Search

Vlinderbloemige planten hebben een bijzondere manier om in grond die weinig gebonden stikstof bevat toch hiervan voorzien te worden. In een speciaal orgaan, de wortelknol, kunnen ze bepaalde bodem bacteriën huisvesten, dit zijn de zogenaamde Rhizobium bacteriën. Deze rhizobia zijn op hun beurt in staat stikstof uit de lucht te reduceren tot ammonium, dat in deze vorm gebruikt kan worden door de plant. Dit is een erg goedkope en milieuvriendelijke vorm van bemesting en vanuit dit oogpunt de moeite waard om te onderzoeken, daarnaast kan onderzoek aan deze knolletjes waardevolle informatie opleveren over orgaanvorming in het algemeen.Het proces van knolvorming begint wanneer de rhizobia door middel van chemotaxis naar de wortels gaan. Rhizobia moeten daartoe eerst flavonoiden herkennen die door de plant uitgescheiden worden. Als reactie scheiden de rhizobia signaalstoffen uit die herkent worden door de plant. Wortelharen reageren het eerst door te gaan krullen en vormen op die manier een zakje waarin de rhizobia opgesloten raken. Van hieruit dringen de bacteriën de wortelhaar binnen via een buisje, de infectiedraad. Deze draden groeien naar de worte1cortex. Ondertussen zijn sommige cellen in de wortelcortex gaan delen en vormen een knol-primordium. Wanneer de rhizobia dit primordium bereiken, dringen ze de cellen binnen, waarna het primordium verder kan uitgroeien en differentiëren tot een wortelknol.Met behulp van genetische technieken zijn verschillende Rhizobium genen geïdentificeerd, die betrokken zijn bij het proces van knolvorming. Zo zijn er nu genen (dit is er vaak maar één) bekend van rhizobia die betrokken zijn bij de herkenning van signaal stoffen van de plant. Verder zijn er genen geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor de vorming van signaalstoffen (Nodfactoren) die rhizobia maken om door te plant herkend te worden.Voor het vinden van plantengenen die bij dit proces zijn betrokken zijn twee verschillende benaderingen gebruikt. Enerzijds zijn er mutanten gemaakt die verstoord zijn in de vorming van wortelknollen en een aantal hiervan zijn nu gekloneerd maar daarnaast is ook gekeken naar genproducten die in de knol in hogere concentratie aanwezig zijn dan elders.Hoewel mogelijk verwacht kon worden dat beide benaderingen tot dezelfde resultaten zouden moeten leiden, bleek dit allerminst het geval: geen van de genen die geïnduceerd worden tijdens knolvorming (nodulines), zijn teruggevonden in de genetische analyses. Om de rol van deze nodulines te bestuderen en om te kijken of ze wel essentieel zijn tijdens knolvorming, hebben wij er in deze studie één geselecteerd, ENOD40. Dit gen komt in een zeer vroeg stadium van het hele knolvonningsproces tot expressie en codeert bovendien voor een peptide, hetgeen weinig voorkomt in planten.Om de expressie van het gen precies te kunnen bepalen, hebben we in hoofdstuk 2 de expressie van ENOD40 in de tijd gevolgd. Hieruit blijkt dat het gen actief is zelfs voordat het primordium gevormd wordt. Het lijkt er dus op dat ENOD40 betrokken kan zijn bij het doorgeven van het signaal dat tot celdeling leidt. Een duidelijke aanwijzing hiervoor is ook dat het kunstmatig tot expressie brengen van ENOD40 in de wortel extra celdeling geeft. Omdat de expressie van ENOD40 al geïnduceerd wordt door het toedienen van gezuiverde Nod-factoren (de bacteriële signaalstoffen), lijkt het mogelijk dat ENOD40 onderdeel is van het mechanisme waardoor Nod-factoren celdeling in de wortelcortex kunnen induceren. ENOD40 is ook interessant omdat het codeert voor een peptide. In de meeste gevallen bevat het boodschapper RNA van een gen een zogeheten open leesraam dat de code bevat voor een eiwit. In het transcript van ENOD40 zijn echter geen lange open leesramen te vinden, zodat er geen grote eiwitten van afgelezen kunnen worden. Wanneer ENOD40 genen van verschillende planten worden vergeleken, blijkt dat slechts twee kleine delen van dit gen geconserveerd zijn. Deze hebben we box! en box2 genoemd. Door chimaere constructen te maken met een gen dat codeert voor een groen fluorescerend eiwit (GFP), hebben we laten zien dat box! wel en box2 niet vertaald wordt in een eiwit. Ook andere experimenten hebben laten zien dat box! vertaald wordt.Eerder werd al gesuggereerd dat box2 dan mogelijk een functie heeft in het reguleren van de vertaling van box!. Om deze hypothese te testen, hebben we twee typen transgene planten geconstrueerd. In één type is een artificieel ENOD40 gen gebracht waarin een rood fluorescerend eiwit (RFP) is gefuseerd met het box1-peptide en box2 verwijderd is. In het andere type is in het artificiële ENOD40 gen alleen het RFP eiwit gefuseerd met het box!peptide. Vervolgens hebben we gekeken of het wel of niet aanwezig zijn van box2, invloed had op de hoeveelheid RFP die gevormd werd in de plant. Het bleek dat het verwijderen van box2 een toename gaf van box!-RFP in de plant. Omdat de hoeveelheid transcript niet veranderde door deze deletie, komen we tot de conclusie dat box2 een represserend effect heeft op de translatie van box!. Deze regulerende werking van box2 is opnieuw een aanwijzing dat box! inderdaad codeert voor een peptide.Om te kijken wat de functie van ENOD40 is, zijn verschillende onderzoekers op zoek gegaan naar moleculen waarmee ENOD40 in contact komt in de plantencel. Met behulp van een verscheidenheid aan technieken zijn al een aantal van deze moleculen geïdentificeerd. Zo is er in erwtenknollen een gen gevonden waarvan het product in een two-hybrid screen een interactie laat zien met het peptide. Verder is er in soya aangetoond dat sucrose synthase kan binden aan het peptide en dat deze binding phophorilatie van sucrose synthase kan verhinderen. Daarnaast is in Medicago truncatula een eiwit gevonden dat mogelijk bindt aan het transcript van ENOD40.Wij beschrijven in hoofdstuk 5 een andere benadering om een mogelijke partner van ENOD40 te vinden. Door de genomen van uiteenlopende planten die een ENOD40 gen bevatten te vergelijken vonden we dat het gen DN40 altijd naast ENOD40 ligt. Een mogelijke reden voor zo'n koppeling kan een functionele interactie zijn. Echter, omdat de expressie van beide genen niet overeenkomt, lijkt het niet logisch dat ze een interactie met elkaar kunnen aangaan. Of de koppeling veroorzaakt wordt door een functionele interactie is dus niet duidelijk.Er zijn al diverse studies verricht naar de functie van ENOD40 tijdens knolvorming maar ook in andere processen. Artificiële expressie van ENOD40 in plantenwortels leidt tot celdelingen en de expressie van andere noduline genen, bovendien versnelde zo'n expressie het proces van knolvorming. Verder werd aangetoond dat uitschakeling van het gen het knolvormingsproces juist verhindert. Met soortgelijke technieken werd ook in andere processen dan knolvorming een activiteit van ENOD40 waargenomen. Zo lijkt ENOD40 betrokken bij de regulatie van zij scheut vorming in planten, hormoon interacties in tabakscellen, Mycorrhiza symbiose en ook bij de vorming van het embryo.Een verdere functionele karakterisering van het gen zou zeer gebaat zijn met de beschikbaarheid van ENOD40 mutanten. Door gebruik te maken van het 'mutator transposon system', konden we zo'n ENOD40 mutant identificeren in maïs. Natuurlijk had een mutant in een vlinderbloemige de voorkeur, maar omdat dergelijke 'transposon' systemen niet beschikbaar waren voor vlinderbloemigen, kozen we voor maïs. Hoewel maïs geen knollen maakt, kan het wel een symbiose aangaan met een bodemschimmel, Mycorrhiza. Bovendien konden we het effect van het uitschakelen van ENOD40 op algehele plantontwikkeling bestuderen. Hoewel de expressie van het gen nagenoeg afwezig was in de mutant, ontwikkelde de plant zich normaal en kon deze ook nog steeds een symbiose aangaan met Mycorrhiza. Een mogelijke oorzaak hiervan is dat de functie wordt overgenomen door een tweede ENOD40 gen een andere oorzaak kan zijn dat er wel een effect is maar dat wij dat niet gevonden hebben.Om ook de functie van ENOD40 in vlinderbloemigen te kunnen bestuderen, hebben we gebruik gemaakt van het RNAi systeem om de expressie van ENOD40 in Medicago truncatula uit te schakelen. Met deze techniek konden we de expressie van het gen tot ongeveer 20% van de normale intensiteit terugbrengen. Hoewel ENOD40 normaal ook in wortels tot expressie komt, leidt een reductie in ENOD40 expressie niet tot afwijkingen in wortelgroei structuur. Echter, het aantal knolletjes dat gevormd werd op de wortel nadat deze was geïnoculeerd met rhizobia, was ongeveer 2 tot 5 keer minder in vergelijking met wortels waar de expressie van ENOD40 niet was gereduceerd. Bovendien waren de knollen die gemaakt werden anders van vorm, normaal maakt Medicago langwerpige knollen, terwijl deze knolletjes juist meer bolvormig waren en veel kleiner. Toch konden we in deze knollen nog wel de specifieke weefsel organisatie van knollen herkennen. Dit duidt erop dat ENOD40 betrokken is bij het initiëren van knollen en de groei ervan. Het onderzoek dat hier beschreven is en de experimentele systemen die hiervoor zijn ontwikkeld, zijn een goed uitgangspunt om meer te weten te komen over de functie van ENOD40 tijdens wortelknolvorming en ook in andere processen.

Only a small number ofphytohormonesare sufficient to regulate virtually every aspect of plant growth and development. Hence, adequate communication betweenphytohormonesis important to coordinate cellular processes during development. In this thesis we show that the plant gene ENOD40 plays a role in the communication betweenphytohormonesignaling pathways.Mainly on the basis of its complex expression patterns, it has been suggested that ENOD40 could affect thephytohormonestatus of cells, thus participating in regulation of plant growth and development but direct evidence was lacking. We have developed bioassays to study the function of ENOD40 in relation tophytohormonesignaling, using tobacco BY-2 cell-cultures. In these filamentous cell suspensions, quantification of cell-growth and cell division is straightforward and these morphological growth parameters can be used to monitor responses tophytohormones. In wild-type cells that have no or very low levels of ENOD40 expression, both processes are by-en-large independent of each other. By quantifying the parameters cell-elongation growth and cell division frequency under variousphytohormoneregimes in transgenic, 35S: NtENOD40 containing, tobacco BY-2 cell suspensions, we showed that the relative rates of both cellular processes become coupled byoverexpressionof ENOD40 . Since elongation growth is regulated by ethylene and cell division by thecytokinin/auxinratio, our data indicate that ENOD40 is involved in cross-talk between ethylene,auxinandcytokinin.Furthermore, we present an overview of ENOD40 expression patterns and analyze the structure of ENOD40 transcripts. The transcripts are characterized by two short conserved nucleotide sequence regions, which both contain biological activity in the bio-assay, and one of the two regions encodes a remarkably shortoligopeptide.In conclusion, the observation that ENOD40 affectsphytohormoneresponses in BY-2 cells is consistent withspatio-temporal ENOD40 expression patterns, which correlates with developmental stages involving the activity ofphytohormones. We propose that coupling between cell division, cell growth and cell differentiation may be achieved by transient and local expression of plant factors like ENOD40 that are involved inphytohormonecross-talk pathways. The coupling of hormone responses may be crucial to many developmental programs, and this may explain the complexity of ENOD40 expression patterns and the variety of tissues with which ENOD40 expression is associated in different plant species.

Only a small number ofphytohormonesare sufficient to regulate virtually every aspect of plant growth and development. Hence, adequate communication betweenphytohormonesis important to coordinate cellular processes during development. In this thesis we show that the plant gene ENOD40 plays a role in the communication betweenphytohormonesignaling pathways.Mainly on the basis of its complex expression patterns, it has been suggested that ENOD40 could affect thephytohormonestatus of cells, thus participating in regulation of plant growth and development but direct evidence was lacking. We have developed bioassays to study the function of ENOD40 in relation tophytohormonesignaling, using tobacco BY-2 cell-cultures. In these filamentous cell suspensions, quantification of cell-growth and cell division is straightforward and these morphological growth parameters can be used to monitor responses tophytohormones. In wild-type cells that have no or very low levels of ENOD40 expression, both processes are by-en-large independent of each other. By quantifying the parameters cell-elongation growth and cell division frequency under variousphytohormoneregimes in transgenic, 35S: NtENOD40 containing, tobacco BY-2 cell suspensions, we showed that the relative rates of both cellular processes become coupled byoverexpressionof ENOD40 . Since elongation growth is regulated by ethylene and cell division by thecytokinin/auxinratio, our data indicate that ENOD40 is involved in cross-talk between ethylene,auxinandcytokinin.Furthermore, we present an overview of ENOD40 expression patterns and analyze the structure of ENOD40 transcripts. The transcripts are characterized by two short conserved nucleotide sequence regions, which both contain biological activity in the bio-assay, and one of the two regions encodes a remarkably shortoligopeptide.In conclusion, the observation that ENOD40 affectsphytohormoneresponses in BY-2 cells is consistent withspatio-temporal ENOD40 expression patterns, which correlates with developmental stages involving the activity ofphytohormones. We propose that coupling between cell division, cell growth and cell differentiation may be achieved by transient and local expression of plant factors like ENOD40 that are involved inphytohormonecross-talk pathways. The coupling of hormone responses may be crucial to many developmental programs, and this may explain the complexity of ENOD40 expression patterns and the variety of tissues with which ENOD40 expression is associated in different plant species.