Search

Proteínas da família Y-box (YBP) são consideradas reguladores multifuncionais da expressão gênica e, geralmente, apresentam dois domínios característicos: um altamente conservado de ligação a ácidos nucléicos (CSD - cold shock domain) e um Cterminal pouco conservado (Tail ou cauda). Vários estudos têm demonstrado o papel de algumas YBP na resposta celular ao estresse causado por agentes genotóxicos, na capacidade de interagir com lesões e erro de pareamento de bases no DNA, além da interação com algumas proteínas das vias de reparo do DNA evidenciando que as YBP podem participar nos mecanismos de reparo do DNA. SMYB1 é uma proteína de Schistosoma mansoni que apresenta grande similaridade entre seu domínio CSD e domínios correlatos em outros membros dessa família de proteínas. S. mansoni, o parasito trematódeo responsável pela esquistossomose, exibe um ciclo de vida complexo com alternância de fases entre um hospedeiro intermediário e um definitivo, que vivem em ambientes diferentes. A caracterização de proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica é de grande importância para o entendimento dos eventos moleculares que controlam mudanças fisiológicas e morfológicas em tais organismos. O presente estudo visa ampliar o conhecimento acerca da proteína SMYB1 e sua função biológica. Para isso, foram realizados ensaios de localização de SMYB1 em diferentes fases do desenvolvimento de S. mansoni, detectando a proteína nos estágios de ovo, vermes adultos macho e fêmea, cercária, miracídio e esquistossômulos, sempre no citoplasma. A localização citoplasmática da proteína corrobora achados anteriores do nosso grupo que mostraram a sua habilidade de interação com moléculas de RNA. A interação com mRNAs realizada por outros membros da família YBP é bem estabelecida e sugere sua possível função na regulação de eventos pós-transcricionais da expressão gênica. O papel de SMYB1 na proteção contra o estresse oxidativo no DNA foi também avaliado. Para isso, os protozoários Trypanosoma cruzi heminocaute para o gene MSH2 (homólogo de mutS em Eucariotos) e Trypanosoma brucei nocaute para o gene MSH2 foram utilizados como modelo e verificamos que SMYB1 é capaz de complementar a função desempenhada por MSH2 tanto em T. cruzi quanto em T. brucei. As cepas expressando SMYB1 foram mais resistentes ao tratamento com peróxido de hidrogênio, sugerindo que a proteína possa reconhecer lesões oxidativas no DNA (incluindo a 8-oxoG, que tem sua produção aumentada na presença de peróxido de hidrogênio) e ativar uma resposta a essa lesão. RBP16, ortóloga de SMYB1, é uma proteína de ligação a RNA mitocondrial de T. brucei cujo domínio cold shock apresenta entre 33% e 38% de identidade com o CSD de outras proteínas eucarióticas da família YBP. Assim sendo, outro objetivo deste trabalho foi avaliar o papel de RBP16 em parasitos selvagens frente ao tratamento com agentes genotóxicos. Ao avaliar o efeito do silenciamento de RBP16 em T. brucei, verificamos que seu gene é essencial para o crescimento da forma sanguínea do parasito e para a resposta ao estresse oxidativo. No entanto, a diminuição nos níveis da proteína não aumenta a sensibilidade das células aos danos causados pela cisplatina e pelo metilmetanosulfonato (MMS). Os processos de reparo de DNA são cruciais para o sucesso parasitário do T. cruzi e T. brucei e, dessa forma, o maior entendimento dessas vias pode levar a uma melhor compreensão da biologia dos tripanossomatídeos e à elaboração de novas estratégias para o tratamento das doenças causadas por esses parasitos. Y-box binding proteins (YBP) are considered multifunctional regulators of gene expression that present two characteristic domains: a highly conserved nucleic acid binding domain (cold shock domain, CSD) and a less conserved C-terminal domain (tail domain). Several studies have demonstrated the role of some YBP in the cellular response to stress caused by genotoxic agents, the ability to interact with injuries and DNA mismatch repair, as well as interaction with some proteins of the DNA repair pathways showing that the YBP may participate in DNA repair processes. SMYB1 is a Schistosoma mansoni protein that presents a CSD highly similar to CSDs from other YBP family members. S. mansoni, the etiologic agent of schistosomiasis, is a trematode parasite with a complex life cycle that alternates between two different hosts and also lives in diverse environments. The characterization of proteins involved in the regulation of gene expression is of great importance for the understanding of molecular events that control physiological and morphological changes in such organisms. The present study aims to increase the current knowledge about the SMYB1 protein and its biological function. To this end, immunolocalization experiments were performed in different S. mansoni life cycle stages, revealing the presence of this protein in the citoplasm of eggs, male and female adult worms, cercaria, miracidia and schistosomulae. The citoplasmic localization of SMYB1 is in agreement with previous findings from our research group that have shown its ability to interact with RNA molecules. The interaction with mRNAs by other YBP members is well-established and suggests a possible function in the regulation of post-transcriptional gene expression events. The role of SMYB1 in the protection against oxidative stress was also evaluated. To reach this goal, we have obtained MSH2 single knockout lines of Trypanosoma cruzi MSH2 double knockout lines of Trypanosoma brucei and verified that SMYB1 is able to complement the function of MSH2 in both parasites. SMYB1-expressing strains were more resistant to hydrogen peroxide treatment, suggesting that this protein may recognize oxidative lesions in the DNA (including 8-oxoG, which is increased in the presence of hydrogen peroxide) and a response to that injury. RBP16, an ortholog of SMYB1, is a mitochondrial RNA binding protein from Trypanosoma brucei that contains a CSD 33-38% identical to CSDs of other eukaryotic YBPs. Therefore, another aim of this work was to evaluate the role of RBP16 in wildtype parasites and the behaviour of such organisms in the presence of genotoxic agents. Evaluating the effect of RBP16 silencing in T. brucei, we have verified that this is an essential gene for parasite growth and response to oxidative stress. Nevertheless, the decreasing of protein levels did not increase cell sensitivity to DNA damages caused by cisplatin and metilmetanosulfonate. DNA repair processes are crucial to the parasitic success of both T. cruzi and T. brucei and, therefore, a better understanding of the mechanisms involved in the repair of damaged DNA may help to explain the biology of Trypanosomatids and lead to the development of new strategies for the treatment of diseases caused by such parasites.

A imuno-senescência é o resultado cumulativo do processo de declínio progressivo da atividade do sistema imune devido ao processo de envelhecimento. Ela contribui para o aumento da susceptibilidade a doenças infecciosas, câncer e doenças autoimunes. As alterações relacionadas ao envelhecimento incluem a involução tímica, alterações nos fenótipos celulares, perfil de citocinas e no repertório de linfócitos. De um modo geral, animais e humanos idosos apresentam uma redução no número de linfócitos T virgens com o aumento paralelo dos linfócitos T de memória, uma reatividade imunológica comprometida e uma diminuição na sua capacidade de reagira antígenos novos. Vários trabalhos relatam modificações no desenvolvimento de doenças parasitárias ao longo do processo de envelhecimento no que diz respeito a sua prevalência e intensidade.Aponta-se uma forte associação entre idade e resistência à infecções e reinfecções por parasitos, tais como o Schistosoma mansoni, causador de doença endêmica debilitante e que afeta mais de duzentos milhões de pessoas em países em desenvolvimento.É possível que a menor intensidade observada em adultos resulte da aquisição de imunidade protetora devido ao estímulo antigênico crônico. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do envelhecimento na reatividade imunológica à infecção pelo Schistosoma mansoniem modelo experimental murino. Verificamos que camundongos C57BL/6 velhos apresentam uma resposta inflamatória diminuída aos antígenos do parasito, resultando em títulos mais baixos de anticorpos específicos. Apesar da resposta imune humoral diminuída, os animais velhos são igualmente susceptíveis à infecção por S. mansoni, e também desenvolvem imunidade protetora frente a uma reinfecção. Em animais velhos infectados, a atividade de eosinófilos parece estar preservada e pode ter contribuído para a eliminaçãode vermes na reinfecção. Possivelmente, a menor polarização na produção decitocinas durante a evolução da patologia altera a dinâmica da formação/involução do granuloma no velho. Camundongos velhos formam granulomas menores durante a fase aguda da infecção, mas não é observado o processo de imunomodulação na fase crônica, como bem descrito nos jovens. Observamos um aumento na frequência de células T com perfil de ativação em animais jovens infectados, entretanto, em camundongos velhos, que já possuem maior proporção de linfócitos ativados, a infecção não altera a frequência dessas células. Devido a esse estado constitutivo de ativação dos linfócitos durante a senescência, é provável que respostas inflamatórias a novos antígenos sejam inibidas por encontrarem o sistema imune altamente povoado por células efetoras. The immunosenescence is defined as a cumulative result of decline in the activity of the immune system activity due to progressive aging, and contributes to increased susceptibility to infectious diseases, cancer and autoimmunediseases. Such aging-related changes include thymic involution, changes in frequencies of activated lymphocytes, in cytokine profile and in lymphocyte repertoire. Generally, aged animals and humans show a reduction in the frequency of naïve T lymphocytes, increased proportion of memory T cells and a diminished immune reactivity to novel antigens. Many studies report changes in the prevalence and intensity of parasitic diseasesduring aging. There is a strong association between age and resistance to infectious diseases, such as schistosomiasis, an endemic disease that affects more than two hundred million people in developing countries. It is possible that the lower infection intensity observed in adults results from the acquisition of protective immunity due to chronic antigenic stimulation. The aim of this work was to evaluate the influence of aging in immune reactivity to infection by Schistosoma mansoni in the mouse. We observed that aged C57BL/6 mice have a reduced inflammatoryresponse to parasite antigens, resulting in lower specific antibody titles. Despite the reduced humoral immune response, old animals were as susceptible to infection as young animals, and they also develop protective immunity against reinfection. Eosinophils activity seemed to be conserved in aged infected animals and may have contributed to worm elimination during reinfection. It is plausible that the altered cytokine balance during disease development changes the dynamics of the granuloma formation/involution in aged mice. Aged mice formed smaller granulomas at acute phase of infection, but they did not develop the process of immunomodulation inchronic phase, as described in young animals. After infection, young mice showed a typical increase in the frequency of activated T cells. On the other hand, we found increased frequencies of activated T cells in non-infected aged mice regardless of their infection status. Lymphocytes in non-infected aged animals were constitutively activated and it is likely that inflammatory responses to novel antigens may be impaired when facing an immune system already highly populated by effector cells.

O conteúdo genético de um organismo está continuamente exposto a agentes que danificam a molécula de DNA, causando mutações ou comprometendo suas funções. Complexos mecanismos de reparo ou tolerância a danos no DNA ajudam a manter baixas as taxas de mutação em uma célula e a garantir a integridade do seu genoma. Neste trabalho, estudamos o reparo de DNA em dois parasitos humanos, Schistosoma mansoni e Trypanosoma cruzi, causadores da esquistossomose e da Doença de Chagas no Brasil. Esses parasitas são expostos a diferentes agentes genotóxicos ao longo do ciclo de vida e necessitam, portanto, apresentar diversos mecanismos de adaptação. Através da estratégia de complementação funcional heteróloga, isolamos um cDNA de S. mansoni capaz de complementar bactérias deficientes na via de reparo por excisão de bases (BER). O sequenciamento do cDNA indicou homologia ao gene ScIMP4 de Saccharomyces cerevisiae, que está envolvido no metabolismo de RNA. Construímos uma linhagem mutante de S. cerevisiae, que codifica a proteína IMP4 truncada e verificamos que esta apresenta sensibilidade acentuada a MMS. Observamos ainda que o gene IMP4 de S. mansoni foi capaz de complementar parcialmente a levedura mutante, indicando homologia funcional entre os genes IMP4 do verme e da levedura. Na segunda etapa deste trabalho, estudamos mecanismos de reparo de DNA possivelmente associados à geração de variabilidade genética em T. cruzi. Nosso grupo demonstrou previamente a existência de três isoformas (A, B e C) da proteína TcMSH2 em T. cruzi. Esta proteína é o principal componente da via de reparo de erros de pareamento (MMR) em eucariotos. Através de ensaios in vivo com cisplatina, MNNG e H2O2, na presença de cloreto de cádmio (em concentrações que inibem especificamente o MMR), obtivemos novos indícios de que as cepas que codificam a isoforma A de TcMSH2 apresentam MMR mais eficiente, quando comparadas a cepas que codificam a isoforma C desta proteína, e isto pode estar relacionado com a maior variabilidade genética vista nas últimas. Para estudar mecanismos de resposta a danos oxidativos em T. cruzi, caracterizamos o possível ortólogo de OGG1 no parasito. Vimos que a expressão do alelo TcOgg1A é tóxica em bactérias e que a superexpressão deste no clone CL Brener aumenta sua sensibilidade ao tratamento com H2O2. Ainda, realizamos uma busca por homólogos funcionais de MutT em T. cruzi. Nossos resultados indicam que os alelos Ndx1 e Ndx4, que apresentam o domínio Nudix, não complementam bactérias deficientes em MutT. Também observamos que a superexpressão de EcMutT em T. cruzi aumenta a sobrevivência dos parasitos em resposta ao tratamento com H2O2 e reduz os níveis de 8-oxoG após estresse oxidativo. Finalmente, desenvolvemos um sistema repórter capaz de avaliar a taxa de mutação em T. cruzi. O ensaio, realizado em meio semi-sólido, baseia-se na seleção de mutantes resistentes a neomicina, que revertem uma mutação inserida no gene neo introduzido no genoma do parasito. Os resultados obtidos em um ensaio preliminar indicam a viabilidade da metodologia, através da qual seremos capazes de determinar a taxa de mutação em diferentes cepas de T. cruzi, assim como avaliar o efeito de diferentes agentes mutagênicos no parasita. Cells have evolved a complex set of mechanisms to appropriately respond to genotoxic damage, ensuring genomic stability. Such responses retain mutation rates in an acceptable level, through a fine-tuning balance between genome maintenance and generation of genetic variability. In this work, we studied some features of the DNA repair machinery of Schistosoma mansoni and Trypanosoma cruzi, the causative agents of schistosomiasis and Chagas disease in Brazil. Both parasites need to adapt to distinct environments, and are consequently exposed to various DNA damaging agents. Using a functional heterologue complementation strategy, we have isolated a S. mansoni cDNA that complements Escherichia coli mutants defective in the DNA base excision repair (BER) pathway. This cDNA has sequence homology to a gene involved in the RNA metabolism pathway, the ScIMP4 gene of Saccharomyces cerevisiae. To establish whether the S. mansoni cDNA could complement yeast mutants ScIMP4-defective, we constructed a yeast haploid strain containing a truncated Imp4p gene which shows MMS sensitivity. The functional homology between the ScIMP4 gene and the cDNA from S. mansoni was verified by partial complementation of the mutant yeast with the worms gene. As a second goal, we studied T. cruzi DNA repair mechanisms possibly involved in the generation of genetic variability in this protozoan parasite. We have previously demonstrated that polymorphisms in the TcMSH2 locus, which encodes a key component of the mismatch repair (MMR), result in three different protein isoforms present in the T. cruzi population. Using cisplatin, MNNG and H2O2 in vivo assays performed with cadmium, which in sub lethal concentrations inhibits specifically the MMR, we provided evidences that TcMSH2A-expressing parasites have increased MMR activity when compared to parasite strains expressing TcMSH2C isoforms. To better understand the mechanisms involved in the oxidative DNA damage response in T. cruzi we characterized the putative OGG1 ortologue in the parasite and showed that (i) TcOgg1A expression is toxic in bacteria and (ii) stably TcOgg1A transfected parasites have increased H2O2 sensitivity. Additionally, a search for candidates for a functional homologue of E. coli MutT in T. cruzi using the Nudix Box was attempted. We`ve found that expression of Ndx1 or Ndx4 was unable to suppress the high spontaneous mutagenesis of E. coli mutT-deficient strain and that EcMutT overexpressing parasites showed increased survival and decreased 8oxoG levels after H2O2 treatment. Finally, we developed a methodology to determine the mutation rate in T. cruzi. The assay is performed in semisolid medium plates and is based on the selection of clones that spontaneously reverts the neomycin-sensitive phenotype caused by a single base substitution in the neomycin resistance gene (neo) inserted into the parasite genome. Our preliminary results indicate that this experimental approach is functional since (i) clones that grew in neomycin containing plates have the mutation repaired as shown by DNA sequence, (ii) a proportionally higher number of clones able to grow in the presence of neomycin was observed after long-time culture in liquid medium and in cultures that were treated with a mutagenic agent. This methodology is now in place in our laboratory to be used to determine the mutation rate in distinct T. cruzi strains, as well as analyzing the effect of different mutagens in this parasite.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A esquistossomose é uma doença crônica que atinge aproximadamente 200 milhões de pessoas em 76 países no mundo. Atualmente, a quimioterapia é a estratégia de controle usada, entretanto como controle tem limitações favorecendo o desenvolvimento de uma vacina anti-esquistossomótica. Nesta tese de doutorado, mostramos resultados do estudo da avaliação da resposta imune em camundongos imunizados com Sm22.6 na forma recombinante e de vacina de DNA. Nós isolamos o gene que codifica a Sm22.6 de Schistosoma mansoni da biblioteca de cDNA de fase pulmonar. Uma proteína do verme adulto homóloga foi reconhecida pela IgE de pacientes resistentes a reinfecção que vivem em área endêmica. Neste estudo, a forma recombinante da Sm22.6 e a vacina de DNA foram utilizadas para imunizar camundongos e avaliar a resposta imune gerada. Adicionalmente, avaliamos a habilidade destes dois protocolos de vacinação em induzir imunidade protetora contra S. mansoni. A vacina de DNA não induziu qualquer proteção após o desafio de infecção. Entretanto, Sm22.6r mais adjuvante de Freund foi capaz de induzir uma proteção parcial (34,5%) contra o desafio com cercárias de S. mansoni. Este protocolo de imunização induziu produção de IFN-g e IL-4 antígeno-específico em camundongos C57BL/6, uma resposta imune mista do tipo Th1/Th2. Em contraste, o uso de hidróxido de alumínio como adjuvante ou a proteína recombinante na ausência de adjuvante induziu altos níveis de IgG, IgG1 e IgG2a, mas falhou em induzir a proteção conferida pelo adjuvante de Freund. Concluímos que Sm22.6r é um fraco imunógeno e não é recomendado para compor uma vacina anti-esquistossomótica. De forma interessante, Sm22.6r na ausência de adjuvante foi capaz de induzir altos níveis de IL-10 nos camundongos imunizados. Estes dados nos levaram a investigar o papel da Sm22.6 em outras linhas de pesquisa como a da modulação da asma alérgica.

Schistosoma mansoni é um trematódeo digenético que causa a esquistossomose, doença parasitária que constitui um importante problema de saúde pública no Brasil e em muitos outros países do mundo. O Projeto Genoma de S. mansoni teve início em 1992 como uma iniciativa brasileira que visa à descoberta de novos genes do parasita para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas. No início do programa, centenas de Etiquetas de Sequência Transcritas (ESTs) foram geradas a partir de uma biblioteca de cDNA de vermes adultos. Entretanto, S. mansoni tem um complexo ciclo de vida o que tornou necessário a expansão do programa de descoberta de novos genes para outros estágios de desenvolvimento do parasita. No presente trabalho, oito bibliotecas de diferentes estágios do desenvolvimento do parasita, todas construídas utilizando-se o sistema ZapII, foram excisadas em massa para a obtenção de moldes de cDNA de fita dupla para que fosse possível a geração de grandes números de ESTs a partir de cada uma delas. A qualidade dos transcritos das bibliotecas excisadas foi então avaliada. Ao menos 30 colônias de cada biblioteca foram selecionadas para avaliação do tamanho médio dos insertos por PCR. A maior parte deles tinha um tamanho médio maior do que 500 pb. Na maior parte das bibliotecas menos 20% dos clones eram de sequências não informativas e mais de 50% deles eram de novos genes. Quando se considera apenas os genes presentes em mais de uma biblioteca, um total de 466 genes únicos foi obtido, o que corresponde a 427 genes novos de S. mansoni. Dos genes únicos, 20,2% foram identificados com base na sua homologia com genes de outros organismos, 8,3% eram genes já conhecidos do parasita e 71,5% do total era de genes desconhecidos. Após estas avaliações iniciais, nossos esforços foram direcionados para a cercária, a forma larvária do parasita que infecta o homem e outros vertebrados. Duas bibliotecas de cDNA de cercárias de S. mansoni foram examinadas e sequências parciais foram obtidas de 957 clones selecionados ao acaso. Baseado em buscas por homologia, 551 (57,6%) das ESTs geradas não tinham homólogos nas bases de dados públicas enquanto que 308 (32,2%) foram identificadas totalizando 859 ESTs. As 98 restantes (10,2%) eram ESTs não informativas (RNA ribossomal e sequências mitocondriais não codificantes). Através de análises de clusters, fomos capazes de identificar 453 genes diferentes. Cento e dezenove genes identificados foram agrupados em 11 categorias funcionais onde genes associados com o metabolismo de energia foram os mais abundantes (13%) e diversos. A diversidade e a abundância de genes associados com a maquinaria de transcrição e tradução e com funções regulatórias e de sinalização celular também foram marcantes. Um transcrito de paramiosina foi identificado indicando que este gene não é expresso exclusivamente em vermes adultos e esporocistos (como tem sido sugerido na literatura). Dentre os novos genes de S. mansoni descobertos, identificamos um gene que codifica uma Rho-type GTP-binding protein o qual foi sequenciado inteiramente neste trabalho. A sua janela aberta de leitura é de 579 pb e codifica um polipeptídeo de 193 aminoácidos cujo peso molecular estimado é de 21,8 kDa. A sequência de aminoácidos deduzida apresenta alta homologia com Rho GTPases de várias espécies e possui todos os domínios conservados característicos de Rho GTPases. A superexpressão do gene de Rho GTPase de S. mansoni (SMRHO) complementa uma cepa mutante da levedura Saccharomyces cerevisiae que teve seu gene rho1 selvagem eliminado artificialmente por nocaute gênico. A complementação ocorre mesmo em condições de alta temperatura e de concentração de Ca2+ que são restritivas para o crescimento da levedura. Entretanto, algumas alterações fenotípicas, tais como parada do ciclo celular, aumento do tamanho da célula e brotamento ao acaso, foram observadas indicando que a Rho GTPase de S. mansoni não é capaz de complementar perfeitamente todas as funções executadas pela RHO1 GTPase selvagem de S. cerevisiae. Os resultados de complementação junto com alinhamentos de sequências tornaram evidente que uma maior conservação de resíduos de aminoácidos específicos na região da hélice á3 e loop 7 da Rho GTPase de S. mansoni podem explicar a complementação observada mesmo nas condições de alta temperatura e de concentração de Ca2+. Os resultados obtidos durante este trabalho demonstraram que ESTs constituem uma abordagem versátil e eficiente para a descoberta de novos genes de S. mansoni nos seus diferentes estágios do ciclo de vida e que a levedura S. cerevisiae pode ser uma ferramenta poderosa em investigações sobre as funções dos genes deste complexo parasita. Schistosoma mansoni is a digenetic trematode that causes schistosomiasis, a parasitic disease that constitutes an important public health problem in Brazil and in many other countries throughout the world. The S. mansoni genome project was started in 1992 as a Brazilian initiative to discover new genes of this parasite for new drugs and vaccine development. At the debut of the program, hundreds of Expressed Sequence Tags (EST) were generated from an adult worm cDNA library. However, S. mansoni has a complex life cycle, which made necessary to expand the gene discovery program to other developmental stages of the parasite. In the present work, eight libraries from distinct developmental stages, all constructed using the ZapII system, were excised "en masse" to obtain double strand cDNA templates and generate large numbers of ESTs from each one of them. The quality of the transcripts from the excised libraries was then evaluated. At least 30 colonies from each library were selected to evaluate the average size of the inserts by PCR. Most of them had an average insert size greater than 500 bp. Most of them were shown to have less than 20% useless clones and more than 50% new genes. When considering only genes presents in more than one library, a total of 466 unique genes were obtained, corresponding to 427 new S. mansoni genes. From the total of unique genes, 20.2% were identified based on homology with genes from other organisms, 8.3% matched S. mansoni characterized genes and 71.5% represent unknown genes. After these initial evaluations, our efforts were directed to cercaria, the parasite larval form which infects humans and other vertebrates. Two S. mansoni cercarial cDNA libraries were examined and partial sequences obtained from 957 randomly selected clones. Based on homology searches, 551 (57.6%) ESTs generated had no homologs in the public databases while 308 (32.2%) were putatively identified, totaling 859 informative ESTs. The remaining 98 (10.2%) were uninformative ESTs (ribosomal RNA and non-coding mitochondrial sequences). By clustering analysis we were able to identify 453 different genes. One hundred and nineteen identified genes were sorted into 11 functional categories where genes associated with energy metabolism were the most abundant (13%) and diverse. The diversity and abundance of genes associated with the transcription-translation machinery and with regulatory-signaling functions were also noticeable. A paramyosin transcript was identified, indicating that this gene is not exclusively expressed in adult worms and sporocysts (as had been suggested previously). Among the new genes discovered, we identified a S. mansoni Rho-type GTP-binding gene, which was entirely sequenced in this work. The gene open reading frame was 579 bp long and encoded a putative 193 amino acid polypeptide with an estimated molecular weight of 21.8 kDa. The deduced amino acid sequence was highly homologous to the Rho GTPases of several species and contained all Rho-type GTPase conserved domains. S. mansoni Rho GTPase gene (SMRHO) overexpression complements a Sacharomyces cerevisiae rho1 null mutant strain. The complementation is seen even in high temperature and Ca2+ concentration conditions which are restrictive for the yeast growing. However, some phenotypical alterations, such as cell cycle arrest, cell enlargement, and random budding, were also observed indicating that S. mansoni Rho GTPase could not complement suitably all functions performed by the wild type RHO1 GTPase of S. cerevisiae. The complementation results of a knockout S. cerevisiae strain with SMRHO gene along with sequence alignments made evident that a higher conservation of specific amino acid residues at á3-helix loop7 region of the S. mansoni Rho GTPase protein may explain the complementation seen even in high temperature and Ca2+ concentration conditions. Our results demonstrate that ESTs are a very versatile and efficient approach for gene discovery in the different developmental stages of the S. mansoni life cycle and that S. cerevisiae may be a powerful alternative for gene function investigations in this complex parasite.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Os objetivos específicos do trabalho foram os seguintes: caraterizar uma área endêmica para S. mansoni; identificar retrospectivamente os grupos de indivíduos susceptíveis e resistentes através da avaliação periódica da carga parasitária após o tratamento; traçar os perfis das respostas celulares dos dois grupos antes e após tratamento específico; determinar as alterações isotípicas de anticorpos específicos durante o período de observação.