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Doutoramento em Biomedicina Protein synthesis is central to life and is being intensively studied at various levels. The exception is mRNA translational fidelity whose study has been hampered by technical difficulties in detecting amino acid misincorporations in proteins. Few genes have so far been associated to the control of protein synthesis fidelity and it is unclear how many genes control this biological process. We investigated the role of RNA modification by RNA modifying enzymes (RNAmods) in protein synthesis efficiency and accuracy. Our hypothesis was that RNAmods that modify tRNA nucleosides (tRNAmods) have a significant impact on protein synthesis through modulation of codonanticodon interactions. To address this issue, we focused our work on tRNAmods involved in the modification of tRNA anticodons. The biology of these enzymes is still poorly understood, but they are involved in RNA processing, stability and function and their deregulation is associated with cancer, neurodegenerative, metabolic and other diseases. We have set up a yeast genetic screen and used mass-spectrometry methods to determine the role of tRNAmods on proteome homeostasis. Our work identified a subgroup of yeast tRNAmods that play essential roles in protein synthesis fidelity and folding. The genes that encode insoluble proteins isolated from yeast cells lacking U34 modification were enriched in codon sites that are decoded by the hypomodified tRNAs. These aggregated proteins also participate in specific biological processes, suggesting that tRNAmods are linked to specific physiological pathways. Interestingly, we detected amino acid misincorporations at the codon sites decoded by the anticodons of the hypomodified tRNAs, demonstrating that tRNA U34 modifications control translational error rate. A síntese proteica é central para a vida e tem sido extensivamente estudada a vários níveis. Contudo, o estudo da fidelidade da tradução do mRNA tem progredido lentamente devido a dificuldades técnicas na deteção de incorporações incorretas de aminoácidos nas proteínas. Poucos genes têm sido associados com o controlo da fidelidade da síntese proteica e não é evidente quais os genes que controlam este processo biológico. Nesta tese investigámos o papel da modificação dos nucleósidos do RNA na eficiência e precisão da síntese proteica. A nossa hipótese é que as enzimas que modificam nucleósidos do tRNA (tRNAmods) têm um impacto significativo na síntese proteica através da modulação das interações codão-anticodão. A biologia das tRNAmods e das modificações do tRNA são ainda pouco conhecidas, mas estão envolvidas na estabilidade e função do RNA e mutações nos seus genes causam doenças neurodegenerativas, metabólicas, cancro, entre outras. Neste projeto realizámos um rastreio genético em levedura com o objetivo de identificar tRNAmods que asseguram a homeostase do proteoma (proteostase) e usámos espectrometria de massa para clarificar o papel das tRNAmods na fidelidade da síntese proteica. Os resultados do estudo genético mostram que um sub-grupo de tRNAmods envolvidas na modificação de nucleósidos do anticodão do tRNA são essenciais para manter a estabilidade do proteoma. Outras tRNAmods estudadas não produziram impactos visíveis na proteostase. Os genes de proteínas agregadas que isolámos a partir de células de levedura com tRNAs hipomodificados são enriquecidos em codões descodificados por estes tRNAs. Os nossos dados mostram também que tais proteínas participam em processos biológicos específicos e têm níveis de aminoácidos errados mais elevados que as células wild-type. Estes dados mostram que certas modificações do tRNA são essenciais para a fisiologia celular, estabilidade do proteoma e fidelidade da síntese proteica.

Mestrado em Biotecnologia Molecular Um conhecimento alargado sobre o impacto de erros de tradução do mRNA pode ajudar a compreender a biologia do stress proteotóxico. A inserção de um tRNA ambíguo (tRNACAG Ser) em Saccharomyces cerevisiae permitiu obter um sistema celular modelo para o estudo do impacto de uma elevada taxa de erro de tradução em células eucarióticas. Estes erros estão associados à acumulação de proteínas agregadas que destabilizam a homeostase celular. Neste trabalho estudaram-se 6 estirpes diferentes de Saccharomyces cerevisiae, submetendo-as a diferentes tipos de stress externos e testando vários parâmetros celulares, nomeadamente: o nível de ROS intracelular, alterações de ploidia e expressão genética. Estes erros não conferiram aumento de resistência a stresses ambientais e verificou-se que em geral provocaram aumento de stress oxidativo. A nível da ploidia foram registadas alterações, apresentando-se o estado diplóide como o mais estável nestas estirpes. No que toca ao estudo expressão genética, conseguiu-se encontrar uma resposta comum entre estirpes. Com este trabalho surgiram novas questões sobre o impacto dos erros da síntese proteica na célula, sendo necessários mais testes para caracterizar a resposta ao stress proteotóxico induzido por erros de tradução. The study of mRNA mistranslation may is likely to contribute to elucidate the biology of the proteotoxic stress. The insertion of an ambiguous tRNA (tRNACAG Ser) in Saccharomyces cerevisiae produced a model system for studying the impact of proteic synthesis errors in eukaryotic cells. In this work, we have studied 6 different strains of Saccharomyces cerevisiae, by subjecting them to several stressors and testing several cellular parameters, namely: intracellular ROS, ploidy changes and gene expression. Mistranslation did not confer an increased resistance to environmental stresses but an increase in oxidative stress was common to all strains. Mistranslation increased ploidy turning N to 2N with the production of aneuploidy cells. The genomic effects of mistranslation were similar to all strains. New questions have arisen about the impact of mistranslation on the cell and additional studies are required to fully characterize the stress response induced by mistranslation.

Mestrado em Biotecnologia Molecular Submitted by Nuno Cruz (nuno@ua.pt) on 2013-07-08T11:42:34Z No. of bitstreams: 1 dissertação.pdf: 2822200 bytes, checksum: ed56bbd3253be8a11210d5eb59728cf3 (MD5) Made available in DSpace on 2013-07-08T11:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação.pdf: 2822200 bytes, checksum: ed56bbd3253be8a11210d5eb59728cf3 (MD5) Previous issue date: 2012-12-17