The aim of the research project was the development of competitive amperometric biosensors for clinical diagnostics and food safety applications, as a part of a research activity focused on innovations in sensing systems investigated in our laboratories of analytical chemistry. In particular, the project purpose was the development of innovative sensors for detection of serum biomarkers for HIV (Human Immunodeficiency Virus) and HCV (Hepatitis C Virus) and the development of competitive immunosensor for detection of prolamins in food products for celiac disease patients. The number of subjects living with HIV/HCV co-infection is increasingly high, about 50000 in Italy, and this is mostly ascribable to the routes of transmission, which are common to the two viruses. For subjects who present one of the two infections, the co-presence has important consequences that can lead to a rapid course of the disease to the acute phase and, in some cases, to death; for these reasons, an early diagnosis through rapid and accurate diagnostic techniques is fundamental. The diagnostic methods currently available are mainly based on the detection of antibodies, viral nucleic acids or on the research of the capsid proteins. The first method is not useful for early diagnosis purposes, requiring a long period, called “window period”, for antibodies development by the immune system and their detection in blood stream. Methods based on the research of nucleic acids allow a more rapid diagnosis, although they require sophisticated instrumentation and expert technicians, in addition to high costs of analysis. A good compromise between the above-mentioned methods is the search of the viral capsid proteins, which are developed earlier than antibodies and are detectable in blood stream since the first weeks after the contraction of the virus, requiring easy-to-use instrumentations and inexpensive analysis. In the present study, we focus on these proteins, respectively p24 for HIV and NS4 for HCV, with the aim of developing immunosensors for early diagnosis of the infections, as alternative to the already available methods, mainly ELISA-based test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). In a first stage of the research activity, the main purpose was the development of dual-chip devices aimed at detecting simultaneously the two capsid proteins, allowing the diagnosis of co-infection. Before using the dual chip device, HIV and HCV systems were studied individually, in order to assess the methods of detection for each specific antigen and to optimize the experimental conditions for each of them. The study was initially focused on p24 determination by means of amperometric immunosensors implemented on screen-printed electrodes. The most critical step in biosensors development is the functionalization of the electrode with the bio-receptor. This aspect required the study of different methodological approaches, based on the immobilization of anti-p24 antibodies or p24 antigen, for the realization of sandwich-type or competitive assays, respectively. In the case of the sandwich system, the easiest approach of functionalization evaluated was the direct incubation of anti-p24 antibodies on the working electrode of screen-printed glassy carbon substrates, functionalized with gold nanoparticles (GNP-SPCEs). The immobilization of anti-p24 antibodies evidenced critical aspects related to their proper orientation with consequent alteration of the binding properties for the target antigen. In order to allow the recognition of one or more epitopes of the corresponding antigen, the proper orientation of the antibodies can be induced promoting the linkage via the Fc fraction, using auxiliary proteins such as protein A and G. Although these proteins facilitate the correct orientation of the antibody, they do not ensure the stability of functionalization, as in the case of covalent linking. It was thus decided to evaluate the functionalization through covalent approach of Self-Assembled Monolayers (SAM), by using 11-mercapto-undecanoic acid, activated with N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide as coupling reagents. It was also experimented the combination of the SAM with the G protein, in order to ensure both the robust functionalization of the electrode surface and the correct orientation of the antibody. The best results were obtained using the competitive approach. Initially the immobilization of p24 antigen was performed both by direct incubation on the electrode surface using SAMs as linkers. In fact, although the direct electrode functionalization is the simplest approach, the chemisorption could involve functional groups which are fundamental for the immunochemical recognition of the antibody. To overcome this problem, a method involving the use of chitosan, as active layer immobilized on gold-free glassy carbon electrodes, in association to glutaraldehyde, as cross-linker agent, was successfully investigated. On the basis of these findings, it was realized a competitive amperometric sensor for p24 detection, based on its immobilization on screen-printed glassy carbon electrodes (SPCEs). The anti-p24 antibodies immunosorbed on p24-modified SPCEs were detected via alkaline phosphatase-labeled secondary antibodies, through an enzymatic reaction processed on hydroquinone diphosphate, used as substrate. In order to optimize the concentrations of antigen immobilized on the electrode surface and of anti-p24 antibody, a two factors and three levels experimental design was performed, working at a pre-fixed concentration of p24 in competition. A two-way analysis of variance (ANOVA) was applied to investigate the effects of the experimental parameters on the inhibition rate, taking place on the basis of the immunocompetition. The resulting interaction plot allowed us to individuate the optimal concentration of antigen on the electrode surface and antibody in competition, so that different concentrations of antigen in competition were explored. The outcome data were processed by a four- parameters logistic function, obtaining the corresponding inhibition curve. The developed sensor allowed to detect p24 at micrograms/mL levels, with good performance in terms of precision and trueness; however, since limits of detection and quantification were not adequate for diagnostic purposes, further optimization resulted necessary. Similar studies, still in progress, have also been performed with the aim of developing a similar competitive assay for HCV virus detection. To improve the performance of the sensor, in terms of diagnostic suitability for HIV infection, the use of single-walled carbon nanotubes (SWCNT) as electrode substrate was evaluated. These nanomaterials have the advantage of presenting a greater surface area, resulting in higher functionalization of the electrode, which is helpful to improve efficiency of electron transfer processes. Thus, starting from the optimal concentrations obtained with the previous experimental design, performance of new electrodes were evaluated, obtaining a remarkable improvement of the instrumental response. After a further optimization of the anti-p24 concentration, it was developed a sensitive device able to work in a lower concentration range, with limits of detection and quantification of 95 pg/mL and 2.6 ng/mL, respectively, more useful for diagnostic and clinical purposes. Concurrently with the study carried out individually on the two systems, the evaluation of dual device setup was performed. For this purpose, two elliptic working electrodes, sharing the same reference and counter electrodes, i.e. dual screen-printed electrodes were used. The main drawbacks when working with dual devices is the so called "cross-talk", taking place because of diffusion of the electroactive product of the enzyme reaction (hydroquinone) between the two working electrodes, giving rise to false positive results. This problem can be overcome with the use of the enzyme substrate 3-indoxyl phosphate (3-IP) in the presence of a silver salt (AgNO3). Alkaline phosphatase catalyzes the dephosphorylation of 3-IP, into a product able to reduce Ag+ to Ag0, which is localized where the enzymatic label AP is attached. The deposited silver can be electrochemically stripped into solution and measured by anodic stripping voltammetry, obtaining a signal related to the concentration of analyte to be detected. Concerning the determination of p24, also the dual devices requested optimization studies in terms of chitosan/glutaraldehyde, antigen/antibody concentrations and reaction times, in order to reach useful signals comparable with those obtained with the single SPCEs, working with hydroquinone diphosphate as enzyme substrate. However, preliminary studies with the dual device showed strong limits mainly ascribable to the size of the working electrodes and to their elliptical geometry, causing a great difficulty on their functionalization, with the risk of contamination and false positives, due the contiguity of the two electrodes. In order to further improve the performance of the immunosensors for determination of p24, a part of the research activity was carried out, within the context of a collaboration, with the Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2) in Barcelona (Spain), at the NanoBioelectronics and Biosensors Group, directed by Professor Arben Merkoci. The project carried out at ICN2 involved the use of magnetic beads (MBs) as substrates for immunoconcentration and bi-metallic nanoparticles as label enzyme-free agents for the electrochemical measurements. MBs were functionalized with p24, performing the subsequent antigen detection by using bi-metallic gold/silver nanoparticles, The electrochemical detection was carried out by exploiting the catalytic properties of bi-metallic nanoparticles, conjugated with the anti-p24 antibody, through direct and enzyme-free amperometric measurements. The integration of previous studies with those conducted during the period of stay at the ICN2 allowed to evaluate the advantages of sample pre-concentration on the magnetic beads, in perspective of immunosensor application in a complex matrix, such as blood serum. It was also possible to compare the performance of bi-metallic nanoparticles, as labeling systems alternative to enzymes. Another part of the thesis work was aimed at the application of the experimental protocols of the competitive assays for development and validation of an innovative amperometric immunosensor for the detection of gliadin and other allergenic prolamins, which have a great impact in the diet of celiac patients owing to their toxicity in celiac disease. It should be noted that the developed immunosensor is the first example of competitive device applied for detection of gliadin in food products. The novelty of this study relies in the assessment of the compatibility of the method with the use of complex solutions required for the extraction of the target analytes from food matrices, as raw materials or finished products, e.g. the Cocktail Solution®, composed by disaggregating and/or reducing agents, such as mercaptoethanol and guanidine, developed and patented by D.E. Mendez and approved by the Association of Official Agricultural Chemists, U.S. Department of Agriculture (AOAC). After optimization by means of experimental design procedures, the immunosensor was, tested for its applicability to the analysis of both raw materials and processed food. Limits of detection and quantification of 8 and 22 ng/ml of gliadin, respectively, were obtained in the case of ethanol exctracts of raw food materials. No interference from non-allergenic prolamins, such as those contained in corn and rice, typically used in the formulation of gluten-free foods, was observed. This is consistent with the special features of anti-gliadin antibody used in sensor development, attesting a further proof of the absence of non-specific responses. Good results were obtained also in the analysis of complex food samples, thus highlighting the good performance of the device as a powerful rapid and effective screening tool in quality control of gluten-free foodstuffs for celiac subjects. L’attività di ricerca svolta nel periodo di tesi è stata rivolta allo studio e allo sviluppo di biosensori amperometrici competitivi per la diagnostica clinica e la sicurezza alimentare, inserendosi nel più ampio ambito di ricerca relativo ad innovazioni nella sensoristica investigato nel laboratorio di chimica analitica presso cui l’attività è stata svolta. In particolare, in ambito clinico il lavoro è stato rivolto allo sviluppo di sensori innovativi per la determinazione di biomarker ematici associati a HIV (Human Immunodeficiency Virus) e HCV (Hepatitis C Virus) e, nell’ambito della sicurezza alimentare, allo sviluppo di un immunosensore competitivo per la determinazione di prolammine in alimenti destinati all’alimentazione dei celiaci. L’interesse a sviluppare un metodo rapido e a basso costo per la determinazione di HIV e HCV ha preso spunto dall’incidenza della co-infezione da questi virus, che conta un numero di soggetti interessati sempre più elevato, circa 50000 in Italia, essendo ciò in gran parte riconducibile alle vie di trasmissione che accomunano i due virus. Per i soggetti che presentano una delle due infezioni, l’eventuale co-presenza comporta importanti conseguenze che possono portare ad un rapido decorso della patologia alla fase acuta ed in alcuni casi alla morte; per questo è importante individuarla tempestivamente mediante tecniche diagnostiche rapide ed affidabili. I metodi di diagnosi ad oggi disponibili sono principalmente basati sulla ricerca degli anticorpi, su quella degli acidi nucleici virali o sulla ricerca delle proteine capsidiche. Si evidenzia come il primo metodo non sia utile ai fini di una diagnosi precoce, necessitando di un periodo lungo, detto “periodo finestra”, affinché tali anticorpi vengano sviluppati dal sistema immunitario e siano rivelabili nel circolo ematico. I metodi basati sulla ricerca degli acidi nucleici, invece, consentono una diagnosi più rapida, sebbene richiedano una strumentazione sofisticata e tecnici esperti, in aggiunta ad un elevato costo di analisi. Un buon compromesso tra i metodi citati è, invece, rappresentato dalla ricerca delle proteine capsidiche virali che si sviluppano ed entrano nel circolo sanguigno sin dalle prime settimane successive alla contrazione del virus, e sono rivelabili con una strumentazione di più facile utilizzo e con analisi a basso costo. Tali proteine, rispettivamente p24 per il virus HIV e NS4 per HCV, sono state oggetto di studio nel progetto svolto durante il percorso di dottorato, con l’obiettivo di realizzare dispositivi che consentano una diagnosi precoce delle infezioni, come alternativa ai metodi già disponibili, principalmente test di tipo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Una prima ipotesi progettuale ha riguardato la messa a punto di dispositivi dual chip allo scopo di determinare simultaneamente le due proteine capsidiche in oggetto, permettendo così la diagnosi di co-infezione. Prima di realizzare il dispositivo dual chip, sono stati studiati singolarmente i sistemi HIV e HCV, allo scopo di valutare le modalità di rivelazione dei due antigeni specifici ed ottimizzare per ciascuno il metodo; in una prima fase del lavoro, lo studio è stato diretto sul sistema HIV, partendo da un sistema screen-printed semplice. La fase più complessa nella realizzazione del biosensore è l’immobilizzazione del biorecettore sulla superficie dell’elettrodo. Ciò ha richiesto lo studio di diversi approcci metodologici: nel caso di HIV, questi sono stati valutati sia riguardo alla funzionalizzazione dell’elettrodo con l’anticorpo anti-p24 sia con l’antigene p24, realizzando nel primo caso un saggio di tipo sandwich e nel secondo uno di tipo competitivo. Nel caso della realizzazione del sistema sandwich, l’approccio di funzionalizzazione più semplice che è stato valutato è quello dell’incubazione diretta del biorecettore sulla superficie di elettrodi screen-printed in glassy carbon, funzionalizzati con nanoparticelle d’oro (GNP-SPCEs). Poiché questo metodo non garantisce la corretta orientazione degli anticorpi per l’interazione con l’antigene, per favorire ciò si è fatto uso di proteine Fc specifiche, quali proteina A e G. Avendo tuttavia evidenziato come queste proteine non assicurino la stabilità di funzionalizzazione, come accade, invece, nel caso di linking covalente, in una fase successiva è stata valutata la funzionalizzazione tramite approccio covalente con il metodo del “Self-Assembled Monolayer” (SAM), che prevede l’impiego dell’acido 11-mercapto-undecanoico e la sua attivazione con NetilN'(3‐dimetilamminopropil)carbodiimmide e Nidrossisuccinimmide. Infine è stata valutata anche la combinazione del SAM con la proteina G, al fine di assicurare una robusta funzionalizzazione dell’elettrodo e la corretta orientazione dell’anticorpo. I migliori risultati sono stati ottenuti con l’approccio di tipo competitivo. Inizialmente la funzionalizzazione dell’elettrodo con l’antigene è stata eseguita sia tramite incubazione diretta sull’elettrodo, sia tramite SAM. Infatti, poichè la funzionalizzazione diretta dell’elettrodo coinvolge nel chemi-adsorbimento gruppi funzionali fondamentali nella fase di immunochimica di riconoscimento dell’anticorpo, per risolvere questo problema si fa spesso uso di reagenti bi-funzionali come il SAM. Anche quest’ultimo approccio esplorato ha tuttavia mostrato dei limiti, riconducibili alla parziale inibizione dell’interazione antigene-anticorpo alla base del saggio immunologico. Nell’ottica, quindi, dello sviluppo di saggi con protocollo competitivo, è stato infine investigato un metodo che prevede l’utilizzo del chitosano, che funge da supporto attivo, immobilizzato su elettrodi gold-free in glassy carbon, in combinazione con la glutaraldeide, avente il ruolo di cross-linker. Quest’ultimo metodo ha fornito i migliori risultati per la funzionalizzazione della superficie dell’elettrodo di lavoro con l’antigene p24, e ha permesso di fare studi preliminari di immunosaggi competitivi. Sulla base dei risultati ottenuti, infatti, è stato realizzato un sensore amperometrico competitivo per la determinazione di p24, basato sulla sua immobilizzazione su elettrodi screen printed in glassy carbon (SPCEs), ai fini della sua successiva interazione con un anticorpo anti-p24, con l’obiettivo di sviluppare un sistema basato sul principio di funzionamento dei saggi ELISA competitivi. In accordo a questo protocollo, la rivelazione dell’anticorpo avviene tramite un anticorpo secondario marcato con fosfatasi alcalina, mediante una reazione enzimatica sul substrato idrochinone difosfato. Allo scopo di ottimizzare le concentrazioni di antigene immobilizzato sull’elettrodo e di anticorpo anti-p24, è stato utilizzato un approccio multivariato eseguendo un disegno sperimentale con piano fattoriale completo a due fattori e tre livelli, lavorando ad una definita concentrazione di p24 in competizione. I dati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA) a due vie con interazioni, per studiare le interazioni tra le variabili e la loro influenza sul responso. Individuate le concentrazioni ottimali di p24 e di anticorpo, sono state esplorate diverse concentrazioni di antigene in competizione, interpolando i dati con la funzione logistica a quattro parametri, ottenendo la curva di inibizione. Il sensore così realizzato è risultato applicabile a concentrazioni di p24 dell’ordine dei µg/mL, con buone prestazioni in termini di precisione ed esattezza, ma con limiti di rivelazione e quantificazione non adeguati per fini diagnostici, rendendo pertanto necessari successivi studi di ottimizzazione del sistema. Studi analoghi, tuttora in corso, sono stati condotti anche per il virus HCV con l’obiettivo di sviluppare un analogo saggio competitivo. Allo scopo di migliorare le prestazioni del sensore per la diagnosi dell’infezione da HIV, sulla base della sua proteina capsidica p24, è stato valutato l’impiego di elettrodi funzionalizzati con nanotubi di carbonio (SWCNT). Questi hanno il vantaggio di presentare una maggiore area superficiale, con conseguente maggiore funzionalizzazione dell’elettrodo ed efficacia dei processi di trasferimento elettronico alla base della fase di rivelazione elettrochimica. Le prestazioni dei nuovi elettrodi, valutate sulla base delle concentrazioni di antigene ed anticorpo ottimizzate mediante il disegno sperimentale precedentemente effettuato, si sono dimostrate superiori, registrando un significativo aumento dell’intensità dei segnali registrati. Alla luce di ciò, modificando la concentrazione dell’anticorpo anti-p24 mediante una ulteriore procedura di ottimizzazione, è stato realizzato un sensore in grado di lavorare in un intervallo di concentrazioni inferiore e più ampio, dotato di maggiore sensibilità con limiti di rivelazione e quantificazione rispettivamente di 95 pg/mL e 2.6 ng/mL, più adeguati a scopi diagnostici e clinici. In concomitanza con lo studio svolto singolarmente sui due sistemi, in previsione dell’impiego del dispositivo dual, questo setup strumentale è stato valutato con HIV. Il problema principale affrontato nell’utilizzo dei dispositivi dual è il cosiddetto fenomeno del “cross talk” dovuto alla diffusione della specie elettroattiva, l’idrochinone, tra i due elettrodi di lavoro, con conseguenti “falsi positivi” nella risposta del saggio. Per far fronte a questo problema è stato utilizzato un sistema di trasduzione che prevede l’utilizzo del substrato enzimatico 3-indossilfosfato (3-IP) in presenza di un sale di argento (AgNO3). Tale substrato viene defosforilato dall’enzima fosfatasi alcalina e l’intermedio che si forma è in grado di ridurre l’Ag+ ad Ag0, che va quindi a depositarsi in situ sull’elettrodo di lavoro. Successivamente è stato applicato un potenziale di ri-ossidazione dell’argento, ottenendo così un segnale di “stripping anodico”, la cui intensità, in termini di corrente, è correlata alla concentrazione di analita da rivelare. Il dispositivo dual ha richiesto, inoltre, studi di ottimizzazione delle concentrazioni di chitosano/glutaraldeide, nonché dell’antigene e dell’anticorpo, per fornire segnali significativi e comparabili con quelli ottenuti con il dispositivo mono-chip ed il substrato idrochinone difosfato. Sono stati eseguiti, inoltre, studi sui tempi ottimali di reazione enzimatica sul sistema 3-IP/AgNO3. Gli studi preliminari condotti sul dispositivo dual hanno, tuttavia, evidenziato dei limiti riconducibili principalmente alle dimensioni degli elettrodi di lavoro e alla loro geometria ellittica, che comporta una grande difficoltà nella loro funzionalizzazione, con il rischio, inoltre, di contaminazioni e “falsi positivi” dovuti alla contiguità dei due elettrodi. Sulla base di questi risultati, si è ritenuto opportuno focalizzare l’attività di ricerca sull’ottimizzazione dell’immunosensore competitivo per la diagnosi della infezione solo da HIV, rinviando in una fase successiva lo studio inerente la determinazione simultanea dei due markers. Allo scopo di migliorare ulteriormente le prestazioni del sensore in termini di sensibilità, studi successivi sono stati basati sull’impiego di approcci innovativi di preconcentrazione del campione e di rivelazione elettrochimica tramite l’impiego di particelle bi-metalliche. A tal fine, è stato svolto un progetto presso l’Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia (ICN2) a Barcellona (Spagna), nel gruppo di NanoBioelectronics and Biosensors coordinato dal Professor Arben Merkoçi, che ha riguardato l’impiego di beads magnetiche funzionalizzate con p24, come substrati per immunoconcentrazione, e successiva rivelazione dell’antigene tramite nanoparticelle miste oro/argento, utilizzate come label per la rilevazione elettrochimica enzyme-free. Secondo questo protocollo, la rivelazione elettrochimica avviene sfruttando le proprietà catalitiche delle particelle bi-metalliche, con le quali l’anticorpo di lettura è coniugato, che viene direttamente rivelato per via amperometrica. L’integrazione degli studi precedentemente svolti con quelli condotti durante il periodo di permanenza presso l’ICN2 ha permesso di valutare i vantaggi derivanti dalla preconcentrazione del campione sulle beads magnetiche, nella prospettiva dell’utilizzo dell’immunosensore su matrici complesse, come il siero da campioni di sangue. Sono state inoltre confrontate le prestazioni di enzimi e nanoparticelle bi-metalliche, come sistemi di labelling per la rivelazione amperometrica del segnale, considerando la più facile coniugazione degli anticorpi con le nanoparticelle piuttosto che con gli enzimi, con possibili vantaggi in termini di prestazioni e costi di realizzazione del dispositivo sensoristico. L’attività di ricerca nel periodo di tesi è stata parallelamente rivolta all’applicazione dei protocolli sperimentali dei saggi competitivi per la messa a punto e validazione di un immunosensore amperometrico per la rivelazione di gliadina e altre prolammine allergeniche, di rilevante importanza nella dieta dei soggetti celiaci. Il sensore realizzato rappresenta il primo esempio di dispositivo competitivo applicato alla determinazione della gliadina in matrici alimentari. Una peculiarità dello studio ha riguardato la valutazione della compatibilità del metodo con l’utilizzo di soluzioni appositamente studiate per l’estrazione di gliadina da matrici alimentari come materie prime o prodotti finiti. Tali soluzioni contengono componenti ad effetto disaggregante e/o riducente, come il mercaptoetanolo e la guanidina, presenti nella Cocktail Solution®, scoperta e brevettata da E. Mendez ed approvata dalla Association of Official Agricultural Chemists, U.S. Department of Agriculture (AOAC). L’immunosensore è stato ottimizzato mediante procedure di experimental design, e applicato all’analisi di materie prime estratte con etanolo al 60% (v/v), dal momento che questo solvente non comporta interferenze significative durante l’esecuzione degli immunosaggi, mentre i campioni di prodotti alimentari finiti e sottoposti a trattamenti termici e/o enzimatici sono stati estratti con cocktail solution e successivamente analizzati con il dispositivo da noi sviluppato. Nel caso degli estratti con etanolo, sono stati ottenuti limiti di rivelazione e di quantificazione rispettivamente pari a 8 e 22 ng/ml di gliadina. Non sono state riscontrate interferenze da parte di prolammine non allergeniche, come quelle contenute in mais e riso, tipicamente utilizzati nella formulazione di alimenti gluten-free. Tale dato è coerente con le caratteristiche peculiari dell’anticorpo anti-gliadina impiegato nello sviluppo del sensore, ad ulteriore dimostrazione dell’assenza di responsi aspecifici. Buoni risultati sono stati ottenuti anche nell’analisi di campioni più complessi, estratti con cocktail solution, evidenziando le buone prestazioni del dispositivo come potente strumento di screening rapido ed efficace nel controllo qualità di alimenti gluten-free destinati all’alimentazione dei soggetti celiaci.