Search

Nüklear laminler, tip V ara filament proteinleridir ve nukleusa mekanik destek sağlamakla birlikte, kromatin organizasyonu, gen regülasyonu, DNA hasarı ve onarımı, DNA replikasyonu ve sinyal iletimi gibi pek çok hücresel olayda rol oynarlar. Laminlerin en dikkat çekici özelliği ise mitoz bölünme boyunca geriye dönüşümlü olarak ayrılıp birleşmeleridir. Mitoz bölünmenin profaz safhasında laminlerin fosforillenerek ayrıldığı ve geç telofaz safhasında defosforillenerek birleştiği bilinmektedir. Ancak hücre döngüsü boyunca lamin proteinlerinin fosforilasyon dışında bir modifikasyona uğrayıp uğramadığı bilinmemektedir. Bir post-translasyonel modifikasyon olan glikozilasyon, proteinlerin termodinamik, kinetik ve yapısal özelliklerini değiştirerek proteinlerin çevresiyle olan etkileşimini düzenlemektedir. Özellikle nükleositoplazmik proteinlerde O-GlcNAclasyon ve fosforilasyonun proteinin aynı Ser/Thr amino asitleri için yarışmalı olduğu ve bu iki modifikasyonun tersinir olarak aktivite gösterip proteinlerin inaktif veya aktif duruma geçmelerinde rol oynadığı bilinmektedir. Bu bilgilerden hareketle bu tez çalışmasında bu iki modifikasyonun tersinir olarak veya birlikte işlev göstererek hücre döngüsünde lamin A/C proteininin yapısal organizasyonunu düzenliyor olabileceği hipotezi öne sürülmüştür. Bu hipotez doğrultusunda tezin birinci amacı biyoinformatik araçlar kullanılarak insan lamin A/C proteininin olası O-GlcNAc ve O-GalNAc modifikasyonlarını pozisyon spesifik olarak belirlemek ve 3D glikoprotein yapısını oluşturmaktır. İkinci amacı ise hücre döngüsünün G2/M ve S fazlarında senkronize edilmiş A549 akciğer karsinoma hücrelerinde lamin A/C proteininin glikan birimlerini ve fazlar arasındaki glikan değişikliklerini deneysel olarak belirlemektir. Bu amaçla, insan lamin A/C proteininin olası glikozilasyon pozisyonlarının belirlenebilmesi için yüzey alanı, sekonder yapı, hidropati, yüzey ve sıvı erişilebilirliği analizleri gerçekleştirilmiş ve 3D glikoprotein yapısı oluşturulmuştur. Deneysel çalışmalar kapsamında ise hücrelerin doğru bir şekilde senkronize olduğu belirlendikten sonra lektin blotlama ile proteinin uç monosakkaritleri belirlenmiş ve glikozillenmiş lamin A/C proteininin hücredeki lokalizasyonu altın işaretli antikor ve lektinler kullanılarak TEM'de incelenmiştir. Ek olarak, her iki fazda da lamin A/C proteini immünopresipitasyonla saf olarak elde edilip monosakkarit birimleri Cap-LC-ESI/MS-MS ile analiz edilmiştir. Biyoinformatik analizler sonucunda lamin A/C proteininin Ser392'de O-α-GlcNAc, Ser395'de O-β-GlcNAc ve Thr505'de O-GalNAc glikozilasyon modifikasyonları gösterdiği belirlenmiştir. Deneysel veriler göz önüne alındığında, G2/M ve S fazlarında senkronize edilmiş akciğer karsinoma hücrelerinde lamin A/C proteininin her iki fazda da O-GlcNAc, O-GalNAc, galaktoz, mannoz, fukoz ve sialik asit taşıdığı belirlenmiştir. Biyoinformatik analizler sonucunda proteinin N-glikozilasyon pozisyonu taşımadığı belirlendiğinden bu şekerlerin varlığı O-glikozilasyon ile ilişkilendirilmiştir. Bu bulgulara dayanarak lamin A/C'nin O-GlcNAc modifikasyonu ve kor 1 tip O-glikan yapısı üzerinde Sia, Fuc, Man ve O-GalNAc modifikasyonlarını gösteren bir glikoprotein olduğu ortaya konmuştur. TEM çalışmalarıyla ise glikozillenmiş lamin A/C proteininin G2/M fazında nükleoplazmada, S fazında ise nukleus kılıfında ve nükleoplazmada lokalize olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması ile ilk kez hücre döngüsünün interfaz ve mitoz fazlarında lamin A/C proteininin fosforilasyon dışında bir modifikasyon gösterdiği belirlenmiştir. İnterfaz ve mitoz fazlarının her ikisinde de glikozilasyon modifikasyonunun belirlenmesi, lamin A/C proteininin ayrılıp-yeniden birleşmesinde glikozilasyonun, fosforilasyon ile birlikte bir post-translasyonel kod oluşturarak hücre döngüsünün düzenlenmesinde rol aldığını düşündürmektedir. Anahtar sözcükler: Lamin A/C, Glikan, Monosakkarit, A549 hücreleri, İmmünopresipitasyon, CapLC-ESI/MS-MS, TEM, Nuclear lamins are type V intermediate filament proteins that play several roles in many cellular events such as chromatin organization, gene regulation, DNA damage and repair, DNA replication and signal transduction besides providing mechanical support to the nucleus. The most striking feature of the lamins is that their reversible assembly and disassembly during mitosis. In prophase, phosphorylation of lamins triggers the nuclear envelope disassembly and in late telophase, dephosphorylation of lamins reverses the process. However, it hasn't been known whether lamin proteins undergo a modification other than phosphorylation throughout the cell cycle. The post-translational modification, glycosylation, regulates the interaction of proteins with their environment by altering the thermodynamic, kinetic, and structural properties of proteins. It has been known that especially in nucleocytoplasmic proteins, O-GlcNAcylation and phosphorylation are competing for the same Ser/Thr residues of the protein, and the interplay between two modification regulates the activation/inactivation of the protein. Based on this information, in this thesis, we hypothesized that these two modifications may function cooperatively or reversibly to organize the structural organization of the lamin A/C protein during cell cycle. Thus, the first aim of the study is to determine possible O-GlcNAcylated and O-GalNAcylated positions and to generate 3D glycoprotein structure of human lamin A/C protein using bioinformatics tools. The second aim of the study is to analyze experimentally the glycan units of lamin A/C protein and the glycan changes between the phases in A549 lung carcinoma cells synchronized at G2/M and S phases of the cell cycle. For this purpose, in order to determine possible glycosylation positions of human lamin A/C protein, surface area, secondary structure, hydropathy, surface and solvent accessibility analyzes were performed and the 3D glycoprotein structure was generated. Within the scope of the experimental studies, following the synchronization of the cells, the outermost end monosaccharide units of the protein was identified by lectin blotting and glycosylated lamin A/C protein localization in the cell was examined with TEM using colloidal gold conjugated antibody and lectins. In addition, lamin A/C protein was immunoprecipitated and monosaccharide units were analyzed further by Cap-LC-ESI/MS-MS in both two phases. As a result of bioinformatics analysis, lamin A/C protein showed O-α-GlcNAcylation at Ser392, O-β-GlcNAcylation at Ser395, and O-GalNAcylation at Thr505 residues. Considering the experimental data, lamin A/C protein was found to be contain O-GlcNAc, O-GalNAc, galactose, mannose, fucose, and sialic acid in lung carcinoma cells synchronized at G2/M and S phases. Since it was determined with bioinformatics analysis that the protein does not contain N-glycosylation position, the presence of these sugars has been associated with O-glycosylation. Based on these findings, it was demonstrated that lamin A/C is a glycoprotein showing O-GlcNAc modification and Sia, Fuc, Man and O-GalNAc modifications on core 1 type O-glycan structure. TEM studies showed that glycosylated lamin A/C protein is localized in nucleoplasm at G2/M phase and in nuclear envelope and nucleoplasm at S phase. As a result, it is determined for the first time with this thesis that the lamin A/C protein shows a modification other than phosphorylation in interphase and mitosis phases of the cell cycle. The determination of glycosylation modification in both interphase and mitosis suggests that glycosylation plays a role in the regulation of the cell cycle by forming a post-translational code with phosphorylation in assembly and disassembly of the lamin A/C protein during the cell cycle. Keywords: Lamin A/C, Glycan, Monosaccharide, A549 cells, Immunoprecipitation, CapLC-ESI/MS-MS, TEM

Transkripsiyon; prokaryotik ve ökaryotik tüm canlılarda gerçekleşen, canlılığın evrensel ve kilit bir mekanizmasıdır. Ökaryotik canlıların tamamında trankripsiyonun gerçekleşmesinde, RNA Polimeraz II enzimi ve onunla etkileşen genel tranksripsiyon faktörleri rol oynamaktadır. Bu proteinlerden TFIIB, transkripsiyonun başlaması aşamasında üç yapı ile etkileşime girer. Bunlar; TATA'ya bağlanan protein'in tek ucu; TATA kutusunu izleyen GC zengin DNA dizisi ve RNA polimeraz II'nin C-terminal domaini kuyruğudur. RNA Polimeraz II'nin bir glikoprotein olduğu ve transkripsiyonun başlama aşaması sırasında C-terminal domaininde O-GlcNAc şekerini taşıdığı bilinmektedir. Fakat, RNA polimeraz II ile etkileşime giren transkripsiyon faktörü TFIIB'nin bir glikoprotein olup olmadığı ve bu etkileşimlerinde glikanların rolü ile ilgili bilinenler oldukça sınırlıdır. Bu nedenle çalışmanın amacı; nukleus proteinlerinden TFIIB transkripsiyon faktörünün olası glikozilasyon (N- ve O-bağlı glikozilasyonlar) noktalarını, çeşitli omurgasız ve omurgalı türlerinde biyoinformatik yöntemlerle belirlemek ve türler arasında korunmuş/farklılaşmış amino asit dizileri ile bunların olası glikozilasyon profilini ortaya koyarak elde edilecek bilgilerden hareketle, model organizma denizkestanesi Paracentrotus lividus'ta TFIIB'nin olası glikozilasyon profillerini (N- ve/veya O-) western blot/lektin blot yöntemleri ve TEM ile deneysel olarak ortaya koymaktır. Bu amaçla biyoinformatik çalışmalarda kullanılmak üzere; denizkestanesi Strongylocentrotus purpuratus, balık Oryzias latipes, kurbağa Xenopus laevis, sıçan Rattus norvegicus, fare Mus musculus, sığır Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii ve insan Homo sapiens'e ait TFIIB amino asit dizilerinden yararlanılmıştır. Biyoinformatik veritabanları ve sunucuları kullanılarak her türün TFIIB proteininin sekonder ve üç boyutlu yapı tahminleri oluşturulmuş, potansiyel glikozilasyon pozisyonları belirlenerek doğruluk analizleri yapılmış ve ilgili pozisyonlar proteinin yapısı üzerinde görüntülendirilmiştir. Deneysel çalışmalarda ise denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan yumurta hücreleri kullanılmış, elde edilen nuklear ekstrakt kullanılarak western/ lektin blotlama ve TEM ile immün/lektin işaretleme yapılmıştır. Biyoinformatik çalışmalar sonucunda, denizkestanesi ve kurbağa türlerine ait TFIIB proteininin N-bağlı glikozilasyon noktalarına sahip olduğu belirlenmiş, ayrıca çalışılan türlerin TFIIB proteininde musin tip O-bağlı glikozilasyon, O-α-GlcNAclasyon, O-β-GlcNAclasyon ve ying-yang pozisyonları da belirlenmiştir. Buna ek olarak, sekonder ve üç boyutlu yapı tahminlerinde, omurgasızlardan omurgalılara gidildikçe proteinin yapısal bir değişim gösterdiği bulunmuştur. Lektin blotlama sonucunda TFIIB proteininde, N-asetilglukozamin, Galaktoz, Mannoz ve α2-3 bağlı Sialik asit uç glikan birimleri olarak belirlenmiştir. TEM'de sialik asitlere yönelik yapılan lektin işaretlemede ise, α2-3 ve α2-6 bağlı sialik asitlerin TFIIB proteininde bulunduğu belirlenmiştir. Elde edilen bulgularla, TFIIB transkripsiyon faktörünün bir glikoprotein olduğu ilk kez belirlenmiştir. Ayrıca nukleositoplazmik proteinlerin O-GlcNAc modifikasyonunun yanında, O- ve/veya N- bağlı glikozilasyon modifikasyonlarını da gösterdiği/gösterebileceği belirlenmiştir. Bu bulgu ile nukleositoplazmik proteinlerin glikozilasyonuna yeni bir bakış açısı kazandırılmış ve glikobiyoloji alanına yeni bir araştırma sorusu sorulmuştur. Böylece, moleküler biyolojinin klasik bakış açısına farklı bir yaklaşım ile alternatif sunulmuştur. Bütün bunlara ek olarak bu çalışmada, TEM'de kullanılmak üzere, kesit alınmaksızın doğrudan grid üzerine uygulama yapılarak oluşturulan, son derece pratik ve yeni bir yöntem tarafımızca geliştirilmiş ve ilk kez bu tez çalışmasında kullanılmıştır., Transcription is the universal and key mechanism of life that occurs in all prokaryotes and eukaryotes. RNA polymerase II and transcription factors that interact with it are involved in transcription of all eukaryotic organism. Transcription factor TFIIB interacts with three structures at the initiation stage of transcription: the single end of TATA binding protein, TATA box followed by GC-rich DNA sequence, and C-terminal domain tail of RNA polymerase II. It has been known that RNA polymerase II is a glycoprotein and it contains O-GlcNAc sugar in the C-terminal domain at the initiation stage of transcription. However, it is not clear whether the transcription factor TFIIB interacting with RNA polymerase II is a glycoprotein or not. Also, data concerning the role of glycans in this interaction is quite limited. Thus, the first aim of the study is to determine the potential glycosylation positions (N- and O-linked glycosylation) of transcription factor TFIIB of nucleus proteins in various invertebrate and vertebrate species and to reveal conserved/differentiated amino acid sequences as well as their potential glycosylation profile amongst the species via bioinformatics. Taking into account the data obtained from bioinformatics, the second aim of the study is to determine experimentally of the potential glycosylation profiles (N- and/or O-) of TFIIB in the model organism sea urchin Paracentrotus lividus by using western/lectin blotting methods and TEM. For this purpose, TFIIB amino acid sequences of sea urchin Strongylocentrotus purpuratus, fish Oryzias latipes, frog Xenopus laevis, rat Rattusnorvegicus, mouse Mus musculus, bovine Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii, and human Homo sapiens were used in bioinformatic studies. The construction of the secondary and three dimensional structure predictions of TFIIB protein, determination of the potential glycosylation positions and their accuracy analyzes, and the visualization of the relevant positions on the protein structure were performed using bioinformatic databases and servers. In experimental studies, egg cells from mature individuals of sea urchin P. lividus were used and western/lectin blotting and immune/lectin labelling by TEM were performed using the nuclear extract obtained. In addition to the determination of mucin type O-linked glycosylation, O-α-GlcNAcylation, O-β-GlcNAcylation, and ying-yang positions in the TFIIB protein of all studied species, N-linked glycosylation positions were also found in the TFIIB protein of sea urchin and frog as a result of bioinformatic studies. Furthermore, in the secondary and three dimensional structure predictions, changing in the protein structure from invertebrates to vertebrates was found. N-acetylglucosamine, Galactose, Mannose, and α2-3 linked Sialic acid were determined as a terminal glycan unit of the TFIIB protein in lectin blotting. The presence of α2-3 and α2-6 linked sialic acids in the TFIIB protein were found by using lectin labelling against sialic acids in TEM. With the findings obtained, it has been demonstrated for the first time that transcription factor TFIIB is a glycoprotein. It has also been determined that nucleocytoplasmic proteins may exhibit O- and/or N-linked glycosylation modifications as well as O-GlcNAc modification. With this finding, a new approach has been adopted to the glycosylation of nucleocytoplasmic proteins and prompted a new research question in the field of glycobiology. Thus, an alternative approach is presented for the classical viewpoint of molecular biology. Furthermore, a very practical and new method has been developed by us applying directly on the grid without sectioning in order to be used in TEM and used for the first time in this thesis.