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Objetivo. Determinar el número total y la topografía de la población de conos en roedores adultos utilizando rutinas automatizadas que nos permita investigar objetivamente los efectos de diferentes modelos experimentales de patologías humanas tales como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), retinosis pigmentaria (RP) y la neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) sobre la población de fotorreceptores. Material y métodos. Se han utilizado cinco cepas distinta de roedores: Sprague-Dawley (SD), Piebald Virol Glaxo (PVG) y la rata transgénica P23H-1, y ratones Swiss y C57/BL6. Todos los experimentos y procedimientos se han realizado bajo el estricto cumplimiento de las recomendaciones de la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)” y la “European Union guidelines for the use of animals in research”, y todos los procedimientos utilizados han sido previamente aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Murcia. Se han utilizado diferentes técnicas para el estudio histológico y morfológico y se han analizado en retinas montadas a plano y en secciones transversales; se han utilizado tecnologías de imagen avanzadas como la Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT)y se ha realizado análisis de proteínas mediante Western Blot. Como modelo de RP se ha utilizado la rata transgénica P23H-1, esta rata es portadora de una mutación autosómica dominante en el gen de la rodopsina que causa distrofia y muerte de los fotorreceptores. Se ha desarrollado un nuevo modelo experimental útil para la comprensión de la patología de la DMAE, la fototoxicidad localizada de los fotorreceptores tipo cono inducida por LED (FTIL). Por último se ha utilizado un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) inducida mediante láser que permite la evaluación de los efectos de la NOG sobre la población de fotorreceptores. Resultados. El número medio de conos que expresan la opsina-L es de 231.736 ± 14.517 en la rata SD; 239.939 ± 6.494 en la rata PVG; 117.424 ± 17.721 en el ratón Swiss y 135.155 ± 8.742 en el ratón C57/BL6. El número medio de conos que expresan la opsina-S es de 41.028 ± 5.074 en la rata SD; 27.316 ± 2.235 en la rata PVG; 146.682 ± 24.958 en ratones Swiss y 119.616 ± 8.756 en ratones C57/BL6. El porcentaje de conos duales en la rata SD es del 3,2%, del 2,9% en la PVG, de un 73% en el ratón Swiss y de un 40% en el C57/BL6. En todas las cepas de ambas especies existe un paralelismo en la distribución de las células ganglionares de retina (CGR) y los conos-L. La topografía de los conos-L en todas las cepas de rata y ratón analizadas es similar, se observan zonas de alta densidad en el eje nasotemporal superior, las densidades medias alrededor del nervio óptico y un descenso de densidad gradual desde las zonas centrales hacia las periféricas. Sin embargo, existen claras diferencias en la distribución de los conos-S entre las especies y cepas analizadas. El la rata P23H-1, la degeneración de los bastones ocurre antes que la de los conos y de forma rápida: primero con el acortamiento de los segmentos externos, a P30 existe una gran pérdida de bastones y a P180 la pérdida es prácticamente en la totalidad de la retina exceptuando la extrema periferia. La degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada, ocurre en forma de anillos que aparecen alrededor de P90 y se extiende por toda la retina. A P180, los anillos de degeneración son más abundantes en la retina ecuatorial y de mayor tamaño en la retina dorsal. En un nuevo modelo in vivo de fototoxicidad focal de los fotorreceptores inducido por LED, la SD-OCT muestra un daño en una región circular situado en la retina superotemporal. En esta región se observa una disminución progresiva del espesor de la retina desde 183,4 ± 5 mm (12 h) hasta 114,6 ± 6 mm (7 d). Las secciones transversales muestras una pérdida masiva de bastones y conos en la región dañada por la luz. En las retinas montadas a plano se observa una región circular con disminución del número de conos-L y conos-S. En este área circular en las retinas izquierdas y en la región correspondiente de la retina control derecha, el número total de conos-L o conos-S es de 7.118 ± 842 ó 661 ± 125 en las retinas fotoexpuestas (n=7) y de 14.040 ± 1.860 ó 2.255 ± 193 en las retinas control (n=7), respectivamente. Aunque el CNTF no, la brimonidina, el BDNF, PEDF y el bFGF muestran efectos neuroprotectores significativos sobre los conos-L y conos-S. La HTO provoca sectores con su vértice en el disco óptico carentes de CGR Brn3a pero que aún contienen gran número de núcleos DAPI positivos. Los niveles de todas las opsinas disminuyen a las 2 semanas y esta disminución progresa hasta el 20% de los niveles basales a los 3 meses. Las secciones transversales revelan áreas focales de degeneración en las capas externas de la retina (CER). Las CGR supervivientes a los 15 días representan aproximadamente el 28% y no cambian con el tiempo, mientras que de las poblaciones de conos-L y conos-S sobreviven un 80% y un 65% a un mes o un 35% y un 20% a 6 meses, respectivamente. Conclusiones. Se ha establecido, por primera vez, el número total y la distribución topográfica de los conos-L y conos-S en dos cepas de rata y dos de ratón y se ha demostrado el paralelismo topológico de la distribución de los conos-L y las CGR. Se han proporcionado las bases para estudiar la degeneración de conos y su prevención en condiciones patológicas. Se ha descrito por primera vez que, en la rata P23H-1, la degeneración de bastones y conos está espaciotemporalmente relacionada y se produce en anillos. La pérdida de conos sigue a la pérdida de bastones, que comienza de forma temprana, incluso antes de P30, la primera edad analizada. Las características de los anillos sugieren que la degeneración secundaria de conos está influenciada por la localización en la retina y / u otros factores intrínsecos o extrínsecos. Se ha evidenciado que la FTIL provoca una pérdida de conos y bastones y es un modelo fiable, cuantificable y reproducible para estudiar la degeneración de los fotorreceptores. La administración intravítrea de BDNF, PEDF o bFGF, o la administración tópica de brimonidina proporcionan neuroprotección significativa sobre los conos, en este modelo. Se ha demostrado que la HTO induce una pérdida selectiva de CGR en la capa de la CGR que no progresa después de 1 mes, mientras que los conos-L y conos-S presentan una pérdida progresiva hasta los 6 meses. Por lo tanto, HTO provoca graves daños tanto en las capas más internas como en las CER., Purpose. To determine the total number and topography of the cone population in two rat and two mouse strains using automated routines which allowed us to investigate objectively the effects of different experimental models of human pathologies such as Aging Macular Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP) and Glaucomatous Optic Neuropathy (GON) on the photoreceptor population. Material y methods. A total of 303 rats and 23 mice were used in this thesis, five different strains of rodents were used: albino Sprague-Dawley (SD), pigmented Piebald Virol Glaxo (PVG) and P23H-1 transgenic rats, albino Swiss and pigmented C57/BL6 mice. All experimets and procedures were carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) and the European Union guidelines for the use of animals in research, and all the protocols were approved by the Ethical and Animal Studies Committee of the University of Murcia. Several techniques such as, the identification of the three different types of photoreceptors and other retinal populations by immunohistofluorescence analyzed in whole flat-mounted retinas and in oriented radial sections, classical staining as H-E, imaging advanced technologies as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), and protein analysis by western blot, have been used. In this thesis the P23H-1transgenic rat has been used as a model of RP, this animal bears an autoasomal dominat mutation in the rhodopsin gene (proline to histidine substitution at codon 23 of the rodopsin protein) that causes photorecptor dystrophy and death. A new experimental model useful to understand the AMD pathology, has been developed for this thesis, Light Emmitting Dioede (LED)-induced cone-photoreceptor phototoxicity (LIP), the blue-light LED exposition on the rat retina causes a damage-area located in the retinal zone with maximun L-cones densities and a cone to rod ratio similar to the human macular fovea. And finally, an experimental model of Laser-induced ocular hypertension developed recently in our Laboratory of Experimental Ophthalmology at the University of Murcia has been used to understand the effects of GON on the cone population. Results. The mean number of L-opsin+cones is 231,736 ± 14,517 in SD rat; 239,939 ± 6,494 in PVG rat; 117,424 ± 17,721 in Swiss mouse and 135,155 ± 8,742 in C57/BL6 mouse. The mean number of S-opsin+cones 41,028 ± 5,074 in SD rat; 27,316 ± 2,235 in PVG rat; 146,682 ± 24,958 in Swiss mouse and 119,616 ± 8,756 in C57/BL6 mouse. The percentage of dual cones is 3.2% in SD rat; 2.9% in PVG rat; 73% in Swiss mouse and 40% in C57/BL6 mouse. In all strains, and both species, there is a parallel distribution of retinal ganglion cells (RGC) and L-cones. The topography of L-cones is similar in all strains of rats and mice analyzed, the highest densities are observed in the superior nasotemporal axis, medium densities around the optic nerve, and this density gradually decreases from the center to the periphery. However, obvious differences are found in S-cones distribution. While in the two rat strains there is a increasing gradient of S-cones density along the inferonasal quadrant and the highest densities are found in the retinal rim, in the Swiss mouse strains S-cones are abundant in the dorsal retina although their highest densities are ventral but the C57/BL6 mouse shows a low number of S-cones in the dorsal retina and very dense population in the ventral retina, being densest in its nasal aspect. In P23H-1 rats, rod degeneration occurs rapidly: first the rod outer segment shortens, at P30 there is extensive rod loss, and by P180 rod loss is almost complete except for the most peripheral retina. The numbers of L cones are, at all postnatal ages, lower in P23H-1 rats than in control SD rats, and decrease significantly with age (by P180). Rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings that appear already at P90 and spread throughout the entire retina. At P180, the rings of rod-cone degeneration are more abundant in the equatorial retina and are larger in the dorsal retina. In a novel in vivo model of focal LED-induced photoreceptor phototoxicity SD-OCT showed damage in a circular region of the superotemporal retina, whose diameter varied from 1,842.4 ± 84.5 mm (at 24 hours) to 1,407.7 ± 52.8 mm (at 7 days). This region had a progressive thickness disminution from 183.4 ± 5 mm (at 12 h) to 114.6 ± 6 mm (at 7 d). Oriented cross-sections showed within the light-damaged region of the retina massive loss of rods and cone-photoreceptors. Wholemounts documented a circular region containing lower numbers of L- and S-cones. Within a circular area (1 mm or 1.3 mm radius, respectively) in the left and in its corresponding region of the contralateral-fellow-retina, total L- or S-cones were 7,118 ± 842 or 661 ± 125 for the LED exposed retinas (n=7) and 14,040 ± 1,860 or 2,255 ± 193 for the fellow retinas (n=7), respectively. Brimonidine, BDNF, PEDF and bFGF but not CNTF showed significant neuroprotective effects on L- and S-cones. Ocular hypertension (OHT) resulted in wedge-like sectors with their apex on the optic disc devoid of Brn3aRGC but with large numbers of DAPI+nuclei. The levels of all opsins diminished by 2 weeks and further decreased to 20% of basal-levels by 3 months. Cross-sections revealed focal areas of outer retinal layers (ORL) degeneration. RGC survival at 15 days represented approximately 28% and did not change with time, whereas the L-cone and S- populations diminished to 80% and 65%, or to 35% and 20% at 1 or 6 months, respectively. Conclusions. It has been established, for the first time, the total number and the topographical distribution of S- and L-cones in two rat and two mouse strains and demonstrated the correlation of L-cones and RGC spatial distribution. It has been provided the basis to study cone degeneration and its prevention in pathologic conditions. It has been described for the first time that in the P23H-1 rat, rod and cone degeneration is spatiotemporally related and occurs in rings. Cone loss follows rod loss and starts very soon, even before P30, the first age analyzed here. The characteristics of the rings suggest that secondary cone degeneration is influenced by retinal position and/or other intrinsic or extrinsic factors. It has been evidenced that LIP results in rod and cone-photoreceptor loss, and is a reliable, quantifiable model to study cone-photoreceptor degeneration. Intravitreal BDNF, PEDF or bFGF, or topical BMD afford significant cone neuroprotection in this model. It has been demostrated that OHT induces in the ganglion cell layer selective RGC loss that does not progress after 1 month, whereas the S- and L-cones exhibit progressive loss up to 6 months. Thus, OHT results in severe damage to both the innermost and the ORL.

Objetivos • Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. • Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p, Objetives • Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. • Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal–Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann–Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p

La retina es un tejido nervioso que parece tener una mayor tolerancia ante situaciones de hipoxia que el resto del sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, las consecuencias funcionales derivadas de la privación de flujo sanguíneo son graves y en la mayoría de los casos irreversibles. Se han realizado numerosas investigaciones con el fin de conocer las alteraciones morfológicas y funcionales de la retina ante situaciones de isquemia de diferente intensidad, sin embargo se carecen de … [+]estudios que caractericen específicamente el comportamiento de las células ganglionares de la retina (GCR) ante la isquemia utilizando métodos que nos permiten cuantificar la muerte de las (GCR). Queremos determinar su grado de tolerancia ante la isquemia, y estudiar el patrón de muerte de estas células tras someterlas a diferentes periodos de isquemia transitoria basándonos en técnicas neuroanatómicas. Hemos marcado las CGR con un trazador neuronal fluorescente, el fluoro-Gold, que aplicado en los principales núcleos de proyección de la vía óptica de la rata adulta nos ha permitido distinguir y diferenciar las CGR

Cuando la luz viaja a través del ojo para formar la imagen retiniana se ve afectada por los medios ópticos de forma que el objeto y la imagen nunca pueden ser idénticos. La luz se dispersa según una función, característica de cada sistema óptico, la función de dispersión de punto (PSF) que depende básicamente de tres fenómenos: la difracción, las aberraciones y el scattering, cada uno afectando la PSF de un modo distinto. La difracción, aunque en realidad es un fenómeno general que describe el cambio de dirección de la luz cuando encuentra un obstáculo físico, en la óptica fisiológica se refiere a la difracción de la luz en la pupila. Las aberraciones, por otro lado, describen cualquier desviación del sistema óptico perfecto, o cualquier desviación de la aproximación paraxial. En las últimas dos décadas, las aberraciones oculares de bajo y alto orden se han medido de manera efectiva y se han corregido con éxito utilizando la óptica adaptativa. Tanto la difracción como las aberraciones, afectan principalmente a la parte central de la PSF, que está relacionada con las características de alta frecuencia, o los detalles de la imagen. La difracción y las aberraciones degradan la imagen de la retina que afecta la agudeza visual y la sensibilidad al contraste. El scattering se refiere a la dispersión de la luz debido a las estructuras de aproximadamente 10 micrómetros o menos, y afecta no solo a la zona central, pero a la zona periférica de la PSF también. Por lo tanto, contrariamente a la difracción y las aberraciones, los efectos de la dispersión en la imagen afectan igual a las frecuencias más bajas, y se percibe como una pérdida de contraste que depende en gran medida del rango dinámico de la imagen, o de la presencia de fuentes de resplandor (¨glare sources¨). El scattering aumenta con la edad y especialmente en los pacientes con cataratas y puede conducir a una pérdida severa de contraste. La PSF afecta de la misma manera a la visión y a la formación de imágenes del fondo del ojo, a pesar de que la retina y los procesos que tienen lugar en nivel neural puedan compensar parcialmente los errores de la visión. El objetivo de esta tesis es estudiar el efecto del scattering en la visión y en la obtención de imágenes de la retina. El primer paso fue construir un modelo teórico del fondo de ojo y simular, usando técnicas Monte Carlo, la difusión de la luz en el fondo del ojo con diferentes longitudes de onda, y su dependencia con la pigmentación. Se demostró que existe una fuerte dependencia de la difusión en el fondo del ojo con la longitud de onda, con una reflectancia aproximadamente 10 veces más alta en longitudes de onda más largas. Además, se observó una dependencia de la difusión del fondo de ojo en los cambios con la pigmentación, únicamente para las longitudes de onda más largas, mientras que las longitudes de onda medianas no se vieron afectados. Además, la difusión en el fondo se comparó con el scattering producido en la óptica del ojo y el rango espacial de cada fenómeno. El estudio mostró que para longitudes de onda intermedias la difusión es dominante hasta aproximadamente 2 grados de ángulo visual, mientras que para las longitudes de onda más largas pueden dominar hasta los 4 grados. Se investigó el efecto de la difusión del fondo de ojo en la visión. En primer lugar, usando una técnica óptica, se cuantificó la luz difundida en el fondo del ojo para diferentes condiciones espaciales en verde (550 nm) y rojo (650 nm) midiendo la reflectancia del fondo de ojo para 6 sujetos agrupados según su pigmentación. Se encontró un aumento significativo en la reflectancia en los sujetos con más pigmentación para las longitudes de onda más largas, en línea con las simulaciones y estudios anteriores. En segundo lugar, se construyó un sistema psicofísico, basado en el método de Heterochromatic Flicker Photometry (HFP), para medir la sensibilidad en verde y rojo para dos condiciones espaciales distintas. Las medidas ópticas se compararon con las medidas psicofísicas donde se observó un aumento de la sensibilidad con la reflectancia del fondo de ojo, consistentes en todos los sujetos. Dado que la reflectancia del fondo de ojo depende de la pigmentación, los individuos de pigmentación baja muestran una sensibilidad al color rojo mayor. En la otra parte de la tesis, se estudió el scattering en los medios oculares, centrando en el efecto de la dispersión en la imagen del fondo. Para este propósito, un sistema óptico se construyó, basado en el principio de doble paso, capaz de adquirir imágenes del fondo ocular a diferentes longitudes de onda y tamaños de campo. El método completo se probó y validó primero en una configuración en paso simple, donde el scattering se introdujo por medio de filtros. La reconstrucción de la PSF completa se realizó en 7 sujetos utilizando el método de integración óptica suponiendo una PSF basada en la CIE glare function. Se registraron imágenes del fondo a diferentes longitudes de onda y la imagen original se reconstruyó aplicando un método de ¨enhancing¨ de contraste usando con la PSF reconstruida. Se demostró que la compensación de scattering puede mejorar significativamente el contraste de la imagen. El nivel de mejora depende no sólo de la cantidad de scattering para la longitud de onda específica, sino también del rango dinámico de la imagen del fondo. Se encontró una mejora de alrededor del 10 % para la configuración específica. El método de compensación de scattering se aplicó en el caso de la medida de la densidad óptica del pigmento macular (MPOD) usando imágenes retinianas. Según este método se tomaron dos imágenes de fondo de ojo, una a la longitud de onda donde el pigmento macular no absorbe y otra a una longitud de onda en el que muestra su pico de absorción y se extrajo la MPOD usando una fórmula matemática. El cálculo se hizo antes y después de aplicar el algoritmo de compensación de scattering para 6 sujetos y se midió una subestimación media de la MPOD de aproximadamente un 10 %. Por último, para probar los resultados con un método ya conocido de MPOD se construyó un sistema adicional psicofísico, basado en el método de HFP, que está afectado únicamente a un pequeño grado de scattering. Se observó una buena correlación entre los dos métodos que aumenta cuando el scattering se compensa., When light travels through the eye to form the retinal image, it is affected by the optical media in a number of ways, such that the object and image space can never be identical. The light is spread according to a function, characteristic of the system, called the Point Spread Function (PSF) and it depends on three main phenomena: diffraction, aberrations and scattering, each one of them with different effects. Diffraction, although in reality a very general effect describing essentially the redirection of the light when meeting an obstacle, in physiological optics usually refers to diffraction at the pupil. %This simplifies the description of the phenomenon, making it possible to approximate its effect with a simple formula. Aberrations, on the other hand, is a more general term describing any deviation from the perfect model, or any deviation from the paraxial approximation. In the last two decades, low and high order ocular aberrations have been successfully measured and corrected using adaptive optics. Both diffraction and aberrations affect mainly the central part of the PSF, that is related to the high frequency features, or the details of the image. Diffraction and aberrations degrade the retinal image affecting visual acuity and contrast sensitivity. Scattering refers to the spreading of the light due to structures of about 10 microns or less, and it is not restricted to the central part of the PSF but affects its wide-angle parts as well. Therefore, contrary to diffraction and aberrations, scattering also affects low frequencies and it is perceived as a loss of contrast which depends heavily on the dynamic range of the image, or the presence of glare sources. Scattering increases with age and especially in cataract patients and can lead to a severe contrast loss. The PSF affects in exactly the same way, both vision and fundus imaging, although the retina and the processes taking place at a neural level can partially compensate the errors for vision. The purpose of this thesis is to study the effect of scattering in vision and in fundus imaging. The first step was to build a theoretical fundus model and quantify light diffusion in the fundus at different wavelengths and its dependence on the melanin pigmentation, simulating realistic pigmentation values found in a normal population. It was shown that there is a strong dependence of fundus diffusion on wavelength, with even 10 times higher reflectance or more at longer wavelengths. Moreover, a dependence of fundus diffusion was observed on changes in melanin pigmentation but only for longer wavelengths, whereas medium wavelengths were unaffected. Additionally, fundus diffusion was compared to scattering in the optical media and the spatial dominance of each phenomenon was studied. The study showed that for medium wavelengths diffusion is dominant to up to about 2 degrees of visual angle, whereas for longer wavelengths the domain of dominance increases to 4 degrees. The effect of fundus diffusion in vision was investigated. Firstly, using an optical technique, diffused light in the fundus was quantified for different spatial conditions at green (550nm) and red (650nm) through the measurement of fundus reflectance for 6 subjects grouped according to their melanin pigmentation. There was a significant increase in reflectance at light pigmentation subjects for longer wavelengths, which was in line with previous simulations and studies. Secondly, a psychophysical setup based on the Heterochromatic Flicker Photometry (HFP) method was built and the green to red color sensitivity for two different spatial conditions was measured. The measurements of the optical system were then compared to the psychophysical ones where an increase in sensitivity with fundus reflectance was observed, consistent in all subjects. Consequently, since fundus reflectance depended on pigmentation, light pigmentation individuals have an increased red to green color sensitivity. In the other part of the thesis, the focus was shifted towards the study of scattering in the ocular media, with the center of attention being the effect of scattering in fundus imaging. For this purpose, an optical setup was built based on the double-pass principle, capable of acquiring fundus images at various wavelengths and field sizes. The complete method was first tested and validated in a single-pass setup where scattering was introduced by a scatter filter. The reconstruction of the wide angle PSF was done for 7 subjects using the method of optical integration assuming a PSF based on the CIE glare function. Fundus images at different wavelengths were acquired for the subjects and the original intensity map of the image was reconstructed by applying a custom contrast enhancement method using the reconstructed PSF. It was shown that this scattering compensation technique can significantly improve the contrast of the image. The improvement depended not only on the amount of scatter for the specific wavelength but also on the dynamic range of the fundus. An improvement of about 10% was found for the specific setup. The scattering compensation method was applied in the case of the Macular Pigment Optical Density (MPOD) measurement using reflectometry. In this method two fundus images were taken, one at wavelength where macular pigment does not absorb and another at a wavelength where it shows its peak absorption and the MPOD was extracted using the pixel intensities of the two images. The calculation was done both before and after applying the scattering compensation algorithm for 6 subjects and an average MPOD underestimation of about 10% was observed. Finally, in order to test the results against a proven MPOD measurement, a psychophysical setup was built, based on the HFP method, which is affected only to a small degree by scattering. A very good correlation between the two methods was observed and the agreement increased when scattering was compensated.

Cuando la luz viaja a través del ojo para formar la imagen retiniana se ve afectada por los medios ópticos de forma que el objeto y la imagen nunca pueden ser idénticos. La luz se dispersa según una función, característica de cada sistema óptico, la función de dispersión de punto (PSF) que depende básicamente de tres fenómenos: la difracción, las aberraciones y el scattering, cada uno afectando la PSF de un modo distinto. La difracción, aunque en realidad es un fenómeno general que describe el cambio de dirección de la luz cuando encuentra un obstáculo físico, en la óptica fisiológica se refiere a la difracción de la luz en la pupila. Las aberraciones, por otro lado, describen cualquier desviación del sistema óptico perfecto, o cualquier desviación de la aproximación paraxial. En las últimas dos décadas, las aberraciones oculares de bajo y alto orden se han medido de manera efectiva y se han corregido con éxito utilizando la óptica adaptativa. Tanto la difracción como las aberraciones, afectan principalmente a la parte central de la PSF, que está relacionada con las características de alta frecuencia, o los detalles de la imagen. La difracción y las aberraciones degradan la imagen de la retina que afecta la agudeza visual y la sensibilidad al contraste. El scattering se refiere a la dispersión de la luz debido a las estructuras de aproximadamente 10 micrómetros o menos, y afecta no solo a la zona central, pero a la zona periférica de la PSF también. Por lo tanto, contrariamente a la difracción y las aberraciones, los efectos de la dispersión en la imagen afectan igual a las frecuencias más bajas, y se percibe como una pérdida de contraste que depende en gran medida del rango dinámico de la imagen, o de la presencia de fuentes de resplandor (¨glare sources¨). El scattering aumenta con la edad y especialmente en los pacientes con cataratas y puede conducir a una pérdida severa de contraste. La PSF afecta de la misma manera a la visión y a la formación de imágenes del fondo del ojo, a pesar de que la retina y los procesos que tienen lugar en nivel neural puedan compensar parcialmente los errores de la visión. El objetivo de esta tesis es estudiar el efecto del scattering en la visión y en la obtención de imágenes de la retina. El primer paso fue construir un modelo teórico del fondo de ojo y simular, usando técnicas Monte Carlo, la difusión de la luz en el fondo del ojo con diferentes longitudes de onda, y su dependencia con la pigmentación. Se demostró que existe una fuerte dependencia de la difusión en el fondo del ojo con la longitud de onda, con una reflectancia aproximadamente 10 veces más alta en longitudes de onda más largas. Además, se observó una dependencia de la difusión del fondo de ojo en los cambios con la pigmentación, únicamente para las longitudes de onda más largas, mientras que las longitudes de onda medianas no se vieron afectados. Además, la difusión en el fondo se comparó con el scattering producido en la óptica del ojo y el rango espacial de cada fenómeno. El estudio mostró que para longitudes de onda intermedias la difusión es dominante hasta aproximadamente 2 grados de ángulo visual, mientras que para las longitudes de onda más largas pueden dominar hasta los 4 grados. Se investigó el efecto de la difusión del fondo de ojo en la visión. En primer lugar, usando una técnica óptica, se cuantificó la luz difundida en el fondo del ojo para diferentes condiciones espaciales en verde (550 nm) y rojo (650 nm) midiendo la reflectancia del fondo de ojo para 6 sujetos agrupados según su pigmentación. Se encontró un aumento significativo en la reflectancia en los sujetos con más pigmentación para las longitudes de onda más largas, en línea con las simulaciones y estudios anteriores. En segundo lugar, se construyó un sistema psicofísico, basado en el método de Heterochromatic Flicker Photometry (HFP), para medir la sensibilidad en verde y rojo para dos condiciones espaciales distintas. Las medidas ópticas se compararon con las medidas psicofísicas donde se observó un aumento de la sensibilidad con la reflectancia del fondo de ojo, consistentes en todos los sujetos. Dado que la reflectancia del fondo de ojo depende de la pigmentación, los individuos de pigmentación baja muestran una sensibilidad al color rojo mayor. En la otra parte de la tesis, se estudió el scattering en los medios oculares, centrando en el efecto de la dispersión en la imagen del fondo. Para este propósito, un sistema óptico se construyó, basado en el principio de doble paso, capaz de adquirir imágenes del fondo ocular a diferentes longitudes de onda y tamaños de campo. El método completo se probó y validó primero en una configuración en paso simple, donde el scattering se introdujo por medio de filtros. La reconstrucción de la PSF completa se realizó en 7 sujetos utilizando el método de integración óptica suponiendo una PSF basada en la CIE glare function. Se registraron imágenes del fondo a diferentes longitudes de onda y la imagen original se reconstruyó aplicando un método de ¨enhancing¨ de contraste usando con la PSF reconstruida. Se demostró que la compensación de scattering puede mejorar significativamente el contraste de la imagen. El nivel de mejora depende no sólo de la cantidad de scattering para la longitud de onda específica, sino también del rango dinámico de la imagen del fondo. Se encontró una mejora de alrededor del 10 % para la configuración específica. El método de compensación de scattering se aplicó en el caso de la medida de la densidad óptica del pigmento macular (MPOD) usando imágenes retinianas. Según este método se tomaron dos imágenes de fondo de ojo, una a la longitud de onda donde el pigmento macular no absorbe y otra a una longitud de onda en el que muestra su pico de absorción y se extrajo la MPOD usando una fórmula matemática. El cálculo se hizo antes y después de aplicar el algoritmo de compensación de scattering para 6 sujetos y se midió una subestimación media de la MPOD de aproximadamente un 10 %. Por último, para probar los resultados con un método ya conocido de MPOD se construyó un sistema adicional psicofísico, basado en el método de HFP, que está afectado únicamente a un pequeño grado de scattering. Se observó una buena correlación entre los dos métodos que aumenta cuando el scattering se compensa. Summary When light travels through the eye to form the retinal image, it is affected by the optical media in a number of ways, such that the object and image space can never be identical. The light is spread according to a function, characteristic of the system, called the Point Spread Function (PSF) and it depends on three main phenomena: diffraction, aberrations and scattering, each one of them with different effects. Diffraction, although in reality a very general effect describing essentially the redirection of the light when meeting an obstacle, in physiological optics usually refers to diffraction at the pupil. %This simplifies the description of the phenomenon, making it possible to approximate its effect with a simple formula. Aberrations, on the other hand, is a more general term describing any deviation from the perfect model, or any deviation from the paraxial approximation. In the last two decades, low and high order ocular aberrations have been successfully measured and corrected using adaptive optics. Both diffraction and aberrations affect mainly the central part of the PSF, that is related to the high frequency features, or the details of the image. Diffraction and aberrations degrade the retinal image affecting visual acuity and contrast sensitivity. Scattering refers to the spreading of the light due to structures of about 10 microns or less, and it is not restricted to the central part of the PSF but affects its wide-angle parts as well. Therefore, contrary to diffraction and aberrations, scattering also affects low frequencies and it is perceived as a loss of contrast which depends heavily on the dynamic range of the image, or the presence of glare sources. Scattering increases with age and especially in cataract patients and can lead to a severe contrast loss. The PSF affects in exactly the same way, both vision and fundus imaging, although the retina and the processes taking place at a neural level can partially compensate the errors for vision. The purpose of this thesis is to study the effect of scattering in vision and in fundus imaging. The first step was to build a theoretical fundus model and quantify light diffusion in the fundus at different wavelengths and its dependence on the melanin pigmentation, simulating realistic pigmentation values found in a normal population. It was shown that there is a strong dependence of fundus diffusion on wavelength, with even 10 times higher reflectance or more at longer wavelengths. Moreover, a dependence of fundus diffusion was observed on changes in melanin pigmentation but only for longer wavelengths, whereas medium wavelengths were unaffected. Additionally, fundus diffusion was compared to scattering in the optical media and the spatial dominance of each phenomenon was studied. The study showed that for medium wavelengths diffusion is dominant to up to about 2 degrees of visual angle, whereas for longer wavelengths the domain of dominance increases to 4 degrees. The effect of fundus diffusion in vision was investigated. Firstly, using an optical technique, diffused light in the fundus was quantified for different spatial conditions at green (550nm) and red (650nm) through the measurement of fundus reflectance for 6 subjects grouped according to their melanin pigmentation. There was a significant increase in reflectance at light pigmentation subjects for longer wavelengths, which was in line with previous simulations and studies. Secondly, a psychophysical setup based on the Heterochromatic Flicker Photometry (HFP) method was built and the green to red color sensitivity for two different spatial conditions was measured. The measurements of the optical system were then compared to the psychophysical ones where an increase in sensitivity with fundus reflectance was observed, consistent in all subjects. Consequently, since fundus reflectance depended on pigmentation, light pigmentation individuals have an increased red to green color sensitivity. In the other part of the thesis, the focus was shifted towards the study of scattering in the ocular media, with the center of attention being the effect of scattering in fundus imaging. For this purpose, an optical setup was built based on the double-pass principle, capable of acquiring fundus images at various wavelengths and field sizes. The complete method was first tested and validated in a single-pass setup where scattering was introduced by a scatter filter. The reconstruction of the wide angle PSF was done for 7 subjects using the method of optical integration assuming a PSF based on the CIE glare function. Fundus images at different wavelengths were acquired for the subjects and the original intensity map of the image was reconstructed by applying a custom contrast enhancement method using the reconstructed PSF. It was shown that this scattering compensation technique can significantly improve the contrast of the image. The improvement depended not only on the amount of scatter for the specific wavelength but also on the dynamic range of the fundus. An improvement of about 10% was found for the specific setup. The scattering compensation method was applied in the case of the Macular Pigment Optical Density (MPOD) measurement using reflectometry. In this method two fundus images were taken, one at wavelength where macular pigment does not absorb and another at a wavelength where it shows its peak absorption and the MPOD was extracted using the pixel intensities of the two images. The calculation was done both before and after applying the scattering compensation algorithm for 6 subjects and an average MPOD underestimation of about 10% was observed. Finally, in order to test the results against a proven MPOD measurement, a psychophysical setup was built, based on the HFP method, which is affected only to a small degree by scattering. A very good correlation between the two methods was observed and the agreement increased when scattering was compensated.

Introducción La retina es parte del sistema nervioso central (SNC) y se localiza en la cara interna del globo ocular. Su función principal es la fototransducción de las ondas electromagnéticas del espectro de la luz visible en energía eléctrica. Esta función es realizada por los fotorreceptores (conos y bastones). Tras su procesamiento, la información llega a las células ganglionares de retina (CGR). Las CGR son las únicas neuronas aferentes de la retina y transmiten la información visual al cerebro a través de sus axones, que forman el nervio óptico (NO). En roedores, la mayoría de las CGR proyecta contralateralmente, siendo la población ipsilateral menor del 5%. Dentro de las CGR existe un subtipo que contiene un pigmento fotosensible, la melanopsina, que les confiere la propiedad de la fototransducción. Estas CGR melanopsínicas son responsables principalmente de funciones extravisuales o no formadoras de imágenes, como son el reflejo pupilar o la sincronización del ritmo circadiano con la luz. Objetivos 1º Caracterizar un muevo marcador para identificar las CGR de rata: Brn3a. 2º. Caracterizar la expresión de los factores de transcripción de familia Brn3 en las CGR de rata: Brn3a, Brn3b y Brn3c. 3º. Caracterizar las CGR desplazadas en rata albina y pigmentada. 4º. Caracterizar la población de CGR con proyección retino-retiniana en rata. 5º. Desarrollar nuevos métodos de trazado de las CGR de rata: desde el nervio óptico intacto y desde el tracto óptico. 6º. Analizar el efecto del trazado y la lesión axonal en las CGR melanopsínicas y en la expresión de melanopsina en rata albina y pigmentada. 7º. Caracterizar el efecto a largo plazo de la lesión del nervio óptico en la población general de CGR y CGR melanopsínicas ortotópicas y desplazadas y en el resto de las células que componen la capa de células ganglionares en rata albina y pigmentada. 8º. Caracterizar la respuesta de las células microgliales en la retina de rata tras axotomía del nervio óptico. 9º. Caracterizar el efecto del envejecimiento en la retina de rata albina y pigmentada. Material y Métodos. Resultados y Conclusiones Para identificar las CGR clásicamente se han usado técnicas de trazado. Los trazadores como el Fluorogold® (FG) se aplican o en el NO, para identificar la proyección retinofugal completa, o en los colículos superiores (CS), adonde proyectan el 98,4%% de las CGRs en roedores. En esta tesis hemos puesto a punto dos métodos nuevos de trazado: desde el NO intacto o desde el tracto óptico mediante una inyección bilateral estereotáctica. Ambas técnicas son asequibles, reproducibles y fiables. Además, hemos caracterizado el Brn3a como marcador de CGR. El Brn3a es un marcador fiable y eficiente para identificar y cuantificar las CGR en retinas intactas y con lesión axonal y además, permite analizar la topografía de las CGR después del daño axonal ya que a diferencia de los trazadores neuronales, no presenta interferencia con la microglía fagocítica trazada transcelularmente. Conjuntamente hemos analizado la expresión de los tres miembros de la familia Brn3 en las CGR, y hemos demostrado que el 70% de las CGR co-expresan dos o tres miembros de la familia Brn3 y el 30% restante expresa solamente Brn3a (26%) o Brn3b (4%) en retina de rata. Por tanto, el Brn3a se expresa en todas las CGRs exceptuando las CGR melanopsínicas y la mitad de la población ipsilateral. La mayoría de las CGR se localizan en la capa de las células ganglionares (CCG), conocidas como CGR ortotópicas (CGRo), aunque una pequeña población de CGR se encuentra desplazada a la capa nuclear interna o a la capa plexiforme interna. Estas CGR se llaman células de Dogiel o CGR desplazadas (CGRd). Nosotros hemos estudiado a ambas poblaciones en paralelo. Mientras que las CGR ortotópicas se distribuyen principalmente por la región dorso-central de la retina, las CGR desplazadas tienen una topografía diferente, se encuentran en el ecuador de la retina, con un densidad mayor en la retina temporal y son más abundantes en la rata pigmentada. La mayoría de las CGRd expresan Brn3a, y una pequeña proporción expresa melanopsina, estas últimas se distribuyen de manera similar a las CGRo melanopsínicas: son más abundantes en la retina dorso-temporal. Existe una pequeña población de CGR que proyecta a la retina contralateral, éstas son las CGR de proyección retino-retiniana (CGR ret-ret). Hemos corroborado que esta proyección es mayor en animales jóvenes que en adultos y que se encuentran preferentemente en la retina nasal y, además hemos demostrado que éstas expresan Brn3a o melanopsina y que, las que lo hacen, son las que se mantienen en los animales adultos. En la CCG, además de las CGRo hay otras poblaciones celulares: células endoteliales, células gliales y las células amacrinas desplazadas (CAd). En esta tesis hemos descrito que el 45% de las neuronas de la CCG son CGRs y el 55% restante son CAd. Y si excluimos las células endoteliales, las células gliales representarían un 10% de la población total de la capa de células ganglionares. En esta tesis, también analizamos como el albinismo afecta a las CGR. El albinismo es una enfermedad hereditaria, en la que hay una ausencia parcial o total de pigmentación que, entre otras, provoca una serie de anomalías en el sistema visual tales como una menor proyección ipsilateral y número de CGRd y, la agudeza visual y el nistagmus optocinético están afectados. Nosotros hemos demostrado que el albinismo produce los mismos defectos en la población melanopsínica que en el resto de las CGR: disminución en el número de CGRd-m y una proporción inferior de ipsilateralidad. Las lesiones en el SNC provocan la muerte neuronal con secuelas permanentes e irrecuperables, ya que las neuronas del SNC no se reemplazan. En esta tesis hemos utilizado dos modelos de degeneración de SNC que afectan específicamente a las CGR: la lesión traumática axonal por sección (SNO) o aplastamiento (ApNO) de nervio óptico, y la hipertensión ocular (HTO) como modelo de glaucoma aumentando la presión intraocular por fotocoagulación láser de la malla trabecular y las venas perilimbares y episclerales. Usando el modelo de la elevación de la presión intraocular hemos observado que las CGR desplazadas presentan la misma respuesta que las CGR ortotópicas. Y los modelos de axotomía de nervio óptico también nos han permitido documentar que estas lesiones causan la pérdida específica de CGR (ortotópicas y desplazadas), sin afectar a otras poblaciones de la capa de células ganglionares. Sin embargo, dentro de las CGR, las CGR melanopsinicas tienen un curso temporal de pérdida diferente, son más resistentes a la lesión, pero la expresión de melanopsina se infra-regula transitoriamente como respuesta tanto la axotomía como al trazado retrógrado desde el NO. Así, este hallazgo debe ser tenido en cuenta cuando se utilice la melanopsina para estudiar la población de las CGR intrínsicamente fotosensibles. Las células de la microglía (CM) son los macrófagos residentes del SNC. En condiciones normales se encuentran en estado de vigilancia. Sin embargo, tras una lesión neurodegenerativa se activan fagocitando desechos celulares. La aproximación experimental que se utiliza para identificar las CM que han fagocitado una neurona (o CM fagocíticas, CMF) se basa en el hecho de que las CM acumulan en sus fagolisosomas productos exógenos, proceso conocido como marcaje transcelular. Así, cuando una CM fagocita una CGR en degeneración previamente trazada, acumula el trazador siendo posible distinguirla de las CM que no han fagocitado. En esta tesis hemos cuantificado y analizado la distribución de las CM en la CCG y la CPI tanto en animales intactos como después de ambos modelos de axotomia (SNO y ApNO). La aparición de las CMF después del insulto aumenta al aumentar el tiempo post-lesión y se distribuyen en la región central de la retina donde hay una mayor pérdida de las CGR, a diferencia de los animales intactos donde se distribuyen homogéneamente. Aunque éste aumento de CMF es más rápido después de la SNO, existe una correlación lineal y topográfica entre la aparición de las CMF y la pérdida de CGR. La aparición de las CMF en la CCG y el descenso de las CM no fagocíticas en la CPI a 14d de ambas lesiones, sugiere que tras la lesión de las CGR las CM migran entre ambas capas. La pérdida funcional o estructural de la actividad sensorial relacionada con la edad, es muy relevante cuando afecta al sistema visual, ya que de él dependemos más que de otros sentidos. No sólo los componentes puramente físicos implicados en la visión (córnea, cristalino, humor vítreo y humor acuoso) sufren cambios estructurales que influyen en la eficiencia de la transmisión lumínica perjudicando la calidad de la visión, sino que hay pérdida numérica y funcional en las poblaciones celulares implicadas en la transmisión de la información hasta el cerebro que aumenta con la edad. En esta tesis hemos comprobado que el envejecimiento causa principalmente un déficit funcional de la retina en ambas estirpes de rata analizadas. Pero anatómicamente, ni el número de células en la CCG, ni el transporte axonal anterógrado disminuyen con la edad, solamente en la cepa pigmentada, hay un descenso del número de fotoreceptores tipo cono. Y mediante un análisis “in vivo” (SD-OCT), también hemos observado un alargamiento y adelgazamiento progresivo de la retina. Para la realización de esta tesis ha sido necesario el desarrollo de rutinas informáticas que permitan tanto la cuantificación como la representación grafica de la distribución de las diversas poblaciones celulares estudiadas en la retina. Todas estas metodologías automáticas fueron realizadas en colaboración con D. Manuel Jiménez López., Introduction The retina is part of the central nervous system (CNS) and it is located in the posterior part of the ocular globe. The main function of the retina is to sense light. Photoreceptors, cones and rods and send the luminous information to retinal ganglion cells (RGCs) through intermediate neurons. RGCs are the only afferent retinal neurons and transmit this information from the retina to the retinorecipient areas in the brain through their axons that form the optic nerve (ON). In rodents, the majority of RGC project to the contralateral superior colliculi (SCi), being the ipsilateral projection smaller than 5%. There is a subtype of RGC that expresses a photosensitive pigment, melanopsin, that confers them the ability of phototransduction. Melanopsin+RGC (m+RGC) are responsible for the non visual functions triggered by light, such as the pupilary reflex and the circadian photoentrainment. Objetives 1st. To characterize Brn3a as a marker of rat RGCs. 2nd. To characterize the expression of Brn3 transcription factors, Brn3a, Brn3b and Brn3c, in rat RGCs. 3rd. To characterize the population of displaced RGCs in albino and pigmented rats. 4th. To characterize the population of RGCs that project retino-retinially. 5th. To investigate the efficiency of two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract. 6th. To analyze the effect of tracing or axotomy on the expresión of melanopsin and detection of melanopsin+RGCs in albino and pigmented rat RGCs. 7th. To analyze in albino and pigmented rats the long term effect of optic nerve injury on RGCs and m+RGCs orthotopic and displaced, and on the rest of the ganglion cell layer cells. 8th. To analyze the microglial response in the rat retina after optic nerve axotomy. 9th. To study in albino and pigmented rats the effect of aging on the retina. Material and Methods. Results and Conclusions Retrograde tracing with tracers such as Fluorogold® (FG) is the classical approach to identify RGCs. Tracers are applied in the ON to identify the whole retinofugal projection or on the SC, where 98.4% of the RGC project to. In these thesis, we have tuned up two new methods to trace rat RGCs: from the intact optic nerve and from the optic tract by a bilateral stereotactic injection. Both techniques are affordable, reproducible and reliable. In addition we have characterized the Brn3a as a marker of rat RGCs. Brn3a is a reliable marker to identify, quantify and assess the viability of rat RGCs in health and disease. In addition, Brn3a immunodetection allows quantifying and determining the topography of RGCs after a given injury without interference of transcellularly- labelled microglial cells. We have analyzed the expression of the three members of the Brn3 family RGC, and we have shown that 70% of RGC co-express two or three Brn3 members and the remaining 30% expresses only Brn3a (25%) or Brn3b (4%). Brn3a is expressed by all RGCs except melanopsin+ ones and half of the ipsilateral projection. Most of the RGC are placed in the ganglion cell layer (GCL), these are orthotopic RGC (oRGC). However a small proportion of them is located in the inner nuclear layer or in the inner plexiform layer. These are known as Dogiel's cells or displaced RGC (dRGC). We have studied both counterpart together. While the ortothopic RGCs, are denser in the dorso-central retina, the displaced RGCs have a different topography, they are found in the retinal equator, with a higher density in the temporal retina and are more abundant in pigmented animals. Most of the dRGCs express Brn3a, and a small proportion express melanopsin, the last ones have a similar distribution than the m+-oRGCs: they are more abundant in the dorso-temporal retina. There is a small number of RGC projects to the contralateral retina, these are retino-retinal projecting RGC (ret-ret RGC). We have beared out the retino-retinal projection is minute but higher in young than in adult animals. Ret-ret RGCs are mainly nasal, and express Brn3a or melanopsin and those do it, are preserved in adult animals. In the GCL besides oRGC there are endothelial cells, glial cells and displaced amacrine cells (dAC). In this work, we have described that 45%percent of neurons in the GCL are RGCs, and 55% are displaced amacrine cells. And, if we exclude the endothelial cells, glial cells represent 10% of the total cell population of the ganglion cell layer. In this thesis, we have also analyzed how albinism affects RGCs. Albinism is a hereditary disease caused by the partial or total lack of pigmentation that causes a long list of abnormalities in the visual system such as an impaired visual acuity and optokinetic nystagmus and defects in the crossing of the retinofugal projections. Here, we added to this knowledge, that albinism produces in the melanopsin population the same defects than in the general RGC population: reduced number of displaced m+RGCs and a lower ipsilaterally. CNS lesions induce the permanent and irreversible death of the affected neurons, since CNS neurons do not proliferate and thus, are not replaced. In this thesis we have used two models of RGC degeneration: traumatic axonal injury (axotomy) transecting (ONT) or crushing (ONC) the optic nerve, and ocular hypertension (OHT), a model of glaucoma created by increasing the intraocular pressure with laser photocoagulation of the trabecular meshwork, the perilimbar and episcleral veins. Using the ocular hypertension, we have observed that the dRGCs and oRGC respond similarly to lesion. And the axotomy models also allowed us to document that after axotomy only RGCs are lost (ortothopic and displaced) without affecting other populations in the ganglion cell layer. However, within RGCs, the m+RGCs have a different course of loss, they are more resistant to injury, but the expression of melanopsin is temporarily under-regulated in response to both axotomy and retrograde tracing from the NO. Thus, this finding should be considered when melanopsin is used to study the population of the intrinsically photosensitive CGR. Microglial cells (MC) are the CNS resident macrophages. In the healthy CNS they are found in a resting (surveying) state. However, during a neurodegenerative process, they activate and among other functions, phagocytose the cellular debris. The experimental approach to identify CM that have phagocytose a neuron (phagocytic microglial cells, PMC) is based on the fact that CM accumulate in their phagolysosomes exogenous compounds, such as tracers. This process is known as transcellular tracing. Thus, when a MC engulfs a traced RGC it is possible to distinguish it from the rest of MC. In this thesis, we quantified and analyzed the distribution of MC in the GCL and the IPL in intact animal or after both axotomy models (SNO and APNO). The number of CMF after the insult increases with time post-injury. These PMC are distributed in the central region of the retina where the loss of RGCs is greater, unlike in intact animals where they are homogeneously distributed. The appearance of PMC correlates linearly and topographically with the loss of RGCs. The increase of PMC in the GCL and the decrease of MC in the IPL suggest that upon RGC injury, MC migrate between both layers. Aging is very relevant when affects the visual system, since we depend on vision more than on any other senses. Not only the physical components of the eye (cornea, lens, vitreous and aqueous humor) through which the light passes age, there is also a progressive neuronal loss and degeneration. In this thesis we found that aging causes, mainly, a functional deficit in the retina in both rat strains. Anatomically, neither the number of cells in the GCL nor the anterograde axonal transport diminishes with age, however, in the pigmented, but not in the albino rat, there is a loss of cone photoreceptors. And by “in vivo” analysis (SD-OCT), we have also observed a progressive elongation and thinning of the retina. For the consecution of this thesis it has been necessary to develop several automated routines to perform the quantification and graphic representation of the different cell populations analyzed. All these automated methodologies were created in collaboration with D. Manuel Jimenez López.

Glaucoma is a neurodegenerative disease characterized by progressive loss of retinal ganglion cell axons and their cell bodies in the retina. Elevated intraocular pressure (IOP) is considered to be the major risk factor associated with the development of this neuropathy. Randomized controlled clinical trials have demonstrated that in some patients the disease progresses, even after lowering the IOP. Several researchers have devised ways to induce elevated IOP in the rat eye with the aim of impeding the flow of aqueous humour out of the eye. Chronic ocular hypertension in rats induces morphofunctional changes in the optic nerve head and retina. Death of ganglion cells is thought to follow an apoptotic pathway. Changes have also been reported in neuronal and non-neuronal cells, levels of cyclooxygenase, and nitric oxide synthase, endothelin 1 and brain derived neurotrophic factor. Other mechanisms include intracellular electrolyte imbalance, microglial phagocytosis and elevated glutamate levels. Neuroprotection is the treatment strategy by preventing neuronal death. Hypotensive drugs (ß-blockers, a- agonists and prostaglandins), Ca++ channel blockers, NMDA antagonists and nitric oxide synthase inhibitors have been used as neuroprotective drugs in experimental models of glaucoma.