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Escherichia coli O157:H7 e Salmonella spp. são dois dos mais importantes microrganismos causadores de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) no mundo. Nos últimos anos, o Brasil vem liderando as exportações mundiais de carne bovina e avícola, alimentos que podem ser veículos destes patógenos. Antes da exportação, esses alimentos devem ser testados para garantir a ausência dos microrganismos citados e, quanto menor for o tempo de análise, maior é a vantagem competitiva das empresas exportadoras. Neste estudo, foram avaliados dois novos ensaios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em alimentos. PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay são métodos baseados no uso de bacteriófagos recombinantes, capazes de detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em tempos menores que outros métodos. Até o presente estudo, esses kits não haviam sido testados para a detecção de cepas brasileiras. Logo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a especificidade, limite de detecção e sensibilidade dos kits PhageDx E. coli O157:H7 Assay e PhageDx Salmonella Assay em detectar E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil. Primeiramente, realizou-se o teste de inclusividade com 55 isolados de Salmonella spp. e 14 isolados de E. coli O157:H7. Em seguida, foi determinado o limite de detecção in vitro dos kits. Para isto, três concentrações diferentes (1, 10 e 100 UFC/poço de microplaca) dos microrganismos avaliados foram submetidas a 2 h de infecção fágica a 37 ºC. A terceira etapa deste trabalho foi determinar o limite de detecção dos kits em alimentos. Para o kit PhageDx Salmonella Assay, inoculou-se 1 mL do coquetel de Salmonella spp. (concentrações de 1, 10 e 100 UFC) em 25 g de alface, peito de frango, salsicha de frango, patê de frango e nuggets. Em seguida, as amostras foram acrescidas de 75 mL de água peptonada tamponada e enriquecidas a 41 º C por 7 h antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Utilizando a mesma metodologia mencionada acima, testou-se o kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay. Neste teste, 1 mL do coquetel de E. coli O157:H7 nas mesmas concentrações, foi adicionado a 25 g de carne moída e alface, e a 25 mL de leite pasteurizado e água mineral. Posteriormente, caldo triptona de soja foi adicionado às amostras e a mistura foi incubada por 5 h a 41 º C antes de serem submetidas à 2 h de infecção fágica a 37 ºC. Além disso, o PhageDx E. coli O157:H7 Assay teve seu desempenho comparado a um kit de PCR em tempo real para pesquisa de E. coli O157:H7 e Escherichia coli enterohemorrágicas, respectivamente, em carcaças bovinas. Com relação aos resultados obtidos, verificou-se que todos os isolados testados foram identificados pelo seu respectivo kit e o limite de detecção in vitro foi de 100 UFC/poço, em apenas 2 h, ou seja, sem enriquecimento das amostras. Os kits também foram capazes de detectar 1 UFC dos patógenos em 25 g (ou 25 mL) de alimentos, após 5 e 7 horas de enriquecimento, para E. coli O157:H7 e Salmonella spp., respectivamente. Apenas a detecção de Salmonella spp. em alface apresentou um limite de detecção ligeiramente superior aos demais alimentos, isso é, 10 UFC/25 g. O kit PhageDx E. coli O157:H7 Assay não detectou a presença E. coli O157:H7 em nenhuma das 100 carcaças bovinas avaliadas. Em concordância com este resultado, o kit de PCR em tempo real não detectou a presença de E. coli enterohemorrágica. Os ensaios avaliados demonstraram ser satisfatórios para detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. isoladas no Brasil, apresentando sensibilidade, especificidade e rapidez ao avaliarem diferentes matrizes alimentares. A detecção de uma única célula de Salmonella spp. em 25 g de amostra, após aproximadamente 9 h de ensaio, representa uma redução significativa de tempo em comparação aos métodos tradicionais e rápidos disponíveis atualmente no mercado. O mesmo foi observado para o kit de Escherichia coli O157:H7, cujo tempo de análise foi de cerca de 7 h. Além disso, os kits demonstraram ser fáceis de executar, tornando-os ferramentas promissoras para a detecção de E. coli O157:H7 e Salmonella spp. em diferentes alimentos. Escherichia coli O157:H7 and Salmonella spp. are two of the most important microorganisms causing Foodborne Diseases (FD) in the world. In recent years, Brazil has been leading world exports of beef and poultry, foods that can be vehicles for these pathogens. Before exportation, these foods must be tested to ensure the absence of the microorganisms cited, and the shorter the time of analysis, the greater the competitive advantage of exporting companies. In this study, two new assays for detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in food were evaluated. PhageDx E. coli O157:H7 Assay and PhageDx Salmonella Assay are methods consisting of recombinant bacteriophages, capable of detecting E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in shorter times than other methods. Until the present study, these kits had not been tested for the detection of Brazilian strains. Therefore, the objective of this study was to evaluate the specificity, limit of detection and sensitivity of PhageDx E. coli O157:H7 Assay and PhageDx Salmonella Assay in detecting E. coli O157:H7 and Salmonella spp. isolated in Brazil. First, an inclusivity test was performed with 55 isolates of Salmonella spp. and 14 isolates of E. coli O157:H7. Next, the in vitro detection limit of the kits was determined. For this, three different concentrations (1, 10 and 100 CFU/microplate well) of the evaluated microorganisms were submitted to 2 h of phage infection at 37 ºC. The third step of this work was to determine the detection limit of the kits in food. For the PhageDx Salmonella Assay kit, 1 mL of the Salmonella spp. (concentrations of 1, 10, and 100 CFU) was inoculated into 25 g of lettuce, chicken breast, chicken sausage, chicken pâté, and nuggets. The samples were then added to 75 mL of buffered peptone water and enriched at 41 °C for 7 h before being submitted to 2 h of phage infection at 37 °C. Using the same methodology as mentioned above, the PhageDx E. coli O157:H7 Assay kit was tested. In this test, 1 mL of the E. coli O157:H7 cocktail at the same concentrations was added to 25 g of ground beef and lettuce, and to 25 mL of pasteurized milk and mineral water. Subsequently, tryptone soy broth was added to the samples and the mixture was incubated for 5 h at 41 ºC before being submitted to 2 h of phage infection at 37 ºC. In addition, the PhageDx E. coli O157:H7 Assay performance was compared to a real-time PCR kit to screen for E. coli O157:H7 in bovine carcasses. Regarding the results obtained, it was verified that all isolates tested were identified by their respective kit and the in vitro detection limit was 100 CFU/well, in only 2 h, that is, without enrichment of the samples. The kits were also capable of detecting 1 CFU of the pathogens in 25 g (or 25 mL) of food, after 5 and 7 hours of enrichment, for E. coli O157:H7 and Salmonella spp., respectively. Only the detection of Salmonella spp. in lettuce had a slightly higher detection limit than the other foods, i.e. 10 CFU/25 g. The PhageDx E. coli O157:H7 Assay kit did not detect the presence of E. coli O157:H7 in any of the 100 bovine carcasses evaluated. In agreement with this result, the real-time PCR kit did not detect the presence of enterohemorrhagic E. coli. The assays evaluated proved to be satisfactory for detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. isolated in Brazil, showing sensitivity, specificity and rapidity in evaluating different food matrices. The detection of a single Salmonella spp. cell in 25 g of sample, after approximately 9 h of assay, represents a significant reduction in time compared to traditional and rapid methods currently available on the market. The same was observed for the Escherichia coli O157:H7 kit, whose analysis time was about 7 h. In addition, the kits proved to be easy to perform, making them promising tools for the detection of E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in different foods.

Nos últimos anos, o número de refeições consumidas fora de casa tem aumentado, bem como o número de surtos alimentares envolvendo essas preparações e os locais que às produziram. Em Maputo, Moçambique, muitas refeições são realizadas em estabelecimentos como mercados públicos e ruas, sendo que muitos deles não apresentam condições higiênico-sanitárias adequadas. Dessa forma, o primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar as condições higiênico-sanitárias de preparo de alimentos em estabelecimentos de sete mercados públicos da cidade de Maputo. Para tanto, utilizou-se um checklist constituído por 36 questões relativas às práticas de higiene e manipulação de alimentos, o qual foi submetido a 190 manipuladores de 190 estabelecimentos preparadores de alimentos de sete mercados de Maputo. O checklist foi elaborado com base no Diploma Ministerial n. 51 de 3 de outubro de 1984, que consiste na legislação utilizada para avaliar às condições higiênico-sanitárias de estabelecimentos de alimentação em Moçambique. Para classificar os estabelecimentos quanto às condições higiênico-sanitárias, foi criado o Food Safety Index (FSI). Esse índice permitiu classificar cada estabelecimento em três níveis de adequação das condições higiênicosanitárias (inadequadas, satisfatórias e adequadas), e o índice foi calculado utilizando a média harmônica ponderada onde foram considerados pesos diferentes para cada grupo de questões relacionadas às condições higiênicosanitárias dos estabelecimentos. O resultado dos checklists demonstrou que, nos mercados, a maioria (85,76%) dos estabelecimentos apresentou um FSI entre 0,15 e 0,18, tendo sido classificados como em condições inadequadas ou ruins. O segundo objetivo do estudo foi avaliar o nível de conhecimentos e atitudes sobre segurança de alimentos de manipuladores e investigar Enterobacteriaceae nas mãos dos mesmos e nas saladas de alface prontas para consumo, vendidas nas ruas da cidade de Maputo. Ao todo, 110 manipuladores de alimentos foram entrevistados e 55 amostras de saladas e 55 amostras de mãos foram analisadas, utilizando o método ISO 21528-2 para Enterobacteriaceae. A maioria das pessoas entrevistadas foi do sexo feminino, com menos de 35 anos e nunca tinha recebido treinamento em segurança de alimentos. Mais da metade (58%) dos entrevistados possuía conhecimento insuficiente sobre segurança de alimentos, principalmente em relação à contaminação cruzada, controle de temperatura e patógenos alimentares. A contagem média de Enterobacteriaceae nas saladas prontas para consumo e nas mãos dos manipuladores foi de 4,23 ± 0,78 log cfu/g e 3,14 ± 0,7423 log cfu/g, respectivamente. Escherichia coli genérica foi detectada em apenas uma amostra de mãos e não foi observada correlação significativa positiva (P

Estudos recentes têm demonstrado o risco de contaminação microbiológica em frutas e vegetais irrigados com água não tratada, a qual é a mais utilizada na agricultura, tanto em nível mundial, quanto no Brasil. O objetivo da primeira parte deste trabalho foi avaliar a qualidade microbiológica das fontes de água superficiais de irrigação mais utilizadas no sul do Brasil e seu impacto sobre a segurança de alfaces. Para tanto, foram realizadas coletas mensais de água de irrigação e alfaces irrigadas de julho de 2014 a agosto de 2015, em quatro propriedades da região metropolitana de Porto Alegre. Na água de irrigação, foi verificada prevalência de 100% dos indicadores Coliformes Totais e Enterococcus spp., e de 84,8% do indicador E. coli genérica. Já para as amostras de alface, verificou-se também a prevalência de 100% para Coliformes Fecais e 38,3% para E. coli Genérica. Não houve diferença significativa entre os níveis dos indicadores para as diferentes fontes de água avaliadas. As amostras com contagens de E. coli acima de 100 UFC/100mL foram submetidas à análise de presença de patógenos entéricos. E. coli O157:H7 foi identificada em 13 das 64 amostras analisadas, sendo nove amostras de açude e quatro amostras de riachos. Salmonella spp. foi identificada em seis das 64 amostras, das quais quatro foram amostras de açude e duas de riachos Salmonella spp. foi identificada em 4 das 27 amostras avaliadas de alface. As altas contagens de Enterococcus spp. e E. coli genérica apresentaram uma correlação positiva com a presença de Salmonella spp. Foi verificada a influência de fatores climáticos e práticas agrícolas sobre os níveis de contaminação na alface. Na busca por fontes alternativas de água para utilização na agricultura, a água residual urbana vem sendo considerada uma boa opção. Entretanto, este tipo de água geralmente possui uma alta carga de contaminação microbiana. Em um segundo momento, foi avaliado a eficácia da aplicação de dióxido de cloro (ClO2) no tratamento de águas residuais urbanas com tratamento secundário. Verificou-se que o desinfetante foi capaz de melhorar a qualidade microbiológica da água, reduzindo significativamente o indicador E. coli quantificado pelo método tradicional em placas. Entretanto, esta diferença não foi observada quando a E. coli foi quantificada pelo método PMA-qPCR, indicando que o tratamento de água residual com ClO2 pode induzir as bactérias a entrar no estado viável mas não cultivável (VNC). A proporção de amostras positivas para a presença de patógenos foi baixa quando comparada à água sem tratamento (7 em 8) e com tratamento com ClO2 (1 em 8) Apesar dos bons resultados na redução da contaminação, foi observado um acúmulo significativo de cloratos nas amostras de alface, o que pode apresentar risco químico ao consumidor. Uma vez que foi identificada a presença de E. coli O157:H7 em fontes de água de irrigação no sul do Brasil, objetivou-se, em um terceiro momento do presente trabalho, avaliar a capacidade de adaptação e multiplicação de quatro isolados e um pool de E. coli O157:H7 quando inoculados em água de açude filtrada, a 26°C, por até 72 h. Os isolados identificados como Ec1(açude) e Ec2 (riacho) apresentaram diferenças significativas nos parâmetros de taxa máxima de crescimento e fase Lag. Os isolados também foram testados quanto ao comportamento frente ao desinfetante hipoclorito de sódio aplicado em água de irrigação filtrada, nas concentrações de 5 mg/L e 7 mg/L de cloro residual. Quando avaliada a redução pelo método tradicional em placas foi verificado uma redução de 100% dos isolados, após 30 min de contato com a água de irrigação tratada com o desinfetante a 7 mg/L, com uma concentração de 5 mg/L foram identificadas redução média de 3.15 (± 0.02) Log cfu / mL após 30 min. Já pelo método de quantificação por PMA-qPCR, não foi observada redução significativa entre as concentrações testadas, indicando um possível efeito bacteriostático do hipoclorito de sódio quando utilizado nas condições testadas. A partir dos resultados obtidos na presente tese, observa-se um alto risco de contaminação de vegetais irrigados por águas superficiais, sendo necessária a adoção de medidas de controle, em nível de produção primária. Recent studies indicated microbial contamination risk in fruits and vegetables irrigated with untreated water, which is the most common source of irrigation water worldwide and in Brazil. The objective of the first part of this work was to evaluate microbial quality of superficial irrigation water sources used in Southern Brazil and its impact on lettuce safety. Samples of irrigation water and lettuces were taken once a month, from July 2014 to August 2015, from four rural farms at the metropolitan region of Porto Alegre city. For irrigation water, 100% prevalence of the indicators total coliforms and Enterococcus spp., and 84.8% for the indicator generic E. coli was determined. For lettuce samples, it was determined 100% prevalence of total coliforms and 38.3% of generic E. coli. There was no significant difference among the indicator levels for the different water sources evaluated. For samples with more than 100 cfu/100mL of generic E. coli, the presence of enteric pathogens was checked. E. coli O157:H7 was detected in 13 from 64 analyzed samples, 9 in pounds and 4 in streams. Salmonella spp. was found in 6 from 64 samples, 4 in pond and 2 in streams. On lettuce samples, Salmonella spp. was in 4 from 27 samples evaluated. High Enterococcus spp. and E. coli counts were positively related to Salmonella presence. It was verified the influence of climatic factors and agricultural practices on lettuce contamination levels Urban residual water is considered a good alternative for using in agriculture. However, this kind of water usually carries a high level of microbial contamination. So, the efficacy of chlorine dioxide (ClO2) in municipal wastewater with a secondary treatment was evaluated. Results show that the disinfectant improved water microbial quality, with significant reduction of generic E. coli when measured by the traditional plate count method. However, the same was not observed when generic E. coli was measured by PMA-qPCR method, which indicates that ClO2 treatment in residual water can induce bacteria to stay viable but not cultivable state (VBNC). The rate of positive samples for the presence of pathogens was low when waters before treatment (7 in 8) and after ClO2 treatment (1 in 8) were compared. Despite good results in water decontamination, significant chlorate accumulation was observed on lettuce samples, what may represent a chemical risk to the consumers. Once identified the presence of E. coli O157:H7 in irrigation water in Southern Brazil, the adaptation and multiplication capacity of 4 strains and a pool of E. coli O157:H7 was evaluated when inoculated in sterile irrigation water at 26°C up to 72 h The isolates Ec1 (from pond) and Ec4 (from stream) significantly differed for the maximum growth rate and lag phase. These isolates were also tested for their behavior against sodium hypochlorite applied in sterile irrigation water at concentrations of 5 mg/L and 7 mg/L of residual chlorine. Reduction of 100% from the isolates after 30 min in contact with the disinfectant at 7mg/L was observed. The concentration of 5 mg / L, caused a mean reduction of 3.15 (± 0.02) Log cfu / mL after 30 min by the plate count method. However, there was no significant reduction among the tested concentrations by using the PMA-qPCR method, indicating a possible bacteriostatic effect of sodium hypochlorite under the tested conditions. The results obtained in this work shows high contamination risk of vegetables when irrigated by superficial waters and highlight the need of control measures in primary production.

Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma ferramenta para avaliar estruturas físicas, leiaute e materiais de construção de cozinhas industriais. Na primeira etapa do trabalho, diversas legislações sanitárias e documentos técnicos foram avaliados, a fim de identificar itens pertinentes à construção da ferramenta. Com base nisso, foram elaboradas 196 perguntas, divididas em 24 itens, as quais compuseram a ferramenta de avaliação de estruturas (check-list). O check-list foi encaminhado para especialistas da área de segurança de alimentos, para que estes verificassem a adequação das perguntas e conferissem pesos para cada uma delas, conforme a possibilidade na contaminação e o impacto na segurança dos alimentos. O peso 1 (um) foi atribuído aos itens da estrutura física das cozinhas, que poderiam causar impacto na segurança de alimentos, porém que dificilmente resultariam em contaminação dos alimentos ou causariam surtos alimentares, como, por exemplo, as áreas externas, portas externas e fechamento automático de portas de sanitários. O peso 2 (dois) foi atribuído às perguntas sobre a estrutura física da cozinha que poderiam causar contaminação indireta nos alimentos, exemplos: portas internas ajustadas aos pisos e batentes, caixas de gordura e de esgoto compatíveis ao volume de resíduos, entre outros. O peso 4 (quatro) foi atribuído às questões sobre a estrutura física das cozinhas que poderiam causar contaminação direta aos alimentos, como, por exemplo, estrutura dos telhados e tetos, áreas de produção com fluxo linear, entre outras Após a revisão do check-list, foram retiradas as perguntas que não foram consideradas pertinentes ao setor de alimentação e então foi calculado um peso médio para cada pergunta, tendo como base os pesos atribuídos por cada avaliador. A versão final do check-list resultou em 23 itens, compostos por 126 perguntas. Na segunda etapa do trabalho, foi realizada a utilização prática do check-list com o objetivo de testar a aplicação da ferramenta de avaliação e identificar os problemas mais frequentes na construção civil de cozinhas industriais. Para tanto, as cozinhas industriais existentes na região metropolitana de Porto Alegre/RS (RMPA) foram consideradas e identificadas como o universo da pesquisa, possibilitando a visita a um número significativo de cozinhas industriais. O número de cozinhas identificado na RMPA foi de 248 unidades, das quais 52 foram visitadas. Para avaliar cada unidade visitada com relação à adequação sanitária de suas instalações, foi elaborado o Índice Sanitário de Edificações (ISE). O ISE é uma média harmônica ponderada dos itens aplicáveis, a qual leva em consideração os pesos conferidos a cada pergunta e se o item foi conforme ou não. As respostas do check-list foram analisadas no Microsoft Excel 2010 e a análise estatística foi realizada no programa IBM® SPSS® STATISTICS versão 18.0, adotando o nível de significância de 5% As principais não conformidades observadas foram infiltrações, goteiras, tubulações sem capacidade para vazão adequada, pias e sifões entupidos, pouca quantidade de ralos, caimento dos pisos, caixa de gordura, pouca luminosidade, ventilação e conforto térmico. Do total de unidades avaliadas, 1 (2%) apresentou índice de adequação excelente, 14 (27%) índice de adequação bom, 32 (61%) índice de adequação médio e 5 (10%) índice de adequação ruim. Além do índice de adequação ao check-list, foi calculado um índice de adequação aos itens requeridos por legislação. O volume de empresas que apresentaram índices entre os níveis de adequação excelente e bom aumentou quando comparado ao índice de adequação ao chek-list, passando para 4 (8%) com índice excelente, 27 (51%) com índice bom, 20 (39%) com índice médio e 1 (2%) com índice ruim. Os resultados indicam que as cozinhas industriais apresentaram inadequações em suas instalações, já que em sua maioria apresentaram índices medianos ou inferiores de adequação aos itens da legislação e ao ISE. Cozinhas com estas falhas nas instalações podem ter prejudicadas suas condições higiênico- sanitárias do processo, trazendo riscos potenciais para a produção de alimentos. Com a identificação dos problemas nas edificações e leiutes, pôde- se indicar soluções para contribuir na gestão de segurança dos alimentos em serviços de alimentação, prevenindo a contaminação de alimentos. This study aimed to develop a tool to evaluate physical structures, layout and materials of industrial kitchens. In the first stage of the work, several sanitary legislations and technical documents were evaluated in order to identify items pertinent to the construction of the tool. Based on this, check-list tool were elaborated containing196 questions, divided into 24 items. The checklist was assessed to food safety experts to verify the appropriateness of the questions and to check weights for each one, depending on the possibility of contamination and impact on food safety. Weight 1 (one) was attributed to the items in the kitchen's physical structure, which could impact on food safety, but would hardly result in contamination of food or food outbreaks, such as external areas, external doors and automatic door closing of toilets. Weight 2 (two) was attributed to the questions about the physical structure of the kitchen that could cause indirect contamination in the food, some examples: internal doors adjusted to the floors and stops, fat and sewage boxes compatible with the volume of waste. Weight 4 (four) was attributed to questions about the physical structure of the kitchen that could cause direct contamination of food, such as the structure of roofs and ceilings, production areas with linear flow. After reviewing the checklist, the questions that were not considered pertinent to the food sector were removed, and then an average weight was calculated for each question, based on the weights assigned by each evaluator The final version of the checklist resulted in 23 items consisting of 126 questions. In the second stage of the work, the practical check-list was used, with the objective of testing the application of the evaluation tool and identifying the most frequent problems in the civil construction of industrial kitchens. To this end, the industrial kitchens in the metropolitan area of Porto Alegre / RS (RMPA) were considered and identified as the research universe, allowing the visit of a significant number of industrial kitchens. The number of kitchens identified in the RMPA was 248 units, of which 52 were visited. To evaluate each unit visited in relation to the sanitary adequacy of its facilities, the Sanitary Building Index (ISE) was elaborated. The ISE is a weighted harmonic mean of the applicable items, which takes into account the weights given to each question and whether or not the item was compliant. The checklist responses were analyzed in Microsoft Excel 2010 and statistical analyzes were performed using the IBM® SPSS® STATISTICS version 18.0 program, adopting the 5% significance level. The main nonconformities observed were infiltrations, gutters, pipes with no adequate flow capacity, clogged sinks and siphons, few drains, floor trim, grease box, low luminosity, ventilation and thermal comfort Of the total number of units evaluated, 1 (2%) presented an excellent suitability index, 14 (27%) were adequately matched, 32 (61%) were adequately matched, and 5 were considered adequately matched. In addition to the index of adequacy to the checklist, an index of adequacy to the items required by legislation was calculated. The volume of companies that presented excellent and good levels of adequacy increased when compared to the index of adequacy to the former chek-list, passing to 4 (8%) with excellent index, 27 (51%) with good index, 20 (39 %) with average index and 1 (2%) with poor index. The results indicate that the industrial kitchens presented inadequacies in their facilities, since in their majority they presented medium or inferior indexes of adequacy to the items of the legislation and the ISE. Kitchens with these facility failures may have impaired their hygienic-sanitary conditions of the process, bringing potential risks to food production. With the identification of problems in buildings and law, it was possible to indicate solutions to contribute to the management of food safety in food services, preventing the contamination of food.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar os sistemas de gestão da segurança de alimentos de indústrias de vegetais minimamente processados (VMP) do Rio Grande do Sul, avaliar a inativação de Salmonella Enteritidis (SE86) em alfaces submetidas aos diferentes métodos de lavagem e desinfecção observados nas indústrias investigadas e, por fim, elaborar uma proposta de regulamento técnico de Boas Práticas de Fabricação (BPF) para o setor. Cinco indústrias foram visitadas a fim de investigar os fatores contextuais e os sistemas de segurança de alimentos implementados. Em seguida, os métodos de lavagem e desinfecção observados em cada indústria foram simulados em laboratório e alfaces artificialmente inoculadas com S. Enteritidis SE86 foram submetidas a cada um deles. Com base nessas avaliações e outros documentos técnicos, elaborou-se uma proposta de legislação para indústrias de VMP. Os resultados demonstraram que as indústrias estavam operando em um contexto de alto risco, sem os controles necessários para a redução dos mesmos. Foi demonstrada a necessidade de melhorias em relação aos controles de fornecedores, instalações, design higiênico de equipamentos, programas de manutenção e calibração de equipamentos, programas de higienização, registros, capacitação de funcionários, bem como, na realização de análises microbiológicas do produto final. Nenhuma empresa demonstrou implementação completa das BPF, Procedimentos Operacionais Padronizados (POP) ou implementação de sistema Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC). Os resultados laboratoriais indicaram que as indústrias estavam realizando procedimentos de lavagem e desinfecção capazes de reduzir significativamente contagens de S. Enteritidis SE86, porém, em nível industrial, a concentração de sanificante, o pH, a concentração de matéria orgânica e temperatura de água não estavam sendo controlados, o que sugere alto risco. Em vista dos resultados, recomendações foram realizadas na proposta de legislação de BPF e POP, as quais foram adicionadas a RDC 275/2002 (ANVISA) aplicável às indústrias de alimentos brasileiras. Foi sugerido a inclusão de dois POP, o primeiro referente a seleção dos fornecedores de matéria-prima (frutas e vegetais frescos) e o segundo com relação ao processo de lavagem e desinfecção. Além disso, no corpo da proposta, foi sugerido a adição de monitoramento e verificação das temperaturas das câmaras frias, capacitação adequada e contínua de pessoal sobre higiene e manipulação de alimentos e riscos associados a produção e consumo de frutas e vegetais frescos. Também sugeriu-se a obrigatoriedade de Responsável Técnico comprovadamente capacitado para orientar e controlar a implementação e continuidade dos sistemas de gestão da segurança de alimentos. As recomendações foram divididas entre aquelas de curto, médio e longo prazo, sendo as de curto prazo a implementação de controles do processo, principalmente nas etapas de lavagem e desinfecção e análises microbiológicas de produto final. As de médio prazo foram a seleção de fornecedores com Boas Práticas Agrículas (BPA) implementadas, bem como a implantação completa de BPF nas indústrias de VMP. Finalmente, a medida a ser implementada a longo prazo foi a implementação de APPCC. A Proposta de Regulamento específico para VMP pode ser discutida com o setor regulado, para em seguida ser encaminhada para consulta pública e possível publicação pela Vigilância Sanitária Estadual. Essas ações são propostas, a fim de melhorar a segurança dos VMP e desenvolver o setor. The aim of this study was to evaluate Safety Management Systems of minimally processed vegetable industries (VMP) of Rio Grande do Sul, evaluate the inactivation of Salmonella Enteritidis (SE86) in lettuces exposed to different washing methods and disinfection observed in the investigated industries and, finally, prepare a draft technical regulation for Good Manufacturing Practices (GMP) for the sector. Five industries were visited to investigate the contextual factors and the implemented food safety systems. Then, the cleaning and disinfecting methods observed in each industry were performedin laboratory, by inoculating S. enteritidis SE86 on lettuces and subjecting to them. Based on these assessments and other technical documents, it was drawn up a proposed for legislation to VMP industries. The results showed that the industries were operating in a high risk environment, without the necessary control to reduce the risk. It has demonstrated the need for improvements in relation to suppliers of controls, facilities, hygienic equipment design, maintenance programs and calibration equipment, hygiene programs, records, employee training, as well as in carrying out microbiological analyzes of the final product. No company demonstrated full implementation of GMP, Standard Operating Procedures (SOP) or the implementation of Hazard Analysis System and Critical Control Points (HACCP). The laboratory results indicated that the washing and disinfection procedures performed in industries can significantly reduce S. Enteritidis SE86 counts, however, at the industrial level, the concentration of sanitizing, pH, concentration of organic matter and water temperature were not It is controlled, suggesting a high risk. In view of the results, recommendations were made in the proposed GMP and SOP legislation, which were added to DRC 275/2002 (ANVISA) applicable to Brazilian food industries. The inclusion of two SOP has been suggested, the first relating to the selection of suppliers of raw materials (fruits and vegetables) and the second with respect to the washing and disinfection process. In addition, the body of the proposal, it was suggested the addition of monitoring and checking temperatures of cold rooms, adequate and continuous training of personnel on hygiene and food handling and risks associated with production and consumption of fresh fruits and vegetables. It also suggested to proven capable mandatory technical manager to guide and monitor the implementation and continuity of Food Safety Management Systems. The recommendations were divided into short, medium and long term. Short term was the implementation of process controls, especially in the washing and disinfection steps and microbiological analyzes of the final product. Medium-term was the selection of suppliers with Good Agricultural Practices (GAP) implemented, as well as the full implementation of GMP in the VMP industries. Finally, the measure to be implemented in the long term was the implementation of HACCP. The Proposal for a Regulation specific to VMP can be discussed with the regulated sector, to then be sent for public consultation and possible publication by the State Sanitary Surveillance. These actions are proposed in order to improve the safety of VMP and develop the sector.

A água de irrigação têm sido considerada a principal fonte de contaminação microbiológica de vegetais, em nível primário de produção. Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC), principalmente do sorogrupo O157, têm causado graves surtos alimentares, envolvendo muitos alimentos, dentre eles os vegetais. No Brasil, E. coli O157:H7 foi recentemente isolada na água de irrigação de propriedades rurais da região Sul, demonstrando risco de contaminação do produto final. Após esse isolamento, foi desenvolvido o projeto “Baseline study about irrigation water in Brazil and Spain: Impact of microbial quality, sources, type of irrigation systems and the type of crop on the food safety of fresh products”. O estudo realizado na presente dissertação faz parte desse projeto e teve por objetivo investigar a contaminação por E. coli O157 na água de irrigação de alfaces no Sul do Brasil. Além disso, objetivou-se analisar a multiplicação desse patógeno em amostra de água de irrigação bem como sua sobrevivência ao hipoclorito de sódio. Os resultados obtidos demostram que E. coli O157 foi isolada em 19,65 % das 56 amostras coletadas. A prevalência de E. coli O157 não foi correlacionada ao sistema de cultivo, a fonte de irrigação e ao método de irrigação. E. coli O157 isoladas de diferentes locais foram capazes de se multiplicar na amostra indicativa de água de irrigação, atingindo populações de 6,30 ± 0,177 log UFC/mL, após 48 h, em temperatura ambiente. Esses resultados demonstraram que altas contagens desse microrganismo podem ocorrer em açudes utilizados para irrigar folhosos. A exposição dos isolados de E. coli O157 a soluções contendo 2, 7 e 20 mg/L de cloro livre, ao longo de 45 min, reduziu aproximadamente 1,30 ± 0,66 log UFC/mL, o que não possibilitou atingir de níveis seguros para esse patógeno. Este estudo demonstrou a presença de E. coli O157 na água de irrigação no Sul do Brasil e sua capacidade de multiplicação nessas águas. Além disso, evidenciou que a cloração com até 20 mg/L não foi suficiente para controlar esse perigo biológico em condições possíveis de serem alcançadas nas propriedades rurais. Tais resultados reforçam a necessidade de adoção de Boas Práticas Agrícolas (BPA) para prevenir a contaminação das fontes de água de irrigação, nessas propriedades. Irrigation water have been considered the main source of microbial contamination in vevegatbles at the primary level of production. Shiga-toxin producing Escherichia coli (STEC), mainly O157 serogroup, have caused severe food outbreaks involving many foods, including vegetables. In Brazil, E. coli O157: H7 was recently isolated in the water irrigation farms in the southern region, demonstrating risk of contamination in the final product. After this isolation, it was developed the project "Baseline study about irrigation water in Brazil and Spain: Impact of microbial quality, sources, type of irrigation systems and the type of crop on the food safety of fresh products". The study in this thesis is part of this project and aimed to investigate contamination by E. coli O157 in irrigation water of lettuce in southern Brazil. In addition, the objective was to analyze the multiplication of pathogens in irrigation water sample and its survival to sodium hypochlorite. The results demonstrate that E. coli O157 was isolated in 19.65 % of the 56 samples collected. The prevalence of E. coli O157 was not correlated to the cultivation system, the source of irrigation and irrigation method. E. coli O157 isolated from different sites were able to multiply in the sample indicative of irrigation water reaching populations of 0.177 ± 6.30 log CFU/mL after 48 h at room temperature. These results demonstrate that high counts of this microorganism can occur in reservoirs used to irrigate leafy. Exposure of E. coli O157 isolated from solutions containing 2, 7 and 20 mg/L of free chlorine over 45 min, reduced approximately 1.30 ± 0.66 log CFU/mL, which is not allowed to reach safe levels for this pathogen. This study demonstrated the presence of E. coli O157 in the irrigation water in southern Brazil and its multiplication capacity in these waters. Moreover, it showed that the chlorination up to 20 mg/L was not enough to control this biological hazard in conditions likely to be achieved in rural properties. These results reinforce the need for adoption of Good Agricultural Practices (GAP) to prevent contamination of irrigation water sources in these properties.

Nos últimos anos, o consumo de vegetais frescos tem aumentado significativamente, em todo o mundo. Ao mesmo tempo, a ocorrência de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) associadas a esses alimentos tem crescido de forma considerável, podendo levar as vítimas a consequências severas, inclusive à morte. Dados internacionais demonstram diversos microrganismos envolvidos nestes surtos, porém a Salmonella e a Escherichia coli O157:H7 têm sido frequentemente envolvidas. Este trabalho Tese teve o objetivo de avaliar a contaminação microbiológica e a segurança de alfaces convencionais produzida na região Sul do Brasil, desde a produção primária até o varejo. Para tanto, primeiramente, 128 amostras de adubo orgânico, solo, água de irrigação e lavagem, mãos de manipuladores, equipamentos, mudas e pés de alface foram coletadas em 3 propriedades rurais, durante o período de cultivo das alfaces. As amostras foram analisadas para quantificação de indicadores (E. coli) e para a presença de patógenos (Salmonella e Escherichia coli O157:H7). Paralelamante, um questionário de auto-avaliação, com 69 questões, foi aplicado com o objetivo de obter informações sobre os sistemas de gestão implementados nas propriedades rurais. Em seguida, foi realizada a comparação dos resultados microbiológicos das amostras coletadas, informações climáticas e de informações de sistemas de gestão das 03 propriedades produtoras de alfaces convencionais avaliadas neste trabalho e 03 propriedades produtoras de alfaces orgânicas avaliadas em outro trabalho. Os dados microbiológicos, as informações de gestão e informações a respeito de fatores climáticos foram analisados, no intuito de identificar as principais fontes de contaminação das alfaces. Posteriormente, 100 amostras de alface convencionais foram coletadas em hipermercados de Porto Alegre e analisadas para contagens de coliformes, E. coli e para a presença de E. coli O157:H7 e Salmonella. Em seguida, alfaces foram artificialmente contaminadas com Salmonella Enteritidis SE86 e E. coli ATCC8739 e armazenadas em diferentes temperaturas e intervalos de tempo (5, 10, 25 e 37 °C por 0, 2, 6, 24 e 48 h). Os dados obtidos foram modelados matematicamente, a fim de avaliar situações de risco dentro dos hipermercados. Os resultados obtidos na produção primária demonstraram baixas contagens de E. coli e ausência de patógenos em todas as amostras coletadas, porém um alto risco microbiológico foi identificado, para todas propriedades, através do questionário de auto-avaliação. A diferença entre ambos resultados pôde ser explicada pela adoção de algumas medidas como utilização de adubo adequadamente compostado, utilização de água de irrigação e lavagem apropriadas, ausência de animais nas propriedades, entre outros, porém não havia nenhum sistema de segurança de alimentos formalmente implementado. Os resultados também demonstraram que as propriedades orgânicas apresentaram um maior risco microbiológico e presença de patógenos quando comparadas com as propriedades convencionais, fato explicado devido à ocorrência de um evento de inundação, pela utilização de adubo orgânico produzido na própria propriedade, sem adequada compostagem. As alfaces coletadas nos hipermercados demonstraram 4% de prevalência de E. coli e presença de Salmonella em uma amostra. Salmonella e E. coli não se multiplicaram na alface a 5 e 10 °C durante 48 horas, sugerindo serem estas temperaturas adequadas para o armazenamento. Por outro lado, os mesmos microrganismos se multiplicaram a 25 e 37 °C, atingindo níveis elevados que podem oferecer risco à saúde do consumidor, mesmo após uma higienização adequada. Como conclusão, a implementação de Boas Práticas Agrícolas, enfocando a compostagem adequada e qualidade microbiológica da água de irrigação e lavagem, é necessária para evitar a contaminação de alfaces na produção primária. Além disso, os resultados demonstraram a necessidade da manutenção dos vegetais folhosos frescos em cadeia refrigerada abaixo de 10 °C, desde a etapa de colheita até o consumo, a fim de evitar riscos de surtos alimentares relacionados a estes produtos. The consumption of fresh produce is arising significantly, in the last years, worldwide. At the same time, foodborne outbreaks associated to these products are also increasing considerably, leading the victims to severe consequences, including death. International data demonstrated several microorganisms involved with these outbreaks, and Salmonella and Escherichia coli O157:H7 are frequently reported. This Thesis aimed to evaluate the microbial contamination and safety of conventional lettuces produced in Southern Brazil, from primary production to retail. In the first study, 128 samples of manure, soil, irrigation and washing water, worker's hands, equipment, seedlings and lettuces were taken from three conventional farms, during the growth period. Lettuces samples were analysed for indicators (E. coli) and for the presence of pathogens (Salmonella and Escherichia coli O157:H7). At the same time, a self-assessment questionaire, composed by 69 questions, was applied, willing tho get information about the management sistems implemented in the farms. In the second article, a comparison among the microbial results, climatic information and management systems of three conventional and three organic farms was carried out. Microbial data, information about management sistems and information about climatic conditions were analysed, with the aim to identify the major contamination sources of lettuces. In the third manuscript, 100 samples of conventional lettuces were taken from hypermarkets of Porto Alegre city, Southern Brazil, and analysed for coliforms and E. coli counts and for the presence of E. coli O157:H7 and Salmonella. After that, lettuces were artificially contaminated with Salmonella Enteritidis SE86 e E. coli ATCC8739 and stored at different temperatures and times (5, 10, 25, and 37°C for 0, 2, 6, 24, and 48 h). Data were modelled in order to evaluate risk situations inside hypermarkets. Results from primary production demonstrated low levels of E. coli and absence of pathogens in all analysed samples, but a high microbial risk was identified, for all farms, by the self-assessment questionaire. Differences between both results could be explained by the adoption of some adequate measures as the use of manure properly composted, use of water of good quality, absence of animals in the farms, but, at the same time, no formal management system was applied. Results also showed that organic farms demonstrated higher microbial risks based on questionnaire responses and presence of pathogens when compared with conventional ones, and these was explained mainly because a flooding event and the use of manure without adequate composting time was observed in the organic farms. Lettuces collected in the hypermarkets demonstrated 4% of E. coli prevalence and the presence of Salmonella in one sample. Salmonella and E. coli did not multiply on lettuce kept at 5 and 10 °C for 48 hours, suggesting that these could be adequate temperatures of storage. On the other hand, the same microorganisms multiply at 25 and 37 °C, reaching high levels that could represent risk to consumer's health, even after disinfection procedures. Concluding, the implementation of Good Agricultural Practices, focusing the adequate composting of manure and adequate microbial quality of irrigation and washing water is necessary in order to avoid contamination of lettuces in primary production. Besides that, results demonstrated the necessity of mantainence of fresh produce in cool chain below 10 °C, since harvest until consumption in order to avoid risks related to these products.

A busca por alimentos saudáveis, seguros e sustentáveis tem levado a um grande aumento do consumo de alimentos orgânicos, em todo o mundo. Embora esses alimentos sejam claramente menos expostos aos perigos químicos, diversos estudos têm demonstrado contaminação microbiológica significativa em produtos como as alfaces orgânicas, as quais são amplamente comercializadas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a cadeia produtiva de alfaces orgânicas no sul do Brasil, através de análises microbiológicas e dos sistemas de gestão da inocuidade, buscando identificar possíveis medidas de intervenção a partir do ponto de vista da segurança dos alimentos. Três propriedades rurais de alface orgânica foram analisadas, utilizando as ferramentas Horticultural Assessment Scheme (HAS) e Horticulture Safety Management System Diagnosis (HSMS-DI). Amostras de adubo, solo adubado, mudas de alface, alface, água de irrigação e lavagem foram coletadas ao longo da cadeia produtiva, seguindo a ordem de inicio do plantio, durante o crescimento e na colheita das alfaces. As análises microbiológicas foram realizadas segundo o protocolo do HAS e normas internacionais. Para avaliação dos sistemas de gestão de segurança dos alimentos a ferramenta de diagnóstico HSMS-DI, com 58 questões, foi aplicada em cada propriedade rural. As Informações obtidas no HAS e HSMS-DI foram combinadas e um diagnóstico de cada propriedade foi elaborado, assim como foram sugeridas medidas de intervenção. Os resultados do HSMS-DI indicaram que as propriedades rurais apresentavam clara organização e forte embasamento quanto à prevenção dos riscos químicos, no entanto estavam operando em um contexto de risco microbiológico moderado a elevado. Os resultados obtidos com o HAS demonstraram contaminação por microrganismos de origem fecal em diversas amostras, além disso, foi detectada a presença de E. coli O157:H7 na água de irrigação e lavagem das alfaces, e a presença de Salmonella em adubo. Estes resultados demonstraram a existência natural e inerente de fontes de contaminação microbiológica na cadeia de produção de alfaces orgânicas. Contudo, destaca-se a necessidade de maior apoio aos produtores orgânicos, principalmente na implementação de medidas de controle da compostagem dos adubos e na qualidade da água de irrigação e lavagem dessas propriedades. The search for healthy, safe and sustainable food has led to a large increase in the consumption of organic foods worldwide. Although these foods are clearly less exposed to chemical hazards, several studies have demonstrated significant microbial contamination in products such as organic lettuces, which are widely marketed. Thus, the aim of this study was to evaluate the production chain of organic lettuce in southern Brazil, through microbiological analyses and safety management systems in order to identify potential measures from the point of view of food safety. Three rural properties of organic lettuce were analyzed using the Horticultural Assessment Scheme (HAS) and the Horticulture and Safety Management System Diagnosis (HSMS-DI) tools. Samples of compost, fertilized soil, lettuce seedlings, lettuce, irrigation and wash water were collected along the production chain, following the beginning of the planting, the growing and the harvesting of lettuce. Microbiological analyzes were performed according to protocol HAS and international standards. For evaluation of the food safety management, the diagnostic tool HSMS-DI, with 58 questions, was administered to each farm. Information collected on HAS and HSMS-DI was combined and a diagnosis of each property was developed, as were suggested intervention measures. The results of the HSMS-DI indicate that the farms had clear and strong organizational foundation for the prevention of chemical risks, however, were operating in a context of moderate to high microbiological risk. The results obtained with the HAS showed contamination by microorganisms of fecal origin in several samples, furthermore, we detected the presence of E. coli O157: H7 in irrigation and wash water, and the presence of Salmonella in manure. These results demonstrated the existence of inherent and natural sources of microbiological contamination in the production chain of organic lettuces. However, there is a need for greater support for organic producers, especially in the implementation of control measures for fertilizer composting and in the quality of irrigation and wash water of these properties.

O Brasil é líder mundial em exportação de carne bovina. A qualidade e a segurança dos produtos cárneos são essenciais para permanecer como exportador no competitivo mercado internacional. Atualmente, critérios microbiológicos são usados para avaliar produtos cárneos, e Salmonella tem sido usada como um importante indicador da segurança dos alimentos por diversos países. No presente estudo, um total de 120 carcaças foram analisadas em três diferentes pontos do processo de abate em um abatedouro-frigorífico exportador localizado no sul do Brasil. Os resultados demonstraram que quatro carcaças (3,3%) foram positivas para Salmonella. Todas as amostras positivas foram coletadas do couro depois da sangria (Primeiro ponto de coleta – P1), e Salmonella não foi encontrada nas amostras coletadas após a retirada do couro (Segundo ponto de coleta – P2) e antes do último toalete (Terceiro ponto de coleta – P3). Seis isolados foram obtidos e classificados em três sorovares diferentes; S. Newport (n=3), S. Saintpaul (n=2) e S. Anatum (n=1). As cepas de Salmonella também foram analisadas quanto à susceptibilidade antimicrobiana, usando 15 antimicrobianos recomendados pelo CLSI. Nenhuma cepa apresentou resistência a qualquer um dos antimicrobianos testados. Além da investigação de Salmonella, a contagem de Escherichia coli foi realizada em todos os três pontos do processo. O ponto mais contaminado foi o primeiro (couro) que apresentou contagens variando de 0,31 a 5,07 log UFC/100 cm². O segundo e o terceiro ponto apresentaram contagens variando de N. D (não detectado) a 2,42 log UFC/100 cm² e N. D a 2,10 log UFC/100 cm², respectivamente. Uma redução significativa da contagem de E. coli foi observada entre o primeiro e os outros demais pontos. Os resultados indicaram que o risco de contaminação das carcaças ainda existe principalmente do couro. A implementação de Boas Práticas de Fabricação e dos princípios do APPCC são importantes ferramentas para prevenir a contaminação microbiana em carcaças. Brazil is the leading exporter of beef worldwide. The quality and safety of the meat products are essential to remain as an exporter in the very competitive international market. Currently, microbiological criteria are used to evaluate meat products, and Salmonella has been used as an important food safety indicator in many countries. In the present study, a total of 120 carcasses were analyzed in three different steps of the slaughter process in an exporter slaughterhouse located in southern Brazil. The results demonstrated that four carcasses (3.3%) were positive for Salmonella. All the positive samples were collected on the hides after the bleeding (First collection step – P1), and Salmonella was not found in the samples collected after the removal of the hides (Second collection step – P2) and before the last toilet (Third collection step – P3). Six isolates were obtained and were classified in three different serovars, i. e. S. Newport (n=3), S. Saintpaul (n=2) and S. Anatum (n=1). The Salmonella strains were also examined for antimicrobial susceptibility using 15 drugs recommended for CLSI. None strains exhibited resistance to any of the antimicrobials tested. In addition to the Salmonella investigation, Escherichia coli counts were carried out in the three processing points. The most contaminated point was the first (hide) that showed counts ranged from 0.31 to 5.07 log CFU/100 cm². The second and the third points demonstrated counts ranged from N.D (not detected) to 2.42 log CFU/100 cm² and N.D to 2.10 log CFU/100 cm², respectively. A significant reduction of the E. coli counts was observed among the first and the other points. Results indicated that the risk of contamination of the carcasses still exists, mainly from the hides. The implementation of Good Manufacturing Practices and HACCP principles are important to avoid microbial contamination.