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Highlights • Immunization with MERS spike protein nanoparticles induced only Th2-biased response. • Heterologous prime-boost immunization induced both Th1 and Th2-biased responses. • Our vaccination strategy showed the protective effect against MERS-CoV., The Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) is a highly pathogenic and zoonotic virus with a fatality rate in humans of over 35%. Although several vaccine candidates have been developed, there is still no clinically available vaccine for MERS-CoV. In this study, we developed two types of MERS-CoV vaccines: a recombinant adenovirus serotype 5 encoding the MERS-CoV spike gene (Ad5/MERS) and spike protein nanoparticles formulated with aluminum (alum) adjuvant. Next, we tested a heterologous prime–boost vaccine strategy, which compared priming with Ad5/MERS and boosting with spike protein nanoparticles and vice versa, with homologous prime–boost vaccination comprising priming and boosting with either spike protein nanoparticles or Ad5/MERS. Although both types of vaccine could induce specific immunoglobulin G against MERS-CoV, neutralizing antibodies against MERS-CoV were induced only by heterologous prime–boost immunization and homologous immunization with spike protein nanoparticles. Interestingly, Th1 cell activation was induced by immunization schedules including Ad5/MERS, but not by those including only spike protein nanoparticles. Heterologous prime–boost vaccination regimens including Ad5/MERS elicited simultaneous Th1 and Th2 responses, but homologous prime–boost regimens did not. Thus, heterologous prime–boost may induce longer-lasting immune responses against MERS-CoV because of an appropriate balance of Th1/Th2 responses. However, both heterologous prime–boost and homologous spike protein nanoparticles vaccinations could provide protection from MERS-CoV challenge in mice. Our results demonstrate that heterologous immunization by priming with Ad5/MERS and boosting with spike protein nanoparticles could be an efficient prophylactic strategy against MERS-CoV infection.

The NanoSight LM10 with Nanoparticle tracking analysis (NTA) software was evaluated for the quantification of latex particles, adenovirus 5, and influenza virus. The inter-day variability was determined by measuring the same sample over several consecutive days and the method’s accuracy was demonstrated by using known concentrations of the subject particles. NTA analysis was also used to quantify chromatographic fractions of adenovirus and influenza virus after purification on a CIM monolithic column. NTA results were compared and evaluated against hemagglutination (HA) and end point dilution assay, determining total and infection virus particle number, respectively. The results demonstrated that nanoparticle tracking analysis is a method for fast estimation of virus concentration in different samples. In addition, it can provide a better insight into the sample status, regarding the level of virus aggregation.

Trotz einer Vielzahl von Behandlungsstrategien wie Chirurgie, Bestrahlungs- und Chemotherapie ist die Prognose fuer Patienten mit Glioblastoma multiforme (GBM) derzeit sehr schlecht. Daher sind neue, verbesserte Behandlungsansätze dringend notwendig. Hierzu wurde in dieser Arbeit ein neu entwickelter, chimärer adenoviraler Vektor für die Behandlung von GBM getested. Der Vektor kombiniert verschiedene Aspekte, die die Behandlungsaussichten von malignen Erkrankungen mit Hilfe von viraler Therapie verbessern könnten. Hierzu zählt der Austausch der Wildtyp-Serotyp 5 (Ad5) Fiberproteine mit denen vom Serotyp 35 (Ad35). Ad35 Fiberproteine binden an humanen CD46 als Ligand, während Wildtyp Ad5 am Rezeptor CAR bindet. Der Rezeptor CAR ist auf Krebszellen meist unterrepresentiert. Zusätzlich hat der Vektor die Fähigkeit sich spezifisch in Tumorzellen zu replizieren. Dies geschieht durch die Deletion aller E1A und E1B Gene in Kombination mit dem Einsatz einer Expressionskassette, die nach tumorspezifischer homologer Rekombination aktiviert wird und die Transgene AdE1A und „TNF-related apoptosis inducing ligand“ (TRAIL) exprimiert. AdE1A ermöglicht effiziente intratumorale Produktion von neuen viralen Partikeln, während TRAIL die Fähigkeit besitzt, in Krebszellen Apoptose auszulösen. Zunächst haben wir die Oberflächenexpression von CD46 in den humanen GBM Zelllinien SF767, T98G und U-87 MG nachgewiesen, gefolgt vom Nachweis effizienter in vitro Infektion der Zellen mit dem Vektor Ad5.35.IR-E1A/TRAIL. Der Vektor löste stärkeres Zellsterben in allen Zellinien im Vergleich zum Wildtyp oder Ad5.35.IR-E1A ohne TRAIL aus. Analyse mittels TUNEL-Test verifizierte, dass Apoptose-Vermittlung tatsächlich der Auslöser der beobachteten Abtötung der Krebszellen ist. Untersuchung der onkolytischen Fähigkeiten von Ad5.35.IR-E1A/TRAIL in vivo mit Hilfe eines GBM Xenograft-Modells in NOD/SCID Mäusen zeigte signifikante Inhibition des Tumorwachstums. Detektion von adenoviralen Protein mit einem Antikörper, welcher gegen das Kapsidprotein gerichtet ist, zeigte effiziente virale Ausbreitung im Tumorgewebe. Bereiche in denen virale Kapside nachgewiesen werden konnten wurden ebenfalls mittels TUNEL-Färbung positiv auf Apoptose getestet. Dies legt Nahe, dass das Virus in der Lage ist, sich in vivo nach Applikation im Gewebe auszubreiten und Apoptose auszulösen. Intratumorale Injektion führte zu signifikanter Verminderung des soliden Tumorgewebes. Allerdings war dieser Effekt nur über einen kurzen Zeitraum zu beobachten. Es besteht die Möglichkeit das dies an einer behindertern intratumoralen Ausbreitung von neugebildeten viralen Partikeln liegt. Unsere Studie demonstriert, dass die Verwendung des viralen Vektors Ad5.35.IR-E1A/TRAIL eine neue onkolytische Behandlungsstrategie für humane GBM Tumore eröffnet. Des weitern schlagen wir Vektor-Modifikationen vor, die nötig sind um eine potentielle Therapie effektiver zu gestalten., Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive brain tumor, and patients rarely survive for more than 2 years. Gene therapy may offer new treatment options and improve the prognosis for patients with GBM. Adenovirus-mediated gene therapy strategies for brain tumors have been limited by inefficient gene transfer due to low expression of the adenovirus serotype 5 (Ad5) receptor. We have used an adenovirus vector that specifically replicates in tumor cells and uses an Ad5 capsid and the adenovirus serotype (Ad35) fiber for efficient infection of malignant tumor cells. This vector also expresses adenovirus E1A and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in a tumor-specific manner. Here, we show that this oncolytic vector (Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL) efficiently infects the GBM tumor cell lines SF767, T98G, and U-87 MG. Tumor cell killing was markedly enhanced with Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL compared with wild-type Ad5 and Ad35 virus or Ad5/Ad35.IR-E1A- vectors without TRAIL expression in vitro. In vivo experiments using s.c. xenografted U-87 MG cells in NOD/SCID mice showed a significant growth delay of tumors after i.t. injection of Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL, whereas adenovirus wild-type injections showed only marginal or no effect. Our findings indicate that the use of a capsid-modified adenoviral vector, in combination with TRAIL expression, is a promising novel approach for gene therapy of glioblastoma.

Conditionally replicating viruses are currently being investigated regarding applicability in cancer therapy with the aim to achieve specific, virus-mediated oncolysis. One promising oncolytic approach is based on the observation that activated Ras, which occurs in 30% of all malignant tumors, may interfere with the activity of PKR, a central kinase of the cell’s antiviral response. PKR-sensitive viruses should thereby be able to selectively replicate in Ras-transformed tumor cells, while sparing the surrounding tissue. Initial promising experiments using reovirus and vesicular stomatitis virus, which are naturally sensitive to PKR action, were followed by experiments with PKR-sensitive virus mutants, such as influenza virus dNS1 and herpes simplex virus R3616. Disadvantages of these approaches are lacking genetic accessibility on the one hand, and high pathogenicity of the parental viruses on the other. Adenoviruses, however, only cause mild respiratory disease and are widely used as well characterized tools in gene therapy. In this dissertation, we successfully transferred the principle of Ras-mediated oncolysis onto adenoviruses. PKR-sensitive adenoviruses (Ad dVA) were created through targeted mutation, and their selective replication could be confirmed in various Ras-transformed tumor cells. Mechanistic studies, however, raised doubts about a generalizable concept of Ras-dependent replication of oncolytic viruses. Once, mutated Ras was not able to directly interfere with PKR activity. In addition, we found adenoviruses to actively trigger Ras-dependent signaling pathways to ensure efficient translation. We thus suspect indirect effects of Ras-dependent transformation on PKR effector mechanisms to be responsible for increased permissiveness of Ras-mutated tumor cells towards PKR-sensitive adenoviruses. In accordance with this hypothesis, the susceptibility of Ad dVA-permissive cells to PKR-mediated apoptosis was markedly decreased. Our findings generally support the applicability of PKR-sensitive adenoviruses in virus-mediated oncolysis, but concomitantly emphasize the necessity to fully elucidate the underlying mechanisms., Konditional replizierende Viren werden derzeit hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit in der Krebstherapie untersucht, mit dem Ziel der spezifischen, Virus-vermittelten Onkolyse. Ein vielversprechender onkolytischer Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass aktiviertes Ras, wie es in 30 % aller malignen Tumoren vorkommt, möglicherweise die Aktivität der PKR, einer zentralen Kinase der wirtszelleigenen Virusabwehr, beeinträchtigt. Auf diese Weise könnten PKR-sensitive Viren selektiv in Ras-transformierten Tumorzellen replizieren, während das umliegende Gewebe verschont bleibt. Nach aussichtsreichen Versuchen mit Reoviren und Vesikulären Stomatitis Viren, die eine natürliche Sensitivität gegenüber der PKR-Wirkung besitzen, folgten Versuche mit PKR-sensitiven Virusmutanten, wie z. B. Influenza Virus dNS1 und Herpes Simplex Virus R3616. Nachteile all dieser onkolytischen Viren sind zum einen die schlechte genetische Manipulierbarkeit und zum anderen die hohe Pathogenität der Parentalviren. Adenoviren hingegen verursachen weitgehend ungefährliche Krankheiten und dienen als gut charakterisiertes System schon lange als Vektoren in der Gentherapie. In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, das Prinzip der Ras-abhängigen Onkolyse auf Adenoviren zu übertragen. Durch gezielte Mutationen konnten PKR-sensitive Adenoviren (Ad dVA) hergestellt werden, und ihre selektive Replikationsfähigkeit konnte in verschiedenen Ras-transformierten Tumorzellen bestätigt werden. Mechanistische Untersuchungen ließen allerdings Zweifel an der Allgemeingültigkeit des molekularen Konzepts der Ras-abhängigen Replikation onkolytischer Viren aufkommen. Zum einen war mutiertes Ras nicht in der Lage, direkt mit der PKR-Aktivität zu interferieren. Zum anderen aktivierten Adenoviren gezielt Ras-abhängige Signalwege, um eine effiziente Translation zu gewährleisten. Wir vermuten deshalb indirekte Einflüsse der Ras-abhängigen Transformation auf PKR-Effektor-mechanismen als Urache für die erhöhte Permissivität von Ras-mutierten Tumor-zellen für PKR-sensitive Viren. In Übereinstimmung damit war die Fähigkeit zur PKR-vermittelten Apoptose in Ad dVA-permissiven Zellen stark eingeschränkt. Unsere Ergebnisse befürworten grundsätzlich den Einsatz PKR-sensitiver Adenoviren in der Virus-vermittelten Onkolyse, unterstreichen aber zugleich die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen.

The efficiency of viruses in cancer therapy is enhanced by proteins that mediate the fusion of infected cells with their neighbors. It was reported that replication-competent adenovirus particles can spread between nuclei within fusion-generated syncytia. To assess this conjecture, we generated fusogenic adenoviruses that express a balanced ratio of the F and H glycoproteins of measles virus. The viruses displayed enhancedcytotoxicity but largely unchanged replication efficiencies compared to a nonfusogenic virus. Most notably, thevirus genomes did not spread through fusion-generated multinuclear cells. Hence, adenovirus replication insyncytia remains largely restricted to initially transduced nuclei., Adenovirus-Vektoren können zur Expression von Fusionsproteine eingesetzt werden, um neue Strategien zur Beseitigung maligner Tumoren zu entwickeln. Dazu ist zunächst zu klären, wie eine Fusion infizierter Zellen die Replikation und Zytotoxizität onkolytischer Adenoviren beeinflusst. Um diese Fragen zu beantworten, wurden in dieser Arbeit adenovirale Vektoren hergestellt (1st Generations-Vektoren), die beide Masernvirusproteine, F und H, gleichzeitig exprimieren. Die Infektion von permissiven Zellen mit diesen Vektoren verursacht die Erzeugung von Synzytien. Dabei bleibt die Replikation der Adenoviren im Kontext einer von der Fusion erhöhten Zytotoxizität ungestört, und die Expression von adenoviralen- und trans-Genen wurde von der Synzytienbildung nicht beeinträchtigt. Sowohl frühe als auch späte adenovirale Proteine wurden von allen Kernen eines Synzytiums importiert. Um eine mögliche Infektion benachbarter Kerne durch eine intrasynzytielle adenovirale Ausbreitung zu untersuchen, wurde eine FISH-Analyse mit adenoviralen DNA-Sonden durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass die Replikation während des Infektionsverlaufs nur in einem einzigen Kern des Synzytiums erfolgt. Die Anwendung des MLP-Promoters zur Expression von F- und H-Protein ermöglicht schließlich eine von der Replikation abhängige Expression der Fusionsproteine und somit eine selektive Steuerung der Zytotoxizität. Diese Arbeit zeigt, dass fusionsfähige Adenoviren zur Expression ihrer Genprodukte und zur Replikation ohne Einschränkung in der Lage sind. Ihre erhöhte Zytotoxizität kann dabei durch geeignete Wahl des Promoters auf Tumorzellen fokussiert werden. Zellfusion hat damit das Potenzial, onkolytische Adenoviren in ihrer Wirkung wesentlich zu verstärken.