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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019. Nos últimos anos, o surgimento, ou ressurgimento, de diferentes arboviroses gerou um alerta global. Diferente da infecção causada por outros flavivírus, a infecção pelo ZIKV pode ocasionar alterações neurológicas, tais como malformações cerebrais em crianças de mães infectadas durante a gravidez, conhecidas como síndrome congênita do Zika (SCZ). Também foram relatadas outras alterações neurológicas, como a síndrome de Guillain- Barré. A microcefalia é uma desordem de células progenitoras neurais (CPN) desencadeada pelo isolado brasileiro (ZIKVPE243), a qual pode atravessar a placenta e induzir neuroinflamação e ativação microglial. O isolado africano (ZIKVMR766) também mostrou ser capaz de infectar células-tronco humanas pluripotentes in vitro e induzir a morte celular por apoptose, entretanto, não foram relatados casos de CSZ associados a esta linhagem. Estes dados, junto com as poucas informações disponíveis a respeito dos mecanismos neuroinflamatórios desencadeados por infecções virais, nos levaram a avaliar a possível relevância fisiológica dos receptores ativados por proliferadores peroxissomais (PPARs) na resposta inflamatória após infecção de células da microglia-BV2 com as linhagens africana e asiática do vírus Zika. Em um primeiro momento foi possível observar que os isolados ZIKVMR766 e ZIKVPE243 são capazes de infectar células da micróglia da linhagem BV2 e produzir partículas virais infecciosas, embora em níveis menores que os descritos para outros tipos celulares e não induzir efeitos citopatogênicos. Por outro lado, ambas os isolados induziram a expressão dos marcadores de ativação Iba1, CD68, enquanto a expressão do MHC-II foi induzida apenas pelo ZIKVMR766. A infecção pelo ZIKV mostrou induzir a expressão de PPARγ nas células BV2, sendo claramente superiores em células infectas pelo isolado brasileiro, no entanto as células não apresentaram expressão de PPARα. De modo geral, as células infectadas pelo isolado africano apresentaram maiores níveis de expressão das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α. O tratamento com Rosiglitazona evidenciou a participação do PPARγ na modulação destas citocinas. Os níveis de expressão dos miRNAs 146a e 124 se correlacionam de foram geral com os níveis de expressão de PPARγ, e com os das citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias, além de se correlacionar com seu alvo, a proteína TRAF6, um importante mediador inflamatório. Esperamos que as diferenças observadas entre as duas linhagens do ZIKV nos auxiliem, numa etapa posterior, a esclarecer os mecanismos moleculares envolvidas na doença ou proteção, virulência, tropismo tecidual, patologia, e evasão imune. Recently, the emergence or resurgence of different arboviruses has generated a global alert. Unlike infection caused by other flaviviruses, ZIKV infection can cause neurological alterations, such as brain malformations in children of mothers infected during pregnancy, related to as Congenital Zika Syndrome (SCZ). Other neurological changes, such as Guillain-Barré syndrome, have also been reported. Microcephaly is a neural progenitor (NSC) disorder triggered by the Brazilian isolate (ZIKVPE243), which can cross the placenta and induce neuroinfection and microglial injury. The African isolate (ZIKVMR766) was also shown to be capable of infecting pluripotent human stem cells in vitro, inducing apoptotic cell death, however, this strain is not related to the associated CSZ cases. These data, together with limited information available regarding the neuroinflammatory mechanisms triggered by viral infections, lead us to assess a possible physiological relevance of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), in the inflammatory response following microglia- BV2 cell infection by both isolates, African and Brazilian. At first glance, it was possible to observe that ZIKVMR766 and ZIKVPE243 are capable of infect BV2 lineage cells and produce infectious viral particles, besides the fact that they do not induce cytopathic effects, and that the viral production occurs at lower levels compared to other cell lineages described. On the other hand, both isolates triggered the expression of the activation markers Iba1, CD68, while MHC-II expression were induced only by ZIKVMR766. ZIKV infection induced PPARγ expression in BV2 cells, being clearly higher in cells infected by the Brazilian isolate, however PPARα was not expressed. Overall, cells infected by the African isolate showed higher levels of proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-α. Furthermore, Rosiglitazone treatment evidenced PPARγ participation in the modulation of these cytokines. The expression levels of miRNAs 146a and 124 correlates broadly with the expression levels of PPARγ, and with those of inflammatory and anti-inflammatory cytokines. Those miRNAs levels are also correlated with their target protein, TRAF6, an important inflammatory mediator. We hope that the differences observed between the two ZIKV isolates help us, at a later stage, to clarify the molecular mechanisms involved in disease or protection, virulence, tissue tropism, pathology, and immune evasion.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019. Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq). Nos últimos anos, o surgimento, ou ressurgimento, de diferentes arboviroses gerou um alerta global. À diferença da infecção por outros flavivírus, a infecção pelo vírus zika (ZIKV) pode ocasionar alterações neurológicas, tais como malformações cerebrais em neonatos de mães infectadas durante a gravidez, incluindo encefalite, mielite e microcefalia, conhecidas como síndrome congênita do Zika (SCZ). Também foram relatadas outras alterações neurológicas, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos. A microcefalia é uma desordem de células progenitoras neurais desencadeada por ZIKV da estirpe brasileira, a qual pode atravessar a placenta e induzir neuroinflamação e ativação microglial. Vírus da cepa africana também mostrou ser capaz de infectar células-tronco humanas pluripotentes in vitro e induzir a morte celular por apoptose, entretanto, não foram relatados casos de SCZ associados a esta cepa. Estes dados juntos com as poucas informações disponíveis a respeito dos mecanismos de neurodegeneração envolvidos nos distúrbios neurológicos e o envolvimento de miRNAs em processos neuroinflamatórios desencadeados por infecções virais, nos levaram a realizar uma análise comparativa por PCR da expressão de miRNAs envolvidos na resposta inflamatória, assim como seus alvos celulares, após infecção de células imortalizadas da micróglia com ZIKV das cepas africana e asiática. Neste trabalho foi possível observar que os isolados da cepa africana (ZIKVMR766) e asiática (ZIKVPE243) são capazes de infectar células da micróglia de camundongos da linhagem BV2 e produzir vírus infecciosos, embora em níveis menores que os descritos para outros tipos celulares e não induzir efeitos citopatogênicos. Ambas os isolados induziram a expressão dos marcadores de ativação Iba1, CD68, enquanto a expressão do MHC-II foi induzida apenas pelo ZIKVMR766. A infecção pelo ZIKV mostrou induzir a expressão diferencial dos miRNAs 155, 146a, 132 e 125b, assim como dos respectivos alvos celulares envolvidos na regulação da resposta imune inata. A infecção pelo ZIKVMR766 mostrou induzir níveis maiores dos miRNAs que os induzidos pelo ZIKVPE243, especialmente do miR-146a em 24h (>7 folds). Também, ambos os isolados mostraram induzir um padrão diferencial na expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias, IFN-β, IFN-γ e IL-10. Esperamos que as diferenças observadas entre os isolados das duas cepas do ZIKV nos auxiliem, numa etapa posterior, a esclarecer os mecanismos moleculares envolvidas na doença ou proteção, virulência, tropismo tecidual, patologia, e evasão imune. In recent years, the emergence, or resurgence, of different arboviruses has generated a global alert. In contrast to infection with other flaviviruses, Zika virus (ZIKV) infection may cause neurological changes such as brain malformations in children of infected mothers during pregnancy, including encephalitis, myelitis, and microcephaly, known as Zika congenital syndrome (SCZ). Other neurological changes, such as Guillain-Barré syndrome, have also been reported. Microcephaly is a disorder of neural progenitor cells triggered by the Brazilian lineage (ZIKVPE243), which can cross the placenta and induce neuroinflammation and microglial activation. The African strain (ZIKVMR766) has also been shown to be able to infect pluripotent human stem cells in vitro and trigger cell death by apoptosis; however, no cases of SCZ associated to this lineage have been reported. These data, paired to the limited information available on mechanisms of neurodegeneration involved in neurological disorders, and the involvement of miRNAs in neuroinflammatory processes triggered by viral infections, led us to perform a qPCR to compare the miRNAs expression involved in the inflammatory response, as well as their cell targets, after infection of microglia-BV2 cells with the African and Asian strains of the Zika virus. In this work it was possible to observe that the ZIKVMR766 and ZIKVPE243 strains are capable of infecting BV2 lineage microglial cells and producing infectious viral particles, although at levels lower than those described in other cell types besides not inducing cytopathogenic effects. Both strains induced the expression of Iba1, CD68 activation markers, whereas MHC-II expression was induced only by ZIKVMR766. ZIKV infection has been shown to produce differential expression of miRNAs 155, 146a, 132 and 125b, as well as their respective cellular targets involved in the regulation of the innate immune response. ZIKVMR766 infection showed higher levels of miRNAs than that caused by ZIKVPE243, especially miR-146a in 24h (> 7 folds). Also, both strains have been shown to prompt a differential pattern in the expression of pro and anti-inflammatory cytokines, IFN-β, IFN-γ and IL-10. We expect that the observed differences between the two ZIKV strains will help us, at a later stage, to clarify the molecular mechanisms involved in the disease or protection, virulence, tissue tropism, pathology, and immune evasion.