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Fil: Storani, Alem. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La biomasa lignocelulósica representa una excelente fuente para la producción de biocombustibles y bioproductos de manera ecológica y sustentable, pero sus características estructurales hacen que sea recalcitrante a la degradación. Sin embargo, diversas enzimas son capaces de llevar a cabo este proceso a partir de la complementariedad de su actividad. En este trabajo de Tesis se caracterizaron bioquímica y estructuralmente enzimas involucradas en la degradación de la lignocelulosa pertenecientes a Ruminococcus albus 8. Específicamente, la caracterización de RalCel5G evidenció un modo de acción de endoglucanasa procesiva. El empleo de esta enzima en simultaneo con la celobiohidrolasa RalCel48A evidenció un efecto sinérgico en la degradación de la celulosa. Por su parte, en la caracterización de la xilanasa GH10 (RalXyn10A) se detectó un dominio N-terminal particular, asociado la regulación redox de la actividad enzimática y a la interacción con sustratos. La aplicación de esta hemicelulasa en combinación con RalCel5G y RalCel48A mostró un incremento sustancial en la capacidad de hidrólisis de sustratos lignocelulósicos complejos. Finalmente, las glicosil fosforilasas RalCBP y RalCDP, mostraron elevada actividad con monosacáridos y oligosacáridos, respectivamente. La eficiencia de cada una de ellas fue mejorada a partir de la eliminación del dominio N-terminal o la fusión de un CBM, respectivamente. Los avances logrados en el conocimiento de estas enzimas y sobre los mecanismos de acción e interacciones con los diferentes sustratos, facilitan el desarrollo de diversas aplicaciones biotecnológicas tales como la producción de biocombustibles, biopolímeros y/u otros materiales. Lignocellulosic biomass represents an excellent source for the production of biofuels and bioproducts in an ecological and sustainable manner, but its structural characteristics make it recalcitrant to degradation. However, various enzymes are capable of carrying out this process based on the complementarity of their activity. In this Thesis work, enzymes involved in the degradation of lignocellulose belonging to Ruminococcus albus 8 were biochemically and structurally characterized. Specifically, the characterization of RalCel5G revealed a processive endoglucanase mode of action. The employment of this enzyme simultaneously with the cellobiohydrolase RalCel48A showed a synergistic effect on the degradation of cellulose. During the characterization of xylanase GH10 (RalXyn10A) a particular N-terminal domain was detected, associated with the redox regulation of the enzymatic activity and the interaction with substrates. The application of this hemicellulase in combination with RalCel5G and RalCel48A showed a substantial increase in the hydrolytic capacity of complex lignocellulosic substrates. Finally, the glycosyl phosphorylases RalCBP and RalCDP showed high activity with monosaccharides and oligosaccharides, respectively. The efficiency of each one was improved from the elimination of the N-terminal domain or the fusion of a CBM, respectively. The advances achieved in the knowledge of these enzymes and the action mechanism and interactions with the different substrates, facilitate the development of various biotechnological applications such as the production of biofuels, biopolymers and/or other materials. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral

It was isolated bacteria strains from three different types of samples: fresh water, in situ baits and ex situ enrichment. Serial dilutions were prepared and culture was carried at 50 °C using a Basal-Saline medium. Isolated strains were screened for endoglucanase and xylanase activities with qualitative (Congo Red) and quantitative (DNS) methods. Molecular 16S rDNA sequencing analysis was performed for taxonomic identification. It was isolated 31 strains of which 14 showed hydrolytic activities and belonged to Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis species. Moreover, the strain B. subtilis DCH4 showed the highest endoglucanase activity at 45°C and pH 5, and xylanase activity at 55°C and pH 6. Then, DCH4 was cultivated by submerged fermentation with two different media supplemented with sugar cane bagasse, wheat straw, or quinoa stalk to evaluate its saccharification capability. Likewise, it was screening its xylanase and cellulase genes employing specific primers; the amplicons obtained were sequenced, and analyzed. It was found that, enzymatic extracts of DCH4 prepared with cane bagasse or quinoa stalk media achieved the highest endoglucanase and xylanase activities. According to molecular analysis of genes involved in the hydrolytic process, the endoglucanase and xylanase activities exhibited by DCH4 could be attributed to a bifunctional cellulase conformed by endo-beta-1,4-glucanase (GH5) joined to cellulose binding domain 3 (CBM3), and an endo-1,4-beta-xylanase (GH11), respectively. Further transcriptomic experiments would be considered to accomplish optimization strategies for biofuel production from lignocellulosic biomass., Se aislaron cepas de bacterias provenientes de tres tipos de muestras: agua fresca, cebos enriquecidos in situ y ex situ. Se prepararon diluciones seriadas y el cultivo fue a 50 °C usando un medio Salino-Basal. Las cepas aisladas fueron tamizadas para las actividades endoglucanasa y xilanasa con métodos cualitativos (Rojo Congo) y cuantitativos (DNS). Se usó el análisis molecular 16S rDNA para la identificación taxonómica. Se aislaron 31 cepas, de las cuales 14 mostraron actividades hidrolíticas y pertenecían a Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis. Además, B. subtilis DCH4 mostró la mayor actividad endoglucanasa a 45 °C y pH 5, y xilanasa a 55 °C y pH 6. Entonces, DCH4 se cultivó por fermentación sumergida con dos medios diferentes suplementado con bagazo de caña de azúcar, paja de trigo o tallo de quinua para evaluar su capacidad de sacarificación. También, se exploraron los genes de xilanasa y celulasa mediante cebadores específicos; los amplicones obtenidos fueron secuenciados y analizados. Se encontró que los extractos enzimáticos de DCH4 preparados con bagazo de caña o tallos de quinua mostraron las actividades endoglucanasa y xilanasa más elevadas. De acuerdo a los análisis moleculares de los genes involucrados en el proceso hidrolítico, las actividades de endoglunacasa y xilanasa exhibidas por DCH4 podrían atribuirse a una celulasa bifuncional conformada por una endo-beta-1,4-glucanasa (GH5) unida al dominio celulosa 3 (CBM3), y una endo-1,4-beta-xilanasa (GH11), respectivamente. Posteriores experimentos transcriptómicos podrían ser considerados para lograr estrategias de optimización para la producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica.

Pleurotus spp. are fungi capable of degrading lignocellulose material due to the excretion of enzymes with different industrial applications. This study aimed to investigate the influence of culture media on the production of mycelial biomass and the activity of laccase, cellulases, and xylanase of Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25, and U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22, and P. pulmonarius U16-21 were grown for 12 days at 28 ºC in malt extract medium (EM-20 g L-1), defined medium (MD glucose 10 g L-1 and yeast extract 2 g L-1), or in sugarcane bagasse (BC) medium equal to MD, but replacing glucose with bagasse (50 g L-1). The greatest growth occurred in the medium EM and P. djamor U16-25 was the strain that generated the greatest biomass (7.5 ± 0.1 g L-1). Most strains showed higher laccase activity in the MD medium and the greatests activities were P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1), and P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus and P. djamor U16-25 did not produce cellulases, but P. djamor U16-20 and P. eryngii produced the greatest cellulase activities in EM and MD media. All strains produced xylanase, and the highest activities were observed in the EM medium and P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) was the best producer. Pleurotus djamor U16-25 excelled as a producer of laccase and cellulase-free xylanase, revealing the potential for application in the paper and cellulose industry. Pleurotus spp. son hongos capaces de degradar la lignocelulosa debido a la excreción de enzimas con diferentes aplicaciones industriales. Este estudio tuvo como objetivo investigar la influencia de los medios de cultivo en la producción de biomasa micelial y la actividad de lacasa, celulasas y xilanasa de Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25 y U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22 y P. pulmonarius U16-21 se cultivaron durante 12 días a 28 ºC en medio extracto de malta (EM-20 g L-1), medio definido (MD glucosa 10 g L-1 y extracto de levadura 2 g L-1), o en medio de bagazo de caña de azúcar (BC) igual a MD, pero en sustitución de glucosa con bagazo (50 g L-1). El mayor crecimiento se presentó en el medio EM y P. djamor U16-25 fue la cepa que generó mayor biomasa (7.5 ± 0.1 g L-1). La mayoría de las cepas mostraron mayor actividad lacasa en el medio MD y las mayores actividades fueron P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1) y P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus y P. djamor U16-25 no produjeron celulasas, pero P. djamor U16-20 y P. eryngii produjeron las mayores actividades de celulasa en los medios EM y MD. Todas las cepas produjeron xilanasa, y las mayores actividades se observaron en el medio EM y P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) fue el mejor productor. Pleurotus djamor U16-25 se destacó como productor de de lacasa y xilanasa libre de celulasa, revelando el potencial de aplicación en la industria del papel y la celulosa. Pleurotus spp. são fungos capazes de degradar a lignocelulose graças à excreção de enzimas com diferentes aplicações industriais. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência dos meios de cultivo na produção de biomassa micelial e na atividade de lacase, celulases e xilanase de Pleurotus spp. Pleurotus citrinopileatus U16-23, P. djamor U16-20, U16-25 e U16-28, P. eryngii U16-30, P. ostreatus U16-22 e P. pulmonarius U16-21 foram cultivados por 12 dias a 28 ºC em meio extrato de malte (EM-20 g L-1), meio definido (MD glicose 10 g L-1 e extrato de levedura 2 g L-1), ou em meio bagaço de cana-de-açúcar (BC) igual ao MD, mas substituindo glicose por bagaço (50 g L-1). O maior crescimento ocorreu no meio EM e P. djamor U16-25 a cepa que gerou mais biomassa (7,5 ± 0,1 g L-1). A maioria das cepas apresentou maior atividade de lacase no meio MD e as atividades maiores foram de P. djamor U16-25 (22243 ± 745 U L-1) e P. pulmonarius (20924 ± 46 U L-1). P. citrinopileatus e P. djamor U16-25 não produziram celulases, mas P. djamor U16-20 e P. eryngii produziram as maiores atividades de celulase nos meios EM e MD. Todas as cepas produziram xilanase em e as maiores atividades foram observadas no meio EM e P. djamor U16-28 (67154 ± 1597 U L-1) foi o maior produtor. Pleurotus djamor U16-25 se destacou como produtor de lacase e de xilanase livre de celulase revelando potencial para aplicação na indústria de papel e celulose.

Existe un gran interés por el uso de enzimas lignocelulolíticas en varias industrias, y en la biodegradación de biomasa para la producción de biocombustibles y otras aplicaciones. Entre las fuentes microbianas de enzimas, Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, debido a sus niveles altos de secreción de proteína y a su condición GRAS (generally regarded as safe). El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de la concentración de inóculo en la morfología y producción de celulasas y xilanasas con A. niger en cultivo sumergido. Para ello, fueron inoculados matraces de 250 mL con 40 mL de medio con 3% (v/v) de una suspensión de 104 o 108 esporas por mililitro e incubados a 28 ºC y 175 rpm durante 120 horas. Se utilizaron 10 g*L-1 de lactosa como fuente de carbono. En cada caso se determinó la cantidad de biomasa, la proteína extracelular soluble, lactosa residual, actividad celulasa total y xilanasa cada 24 horas. Aunque no hubo un efecto notorio en la morfología de crecimiento, salvo en el color y el diámetro de pellets obtenidos, sí se afectó la µmax (0,06 y 0,03 h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) y la concentración máxima de biomasa. Además, mientras que las productividades volumétricas de celulasa (GFPA) (8,2 y 8,0 UI.*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) fueron similares para ambos inóculos, la productividad de xilanasa (GXIL) fue mayor para el inóculo más concentrado (29,7 y 33,4 UI¨*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente). Los resultados indican que la productividad de celulasas y xilanasas está estrechamente relacionada con la concentración de inóculo. There is a great interest for the use of lignocellulolytic enzymes in several industries and in biomass degradation for production of biofuels and other applications. Among the microbial sources of enzymes, Aspergillus niger is one of the most used microorganisms in the production of industrial enzymes due to its high levels of protein secretion and its GRAS (generally regarded as safe) condition. The aim of the present study was to evaluate the influence of A. niger inoculum concentration in the morphology and production of cellulases and xylanases in submerged cultures. For this, 250 mL flasks containing 40 mL culture medium were inoculated with a 3% (v/v) of either 104 or 108 spores per milliliter suspension and incubated at 28 º C and 175 rpm during 120 hours. Lactose (10 g*L-1) was used as the carbon source. In each case, the amount of biomass, the extracellular soluble protein, residual lactose, total celullase activity and xylanase activity were determined every 24 hours. Even thought there was not a notorious effect on the growth morphology, except in color and diameter of pellets; µmax was affected (0.06 and 0.03 h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) as well as maximum biomass concentration. In addition, while the volumetric productivity of cellulase (8.2 and 8.0 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) were similar for both inocula, the productivity of xylanase was greater for the more concentrated inoculum (29.7 and 33.4 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively).The results show that cellulase and xylanase productivities are closely related to the inoculum concentration.

Título en inglés: Influence of inoculum concentration on the cellulase and xylanase production by Aspergillus niger Resumen Existe un gran interés por el uso de enzimas lignocelulolíticas en varias industrias, y en la biodegradación de biomasa para la producción de biocombustibles y otras aplicaciones. Entre las fuentes microbianas de enzimas, Aspergillus niger es uno de los microorganismos más utilizados en la producción de enzimas industriales, debido a sus niveles altos de secreción de proteína y a su condición GRAS (generally regarded as safe). El objetivo del presente estudio fue evaluar la influencia de la concentración de inóculo en la morfología y producción de celulasas y xilanasas con A. niger en cultivo sumergido. Para ello, fueron inoculados matraces de 250 mL con 40 mL de medio con 3% (v/v) de una suspensión de 104 o 108 esporas por mililitro e incubados a 28 ºC y 175 rpm durante 120 horas. Se utilizaron 10 g*L-1 de lactosa como fuente de carbono. En cada caso se determinó la cantidad de biomasa, la proteína extracelular soluble, lactosa residual, actividad celulasa total y xilanasa cada 24 horas. Aunque no hubo un efecto notorio en la morfología de crecimiento, salvo en el color y el diámetro de pellets obtenidos, sí se afectó la µmax (0,06 y 0,03 h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) y la concentración máxima de biomasa. Además, mientras que las productividades volumétricas de celulasa (ΓFPA) (8,2 y 8,0 UI.*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente) fueron similares para ambos inóculos, la productividad de xilanasa (ΓXIL) fue mayor para el inóculo más concentrado (29,7 y 33,4 UI¨*L-1*h-1 para 104 y 108 esporas*mL-1, respectivamente). Los resultados indican que la productividad de celulasas y xilanasas está estrechamente relacionada con la concentración de inóculo. Palabras clave: celulasa; xilanasa; cultivo sumergido; morfología; Aspergillus niger. Abstract There is a great interest for the use of lignocellulolytic enzymes in several industries and in biomass degradation for production of biofuels and other applications. Among the microbial sources of enzymes, Aspergillus niger is one of the most used microorganisms in the production of industrial enzymes due to its high levels of protein secretion and its GRAS (generally regarded as safe) condition. The aim of the present study was to evaluate the influence of A. niger inoculum concentration in the morphology and production of cellulases and xylanases in submerged cultures. For this, 250 mL flasks containing 40 mL culture medium were inoculated with a 3% (v/v) of either 104 or 108 spores per milliliter suspension and incubated at 28 º C and 175 rpm during 120 hours. Lactose (10 g*L-1) was used as the carbon source. In each case, the amount of biomass, the extracellular soluble protein, residual lactose, total celullase activity and xylanase activity were determined every 24 hours. Even thought there was not a notorious effect on the growth morphology, except in color and diameter of pellets; µmax was affected (0.06 and 0.03 h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) as well as maximum biomass concentration. In addition, while the volumetric productivity of cellulase (8.2 and 8.0 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively) were similar for both inocula, the productivity of xylanase was greater for the more concentrated inoculum (29.7 and 33.4 UI*L-1*h-1 for 104 and 108 spores*mL-1, respectively).The results show that cellulase and xylanase productivities are closely related to the inoculum concentration. Key words: Cellulase; xylanase; submerged culture; morphology; Aspergillus niger.