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El complejo Pseudomonas syringae agrupa a un amplio número de cepas bacterianas patógenas de plantas clasificadas en más de 60 patovares y 10 especies, entre las que se encuentra Pseudomonas savastanoi. Esta bacteria induce la formación de tumores (crecimiento hiperplásico del tejido vegetal) o excrecencias en los tallos, ramas y, ocasionalmente, hojas y frutos de la planta. P. savastanoi se divide actualmente en cuatro patovares: pv. savastanoi (Psv), pv. nerii (Psn), pv. fraxini (Psf) y pv. retacarpa (Psr) corresponden con cepas aisladas de olivo, adelfa, fresno y retama, respectivamente. Además, se han aislado cepas de P. savastanoi patógenas en otros huéspedes como la dipladenia el mirto o el jazmín. La enfermedad causada por P. savastanoi en dipladenia se está expandiendo por el mundo y conlleva importantes pérdidas económicas en el mercado ornamental. Antes del comienzo de esta Tesis Doctoral se habían estudiado en detalle varios factores de virulencia de P. savastanoi. La producción de las fitohormonas ácido 3-indolacético y citoquininas, el sistema de secreción tipo III (T3SS) y su conjunto de efectores, el metabolismo del segundo mensajero di-GMPc, y el sistema de regulación por quorum sensing contribuyen a la virulencia de P. savastanoi. Además, otros factores como la degradación de compuestos aromáticos o la tolerancia a diversos estreses se identificaron siguiendo una estrategia genómica funcional. El análisis comparativo del genoma de Psv NCPPB 3335 con los genomas de otras cepas del complejo P. syringae aisladas de huéspedes herbáceos encontró varias regiones específicas del genoma de Psv NCPPB 3335. Una de ellas, denominada región WHOP (por las siglas en inglés de huéspedes leñosos y Pseudomonas), contiene genes probablemente relacionados con el metabolismo de compuestos aromáticos y, dentro del complejo P. syringae, sólo se ha encontrado en los genomas de cepas aisladas de huéspedes leñosos. Esta tesis doctoral se ha centrado en el análisis de factores que contribuyen a la virulencia y adaptación de P. savastanoi a sus huéspedes leñosos desde diversos puntos de vista. En primer lugar, se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de la región WHOP a varios niveles: organización, distribución, función y del papel en la virulencia y la adaptación de Psv NCPPB 3335. En segundo lugar, se han identificado los genes regulados por quorum sensing en Psv NCPPB 3335, así como establecido diferencias en los sistemas de regulación por quorum sensing entre cepas del complejo P. syringae. Finalmente, se han aislado por primera vez en España cepas de P. savastanoi patógenas de dipladenia (Psd) y se ha caracterizado fenotípicamente un conjunto de Psd aisladas en todos los países donde se ha descrito la enfermedad. Los resultados más relevantes obtenidos durante la Tesis Doctoral del solicitante fueron los siguientes: i) la región WHOP está presente en bacterias del complejo P. syringae aisladas de órganos leñosos y ausente en cepas aisladas de órganos no leñosos, excepto P. syringae pv. actinidifoliorum y P. syringae pv. ciccaronei; ii) la región WHOP de Psv NCPPB 3335 se organiza en cuatro operones (catBCA, antABC, ipoABC y dhoAB) y tres genes transcritos individualmente (antR, PSA3335_3206 y benR), de los cuales los operones antABC y catBCA están implicados en el catabolismo de antranilato y catecol, respectivamente, y el operón ipoABC confiere actividad oxigenasa sobre compuestos aromáticos; iii) los operones antABC, catBCA e ipoABC contribuyen a la virulencia de Psv NCPPB 3335 en plantas de olivo leñosas, mientras que mutantes individuales en los operones catBCA y dhoAB y el gen PSA3335_3206 presentan una desventaja en crecimiento competitivo frente a Psv NCPPB 3335; iv) cepas del complejo P. syringae contienen un número variable de homólogos a los genes luxI y luxR; v) la transcripción de doce genes regulados por quorum sensing en P. syringae pv. tabaci es independiente de PssI (homólogo a LuxI) en Psv NCPPB 3335; vi) la producción de exopolisacáridos, la formación de biofilms, la movilidad y la virulencia no están alteradas en mutantes de quorum sensing de Psv NCPPB 3335; vii) P. savastanoi es el agente causal del moteado de hojas y tallos en dipladenia en España; viii) cepas de P. savastanoi aisladas de dipladenia están filogenéticamente relacionadas con cepas de P. savastanoi pv. nerii (aisladas de adelfa) y tienen un rango de huésped diferente al de los cuatro patovares establecidos de P. savastanoi; ix) P. savastanoi Ph3 (cepa aislada de dipladenia en Francia) puede migrar en plantas de dipladenia causando una infección sistémica y, ocasionalmente, la marchitez de la planta., 2019-07-25

Los efectores (T3E) del sistema de secreción tipo III (T3SS) son factores de virulencia esenciales en la interacción de bacterias fitopatógenas con sus hospedadores, debido a que: (i) promueven la penetración y permanencia del patógeno en el tejido del hospedador, (ii) interfieren con las respuestas de defensa de las plantas y (iii) facilitan el acceso a los nutrientes, promoviendo la proliferación y el crecimiento del patógeno (Gohre and Robatzek, 2008). La secuenciación y análisis de los genomas de diferentes cepas pertenecientes al complejo Pseudomonas syringae, ha permitido identificar el catálogo de T3E hipotéticos de cada una de ellas, así como clasificarlos en más de 60 familias génicas que constituyen el pangenoma de este relevante complejo de bacterias fitopatógenas (http://www.pseudomonassyringae.org/) (Baltrus et al., 2011; Lindeberg et al., 2012). Aunque la función concreta de la mayoría de los T3E identificados hasta la fecha en la interferencia con los mecanismos de defensa de la planta es aún desconocida, durante los últimos años se han producido grandes avances en el conocimiento del papel de los T3E del complejo P. syringae durante la interacción con plantas herbáceas. Estudios recientes, han establecido a Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 como una cepa modelo en el estudio de la interacción de este complejo bacteriano con plantas leñosas (Ramos et al., 2012). El análisis bioinformático del borrador del genoma de esta cepa identificó 33 posibles T3E (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010; Ramos et al., 2012), cuya translocación a través del T3SS se demostró para 7 de ellos (AvrRpm2, HopA1, HopAA1, HopAZ1, HopBK1, HopBL1 y HopBL2) durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral (Matas et al., 2014). Además, la secuenciación de los tres plásmidos de esta cepa reveló que los genes codificantes de los T3E HopAF1 y HopAO1 se localizan en los plásmidos pPsv48A y pPsv48B, respectivamente, codificándose en el cromosoma un homólogo de HopAF1 (HopAF1-2). Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo principal que se planteó en esta Tesis Doctoral fue el análisis funcional de los T3E de NCPPB 3335, prestando mayor atención a las familias HopAF y HopAO. Para llevar a cabo este objetivo general, se plantearon los siguientes abordajes: 1) estudiar la distribución de los efectores de las familias HopAF y HopAO en los patovares de P. savastanoi y P. syringae, 2) analizar la translocación a través del T3SS de NCPPB 3335 y el papel en virulencia de los efectores de las familias HopAF y HopAO y, 3) analizar la interacción con los sistemas de defensa de la planta de los siete efectores de NCPPB 3335 cuya translocación a través del sistema de secreción tipo III ha sido demostrada, así como de los pertenecientes a las familias HopAF y HopAO. El análisis bioinformático y filogenético de las familias HopAF y HopAO permitió identificar que ambas se encuentran ampliamente distribuidas dentro del complejo P. syringae, si bien, P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 codifica dos genes de la familia hopAO (hopAO1 y hopAO2) y tres genes de la familia hopAF (dos copias del gen hopAF1 y una del gen hopAF1-2). La filogenia de esta última familia reveló que el alelo hopAF1 se codifica mayoritariamente en cepas patógenas de plantas leñosas. Análisis de translocación y transcripcionales validaron a los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 como nuevos T3E del secretoma del T3SS de NCPPB 3335. Por otra parte, en este trabajo hemos demostrado que tanto los T3E AvrRpm2, HopBK1, HopBL1, HopBL2, HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2, así como los efectores truncados HopAA1 y HopAZ1, interfieren con la respuesta de defensa primaria (PTI) de Nicotiana tabacum. Además, presentamos evidencias de que HopAZ1, HopBL1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 también inhiben la inmunidad mediada por efectores (ETI) en este mismo hospedador. Por otro lado, y utilizando fusiones traduccionales a la proteína verde fluorescente (GFP), hemos podido comprobar que los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 se localizan en la membrana plasmática de las células de Nicotiana benthamiana, así como que HopAO2 también se localiza en vesículas del aparato de Golgi. Con el fin de averiguar el papel de los T3E HopAF1 y HopAO1 en la virulencia de NCPPB 3335 se construyeron mutantes simples de los mismos. La deleción del gen hopAF1 del plásmido pPsv48A en NCPPB 3335 tuvo como consecuencia una ligera reducción en el tamaño de los tumores inducidos por este patógeno en plantas de olivo lignificadas, mientras que la deleción del gen hopAO1 conllevó una clara disminución de la virulencia del mismo. Los resultados incluidos en esta Tesis Doctoral, convierten a NCPPB 3335 en la cuarta cepa del complejo P. syringae cuyo secretoma del T3SS incluye un mayor número de T3E demostrados, y en la primera cepa aislada de un hospedador leñoso.

En la actualidad, el empleo de agentes de biocontrol con comportamientos micofágicos se presenta como un mecanismo de biocontrol alternativo, ya que estos agentes bacterianos pueden interferir con el crecimiento y desarrollo del hongo, mientras se alimentan de él (Pliego et al., 2011b). En este sentido, el principal objetivo que se ha perseguido en este trabajo de Tesis Doctoral consistió en determinar los genes del agente de biocontrol Pseudomonas pseudoalcaligenes AVO110 implicados en la micofagia del hongo fitopátogeno Rosellinia necatrix, con el propósito de profundizar en los mecanismos de biocontrol de esta cepa empleados en el control biológico de la podredumbre blanca radicular del aguacate. Para ello, se continuo el proceso de selección de mutantes GAM (Growth Attenuated Mutants) iniciado por Pliego (2008a), empleando la tecnología STM en el análisis de la capacidad de los mismos de multiplicarse y sobrevivir en medio BM suplementado con exudado de R. necatrix (Pliego et al., 2008b). El proceso finalizó con la selección de 19 mutantes GAM, que junto con los 7 mutantes seleccionados previamente por Pliego (2008a), suman un total de 26 mutantes. La mayor parte de las funciones identificadas utilizando un primer borrador del genoma de la cepa AVO110, estuvieron dirigidas a satisfacer una serie de requerimientos nutricionales y energéticos relacionadas con la biosíntesis de los aminoácidos glutamato (GAM-9: gltB; operón gltBD) y leucina (GAM-12/GAM-21: leuC; operón leuCD), la degradación de los aminoácidos fenilalanina y tirosina (GAM-5: hmgB), la degradación (GAM-17: fadD; GAM-11: fadE) y asimilación de ácidos grasos (GAM-10: aceA), la producción de sideróforos (GAM-19: micro-ARN), la biosíntesis de purinas (GAM-18: purB), la quimiotaxis hacia los componentes del exudado fúngico (GAM-3:PAS-GGDEF-EAL; posible operón con los genes che implicados en quimiotaxis), el funcionamiento de un sistema de transporte de nutrientes activo (GAM-6: dppA; operón dpp), así como la capacidad de regular las concentraciones celulares de nitrógeno (GAM-8: ntrB; operón ntrBC). En cambio, otras funciones estuvieron relacionadas con la resistencia a distintos tipos de estrés, tanto de tipo osmótico (GAM-14: kefA; operon kefA-cvrA), como aquellos provocados por ciertos compuestos tóxicos presentes en el exudado de R. necatrix, tales como compuestos aromáticos (GAM-25: pcaC ; GAM-15/GAM-24: colS; operón colRS), agentes antioxidantes (GAM-20: copR; operón copRS), así como agentes antimicrobianos (GAM-26: algQ; GAM-3: PAS-GGDEFF-EAL; GAM-4: peptidasa M23; GAM-2:enterotoxinas termolábil). Por último, el funcionamiento de sistemas de recombinación homóloga (GAM-16/GAM-22: recB; operón recBCD), así como un maquinaria activa en la producción de proteínas mediante ribosomas funcionales (GAM-23: dbpA) y proteínas asociadas a los mismos (rflA), resultaron de especial relevancia para la cepa AVO110 en la adaptación de esta bacteria en el exudado de R. necatrix. Por otra parte, el borrador de la cepa AVO110 permitió realizar un análisis filogenético de genes esenciales mostrando que, a diferencia de otros agentes de biocontrol, la cepa AVO110 mostró una mayor relación evolutiva con especies pertenecientes al grupo P. oleovorans. Finalmente, se analizó el papel de las funciones afectadas en los mutantes GAM-2, GAM-3, GAM-4, GAM-19, GAM-22, GAM-24 y GAM-26 en determinados rasgos relacionados con la competencia rizosférica y fúngica de este agente de biocontrol. En este sentido, el gen algQ (GAM-26) está implicado en la formación de biopelículas por esta bacteria, así como en la colonización de las hifas de R. necatrix y la raíz de plantas de aguacate. Por otro lado, los genes colS (GAM-24) y recB (GAM-22), así como las secuencias codificantes de un micro-ARN implicado en la regulación de la producción de sideróforos (GAM-19) y de una posible peptidasa M23 (GAM-24), están implicados en la colonización del micelio de R. necatrix y de la superficie de la raíz de plantas de aguacate. Por último, la posible proteína con dominios PAS-GGDEF-EAL afectada en el mutante GAM-3 está implicada en la formación de biopelículas, así como en la colonización de la raíz de plantas de aguacate. BIBLIOGRAFÍA Pliego, C. (2008a). Multitrophic interactions involved in biological control of avocado white root rot caused by Rosellinia necatrix. PhD Thesis. University of Málaga. Pliego, C., De Weert, S., Lamers, G., De Vicente, A., Bloemberg, G., Cazorla, F., Ramos, C. (2008b). Two similar enhanced root-colonizing Pseudomonas strains differ largely in their colonization strategies of avocado roots and Rosellinia necatrix hyphae. Environmental Microbiology, 10: 3295-3304. Pliego, C., Ramos, C., De Vicente, A., Cazorla, F. (2011b). Screening for candidate bacterial biocontrol agents against soilborne fungal plant pathogens. Plant and Soil, 340: 505-520. 2018-05-05