would require the synthesis of NO. TNF-a activates canonical intracellular signaling in hypothalamus, peaking at 10-8 M. This is accompanied by the induction of expression of the inducible and neuronal forms of NOS, in both cases peaking at 10-12 M. In addition TNF-a stimulates NOS catalytic activity. The pre-treatment with TNF-a at low dose (10-12 M) inhibits insulin-dependent anorexigenic signaling. This effect is abolished in iNOS but not in Nnos knockout mice. Thus, the inhibitory effect exerted by low dose TNF-a upon the insulin-induced inhibition of food intake depends, at least in part, on the expression of iNOS. Although hypothalamic nNOS is induced by TNF-a it does not participate on TNF-a-dependent modulation of the insulin anorexigenic signals. Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Fundamentação: O pré-condicionamento isquêmico (PCI) é uma resposta adaptativa, na qual a exposição a breves períodos de isquemia aumenta a capacidade do miocárdio em resistir à isquemia prolongada. Originalmente, o PCI foi descrito como uma adaptação imediata do miocárdio a curtos episódios de isquemia, mas atualmente sabemos que se trata de um fenômeno bifásico. O fenômeno de PCI agudo é mediado por mecanismos de sinalização intracelulares. Diversos hormônios, neurotransmissores e substâncias de liberação local são considerados gatilho desse fenômeno, dentre eles se destaca a adenosina (ADO). Por outro lado, o PCI tardio envolve a transcrição gênica. Evidências indicam que a NOS possui papel importante na geração e manutenção do PCI agudo e tardio do miocárdio. No presente trabalho utilizamos o DMA, um derivado de 4-anilinoquinazolinas e inibidor da atividade tirosina quinases da família de receptores EGF, como um indutor farmacológico de proteção miocárdica contra os danos da isquemia / reperfusão. OBJETIVO: Os objetivos do presente trabalho são: 1 - avaliar o efeito do composto derivado quinazolinico DMA (Cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(3'-N,N-dimetilfenil) aminoquinazolina) como indutor de proteção tardia na prevenção de danos da isquemia / reperfusão em corações isolados de ratos; 2 - avaliar a participação de oxido nítrico sinteíase (NOS) na proteção tardia induzida pelo DMA em corações isolados de ratos RESULTADOS: Os ratos foram tratados com doses únicas de DMA (1,2 mg/Kg, via endovenosa) ou veículo (DMSO) por períodos que variaram de 24 a 72 horas de antecedência ao protocolo de isquemia / reperfusão (l/R) em corações isolados. Esse protocolo foi composto de um registro de 10 minutos para período controle, 30 minutos de isquemia e 35 minutos de reperfusão. Animais tratados com veículo apresentaram aumento da pressão diastólica no ventrículo esquerdo (VE), enquanto que a pressão sistólica no VE manteve-se nos mesmos níveis do período controle. Sendo assim, a pressão desenvolvida no VE foi reduzida nestes animais. Nos animais tratados cora DMA houve aumento da pressão diastólica no VE durante a reperfusão, porém, com menor intensidade que aquele observado em corações de animais tratados com veículo. Como a pressão sistólica no VE atingiu níveis semelhantes aos do período controle, a pressão desenvolvida pelos corações de animais tratados com DMA foi maior que aquela dos corações de animais tratados com veículo, indicando proteção parcial aos efeitos da I/R. Para avaliar se a proteção conferida pelo DMA é dependente da ação de NO, os animais tomaram L-NA.ME (30mg/Kg/dia) por 3 dias antes do tratamento com DMA ou veículo, sendo o L-NAME continuamente ingerido através da água até seus corações serem submetidos ao protocolo de I/R em períodos de 24 a 72 horas após o tratamento com DMA ou veículo. Nos corações dos animais tratados com I.-NAME + veículo e nos corações dos animais tratados com L-NAME + DMA a recuperação dos batimentos foi acompanhada de aumento da pressão diastólica no VE quando comparado ao período controle. A pressão sistólica no VE atingiu níveis semelhantes àqueles do período controle. Sendo assim, a pressão desenvolvida no VE apresentou-se reduzida nos 35 minutos que se seguiram, indicando a perda da proteção parcial aos efeitos da I/R, outrora conferida pelo DMA. Para avaliar o efeito do DMA na expressão da NOS, os animais foram tratados com DMA ou veículo 24 e 48 horas antes dos experimentos de westhern blot. Os resultados indicara que 24 horas após o tratamento com DMA ocorreu aumento de cerca de 189% na quantidade de iNOS expressa no miocárdio e que nos corações de ratos tratados com DMA, com 48 horas de antecedência, ocorreu aumento de cerca de 48% na quantidade de iNOS expressa no miocárdio. CONCLUSÕES: O composto DMA induziu: I - a proteção tardia em corações isolados de ratos; 2 - a maior expressão de óxido intrico sintetase nos corações de ratos e 3 -esta proteção pode ser dependente de óxido nítrico Abstract: Background: -The phenomenon of Ischemic preconditioning (IP) is a period of sublethal ischemia that can profoundly protect the cell from infarction during a subsequent ischemic. The cardioprotection has become known "early"' and "delayed" ischemic preconditioning, The early cardioprotection provokes the release of several autacoids that trigger protection by occupying cell surface receptors. The delayed cardioprotection confers a new protein synthesis, posttranslational protein modification, and a change in the compartments 1 bation of existing proteins. Adenosine acts to trigger ischemic preconditioning's protection. In addition, nitric oxide (NO) has been linked to the trigger and end-effector phases of delayed preconditioning. In the present work, we tested DMA, derived from 4-anilinoquinazolines, described firstly as a tyrosine kinase inhibitor, belonging to EOF receptor family, to test its mechanism of action in the IP. Objectives: The aims of the present study are: 1 - to evaluate the effect of DMA (4-AM3'-AlA?-dimethylphenyl)ammo-6,7-dimethoxyqinnazoline hydrochloride) in the late delayed IP; 2 - to study the delayed protection of NO sinthetase (NOS) induced by DMA. Results: Wistar rats were once treated with DMA (1,2 rag/Kg, intravenous) or vehicle (DMSO) in the periods of 24 or 72 hours before IP protocols. The IPs were composed by 30 minutes of ischemia and 35 minutes of reperfusion. In the animals treated with vehicle it was observed increasing in the dyastolic pressure, and the systolic pressure was maintained in the same level of control. In the animals treated with DMA. it was observed increasing in the diastolic pressure (reperfusion period), but less intense than that observed in the vehicle-treated animals. As the systolic pressure observed in the DMA-treated animals had the same intensity observed in the control period, the developed pressure in the reperfusion period had the same intensity, indicating parcial effect in the IP. To evaluate whether the DMA protection is dependent on NOS, the animals were treated with L-NAME (30mg/Kg''day, before DMA or vehicle treatment] for 3 days., ft was observed in both groups, in the animals treated with L-NAME vehicle and L-NAME DMA. that the heart beating recovery was followed by increasing in the dyastolic pressure, when compared with the control period. The systolic pressure had the same level observed m the control period, indicating decrease in the partial protection. Finally, to evaluate the effects of DMA in the NOS expression, the animals were treated with DMA or vehicle 24 and 48 hours before westhern blot assays. In the animals treated 24 hours before DMA administration, it was observed increase (189%) in the iNOS expression. In addition, a 48%-increasing was observed in the animals 48 hours before DMA administration. Concluding remarks: The effects of DMA observed were: I - delayed protection, in isolated hearts from rats; 2 - increased expression of iNOS and finally 3 this protection might be dependent on nitric oxide Mestrado Mestre em Farmacologia

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, de vida curta, que modula a neurotransmissão, a força de contração, o metabolismo de glicose, o tônus vascular e a função muscular em geral. O músculo esquelético é a maior fonte de NO em mamíferos e expressa todas as três isoformas de NO sintases (NOS). Os inibidores da NOS são ferramentas usadas para estudar a função do NO na fisiologia muscular. Neste trabalho, nós examinamos os efeitos do tratamento crônico de ratos com N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), que bloqueia a síntese de NO pelas NOSs, através de parâmetros bioquímicos e morfológicos dos músculos soleus e extensor digitorum longus. A tipagem das fibras musculares, a medida da área de secção transversal das fibras, a expressão das isoformas de miosina, a determinação do número dos núcleos da fibra muscular e, a expressão e imunolocalização da NOS endotelial e neuronal foram parâmetros usados para avaliar os efeitos da falta de NO nos músculos. Os ratos foram tratados com L-NAME (20 mg/rato/dia, na água de beber dos animais) por duas, quatro e oito semanas. Decorridos esses tempos, os animais foram sacrificados e os músculos removidos e processados para análises. O tratamento crônico dos ratos com L-NAME causou um pequeno (13.2%), porém significativo, decréscimo na porcentagem das fibras tipo I, após duas semanas de tratamento, e aumento na área de secção transversal das fibras IID, após oito semanas de tratamento, no músculo soleus. Não houve diferenças significativas na porcentagem dos tipos de fibras, ou em suas áreas de secção transversal no músculo extensor digitorum longus. O número de núcleos da fibra muscular, também usado como um indicador de hipertrofia da fibra, não apresentou diferenças significativas nos ratos tratados com L-NAME. Igualmente, não houve alterações significativas na expressão e distribuição das NOSs endotelial e neuronal, ou na expressão das isoformas de miosina de ambos os músculos.Estes resultados mostram que a inibição crônica da biossíntese de NO pelo LNAME, nos períodos pesquisados, em geral não altera os vários parâmetros estudados nos músculos soleus e extensor digitorum longus, exceto para as fibras tipo I e tipo IID no músculo soleus Abstract: Nitric oxide (NO) is a short-lived gas molecule that modulates neurotransmission, contractile force, glucose metabolism, vascular tone, and muscle function in general. Skeletal muscle is a major source of NO in mammals and expresses all three isoforms of NO synthases (NOS). Inhibitors of the NOS are useful tools for studying the role of NO in muscle physiology. In this work, we examined the effects of chronic treatment of rats with N?-nitro- L-arginine methyl ester (L-NAME), which blocks the synthesis of NO by NOSs, through selected biochemical and morphological parameters of soleus and extensor digitorum longus muscles. Fiber typing, fiber cross-sectional area, expression of myosin isoforms, number of muscle fiber nuclei, and the expression and immunolocalization of endothelial and neuronal NOS were used to assess the effects of NO deprivation. Rats were treated with L-NAME (20 mg/rat/day, in the drinking water) for two, four and eight weeks, after which the animals were sacrificed and the muscles removed and processed for analysis. The chronic treatment of rats with L-NAME caused a slight (13.2%) but significant decrease in the percentage of type I fibers after two weeks of treatment and in the cross-sectional area of IID fibers after eight weeks of treatment in soleus muscle. There were no significant differences in the percentage of fiber types or in their cross-sectional areas in the EDL. The number of muscle fiber nuclei, also used as an indicator of hypertrophy, did not show significant differences in the treated rats. Likewise, there were no significant changes in the expression and distribution of endothelial and neuronal NOS, or in the expression of myosin isoforms. These results show that the chronic inhibition of NO biosynthesis by L-NAME in the time intervals examined, generally did not alter the various parameters studied in rat soleus and extensor digitorum longus muscles, except for type I and IID fibers in soleus muscle Mestrado Histologia Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O óxido nítrico (NO) é um radical livre, gasoso, inorgânico, incolor, que possui sete elétrons do nitrogênio e oito do oxigênio, tendo um elétron desemparelhado. Até meados da década de 1980, o NO era considerado apenas membro de uma família de poluentes ambientais indesejáveis e carcinógenos potenciais. Atualmente, o NO constitui um dos mais importantes mediadores de processos intra e extracelulares. Este radical é produzido a partir da L-arginina, por uma reação mediada pela enzima NO-sintase constitutiva (c-NOS) e induzível (i-NOS). O NO apresenta um papel dúbio, às vezes benéfico, outras vezes prejudicial ao organismo. Está envolvido no relaxamento vascular e tem um papel de grande importância na proteção do vaso sangüíneo. Constitui um importante mediador citotóxico de células imunes efetoras ativadas, capaz de destruir patógenos e células tumorais. Possui, ainda, um papel como mensageiro/modulador em diversos processos biológicos essenciais. No entanto o NO é potencialmente tóxico. A toxicidade se faz presente particularmente em situações de estresse oxidativo, geração de intermediários do oxigênio e deficiência do sistema antioxidante. A determinação laboratorial do NO é complexa, e a caracterização de ativadores e inibidores específicos da síntese de NO constitui o novo desafio para o entendimento e o tratamento de várias doenças. Estudos envolvendo o NO têm sido um dos principais alvos da indústria farmacêutica. Nitric oxide (NO) is an inorganic and incolor free radical gas containing seven electrons from nitrogen and eigth from oxigen and one unpaired electron. Until midlle of 1980 decade, NO was considered as a member of an undesiderable and envirommental poluents family and as a potential carcinogen agents. At the moment, NO constitutes one of the most important mediators of intra and extra cellular processes. This radical is produced from the L-arginine envolving a reaction mediated by constitutive and inducible NO synthase. NO presents a dubious role, sometimes it brings benefits, sometimes it is harmful. It is envolved in the vascular relaxing and it protects the blood vessels. It constitutes an important cytotoxic mediator on immune activated cells capable of killing pathogenic agents and tumor cells. It also has a role as messager/modulator in a variety of essential biological processes. However, NO is a potentially toxic agent, whose toxicity could be particulary denoted in stress oxidative conditions, by the generation of O2 intermediates and antioxidant system deficiency. Laboratory measurement of NO is complex and the characterization of specific activators and inhibitors of the NO synthesis constitutes the new challenge for a better comprehension and treatment of a number of pathologies. NO studies have been one of the main target for pharmaceutical industries.