Search

Universidade Federal de Minas Gerais The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 μM against gGAPDH and 66.7 μg/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 μM and Ki of 0.24 μM. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 μM na enzima gGAPDH e 66,7 μg/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 μM ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 μM). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 μM e Ki de 0,24 μM. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ARGINASE: FROM THE IMMOBILIZATION TO MODULATION OF AFFINITY ASSAY IN COLLECTIONS OF NATURAL PRODUCTS. The use of natural products from plants dates from antiquity and they are often targets as they exhibit biological properties of interest for new drug discovery. Unfortunately screening natural products for biologically active compounds, is laborious, time consuming and Costly. To meet this end, new affinity assay model based on the use immobilized protein have developed and it was the objective of this work. This work consisted of the immobilization of arginase on to magnetic beads (Arg-MBs) for screening of natural products extracts. The modulation of the assay was initially carried out for the compounds: catechin and epicatechin (reported as arginase inhibitors) and as negative control (not inhibitor), acyclovir. For the assays, two ethanolic extracts were selected: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) and Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). From the leaves extract of Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligands were identified, and 9 of these characterized by LC-HRMS. While from crude ethanolic roots extract of Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) nineteen ligands were fished out. For chemical elucidation, these compounds need to be isolated in milligram scale. The number of ligands identified in the two ethanolic extracts showed the potential of the affinity assay developed. The development of the assays, results and studies for structural elucidation of the ligands identified will be discussed in detail in this dissertation. ARGINASE: DA IMOBILIZAÇÃO À MODULAÇÃO DE ENSAIOS DE AFINIDADE EM COLEÇÕES DE PRODUTOS NATURAIS Desde a antiguidade plantas são usadas para remediar uma dada patologia, e são frequentemente alvos, pois exibem propriedades biológicas de interesse para a descoberta de novos medicamentos. Infelizmente, a triagem de produtos naturais para compostos biologicamente ativos é trabalhosa, demorada e dispendiosa. Assim, novos modelos de triagem baseado em afinidade têm sido desenvolvidos com proteínas imobilizadas e foi o objetivo desse trabalho. Este trabalho consistiu na imobilização da arginase em partículas magnéticas (Arg-MBs) para triagem em matrizes de produtos naturais. A modulação do ensaio foi feita inicialmente para os compostos: catequina e epicatequina (reportados como inibidores de arginase) e como controle negativo (não inibidor da enzima), o aciclovir. Para os ensaios, dois extratos etanólicos foram selecionados: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) e Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). Do extrato das folhas de Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligantes foram identificados, sendo 9 destes inferidos por LC-HRMS. No extrato de raízes de Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) dezenove ligantes foram retidos. Para caracterização esses compostos deverão ser isolados em escala multimiligrama. O número de ligantes identificados nos dois extratos etanólicos demostrou o potencial do ensaio de afinidade desenvolvido. O desenvolvimento dos ensaios, resultados e os estudos para elucidação estrutural dos ligantes identificados serão detalhadamente discutidos nessa dissertação. CAPES: código de financiamento - 001

Tendo em vista que espécies do gênero Psychotria são descritas como fontes de alcalóides, principalmente do tipo β-carbolínicos, com potencial atividade biológica, focamos neste trabalho o estudo fitoquímico das folhas de Psychotria capitata Ruiz & Pav. (Rubiaceae) de vasta ocorrência no Cerrado goiano. O estudo desta espécie levou ao isolamento e elucidação estrutural dos alcaloides: bufotenina e N-óxido de bufotenina e da cumarina iso-escopoletina. Esses alcaloides foram encontrados majoritariamente em todas as frações estudadas. Além disso, foi identificado em mistura, dois alcaloides: o 6-hidroxi- 2-metil-1,2,3,4-tetraidro-β-carbolínico e o 7-carboxil-2-metil-3,4-diidro-β- carbolínium. Este último inédito, contudo ainda em fase de elucidação estrutural. Adicionalmente, considerando o grande potencial bioativo dos alcaloides indólicos, particularmente os isolados de Psychotria no que diz respeito à atividade biológica no sistema nervoso central, submetemos as frações e compostos isolados de P. capitata à avaliação in vitro tendo como alvo biológico as isoenzimas monoaminoxidases MAO-A e MAO-B. Essa avaliação foi realizada em colaboração com o grupo de pesquisas da FF/UFRGS que desenvolve estudos na busca de inibidores das enzimas envolvidas em doenças neurodegenerativas tais como doença de Parkinson e de Alzheimer, sendo que a busca de compostos que possam interagir com as enzimas colinesterase (AChE e BChE) e monoaminooxidases (MAO-A e MAOB) são consideradas importantes para a compreensão das bases neuroquímicas dessas doenças. As frações alcaloídica de P. capitata (10 μg/mL) apresentaram taxas de inibição entre 60 e 89%, mostrando o potencial destas frações. A bufotenina (86 μM), apresentou inibição para MAO-A, sendo seletiva para a mesma, enquanto que o N-óxido de bufotenina não apresentou inibição para essas enzimas. Dessa forma contribui-se para o estudo de espécies da família Rubiaceae, confirmando o grande potencial da mesma como fonte de alcaloides indólicos com núcleo β-carbolinicos com atividade biológica de grande interesse. Regarding that Psychotria species are described as sources of alkaloids, mainly β-carboline type with potential biological activity, this work focused on the phytochemical study of Psychotria capitata Ruiz & Pav. (Rubiaceae) leaves with widely occurrence on Cerrado Biome. The study of this specie led to the isolation and structural elucidation of the alkaloids: bufotenine and bufotenine-N-oxide and coumarin iso-scopelletin. These alkaloids were found mostly in all studied fractions. Furthermore, two alkaloids were identified in misture: 6-hydroxide-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β- carboline and 7-carboxyl-2-methyl-dihydro-β-carbolinium. Last one is novel alkaloid which however still in structural elucidation. Additionally, considering the great bioactive potential of indol alkaloids, particularly those found in Psychotria species regarding to central nervous system biological activity, we have submitted fractions and isolated compounds of P. capitata to in vitro evaluation with monoamineoxidases MAO-A and MAO-B as bio targets. These biological essays was realized in collaboration with research group of FF/UFRGS that develops studies searching for enzymatic inhibitors involved in neurodegenerative disease such as Parkinson´s disease and Alzheimer. Thus, search of compounds that interact with cholinesterase (AChE and BCHE) and monoamineoxidases (MAO-A and MAO-B) enzymes are important to the comprehension of neurochemical bases of these diseases. The alkaloidal fractions of P. capitata (10 mg/mL) showed inhibition rates between 60 and 89 %, which demonstrate the potential of these fractions. Bufotenine showed selective inhibiton (89 μM) to MAO-A, while bufotenine-Noxide didn´t showed inhibition to none of the enzymes. Therefore, this work contributes to the study of the species of Rubiaceae family, confirming the great potential of this family as source of indol alkaloids with a β- carboline nucleous, which show biological activity of great interest. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O presente trabalho descreve o estudo químico de E. suberosum, no intuito de elucidar estruturas de metabólitos secundários presentes nas folhas, caule e raiz, além de avaliar, por meio de teste in vitro, a atividade dos extratos, frações e, quando possível das substâncias isoladas, em busca de inibidores de catepsinas utilizando como ferramenta o substrato fluorogênico ZFR-MCA. Estas enzimas, também conhecidas como cisteíno peptidases lisossomais, estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, além de estarem associadas a muitas condições patológicas, estando as catepsinas K, L e V, envolvidas no desenvolvimento de doenças como osteoporose, câncer de pele e aterosclerose, respectivamente. Baseado nos processos patológicos em que estas catepsinas estão envolvidas, a busca de inibidores específicos pode ser uma nova abordagem para o tratamento destas doenças. O estudo do extrato etanólico das folhas levou a identificação de quatro flavonoides pertencentes à classe dos flavonois, sendo estes a quercetina e seus derivados 3-Omonoglicosídeos hiperina e isoquercitrina e 3-O-diglicosídeo, ombuina-3- rutinosídeo, todos já relatados para esta espécie. Do extrato etanólico da raiz, foi isolada a mistura dos flavanois catequina e epicatequina, além do éster graxo do β-sitosterol. No caule foram identificados a mistura dos esteroides campesterol, estigmasterol e β-sitosterol. Este estudo também sugere a presença dos alcaloides tropanos, tropacocaína e nortropacocaína no extrato etanólico das folhas, sendo estes relatados pela primeira vez na espécie. Nos ensaios frente às catepsinas K, L e V, todos os extratos apresentaram inibição superior a 60% quando avaliados na concentração de 50 μg/mL. Já as frações oriundas da partição líquido-líquido, apresentaram inibição mais expressiva frente às catepsinas V e L, quando avaliadas nas concentrações de 5 e 50 μg/mL. O flavonol quercetina apresentou um valor de IC50 de 2,2 ± 0,2 μM para a catepsina V e baixa afinidade para as catepsinas K e L quando avaliado na concentração de 100 μM. Este é um resultado importante, uma vez que os relatos na literatura para flavonoides como inibidores de catepsinas são bastante restritos. This work describes the chemical study of E. suberosum, aiming to elucidate structures of secondary metabolites in the leaves, stem and roots. Cathepsins assays were used to evaluate in vitro activity of extracts, fractions and isolated compounds, using fluorogenic substrate ZFR-MCA. These enzymes, also known as lysossomal cysteine peptidases are involved in many physiological processes, and are associated with many pathological conditions. Cathepsins K, L and V are involved in the development of diseases such as osteoporosis, skin cancer and atherosclerosis, respectively. Based on pathological processes in which cathepsins are involved, the search for specific inhibitors can be a new approach for the treatment these diseases. The study of ethanolic extract from leaves led to the identification of four flavonoids belonging to the flavonol class: quercetin and its derivatives 3-O-monoglycosides hyperin and isoquercitrin, and 3-O-diglycosides, ombuin-3-rutinoside, all previously reported for this species. The mixture of flavanols, catechin and epicatechin were isolated from ethanolic extract from roots, besides the fatty ester of sitosterol. The mixture of steroids campesterol, stigmasterol and β-sitosterol were identified from the stem extract. This study also suggests the presence of tropane alkaloids, tropacocaine and nortropacocaine, in the ethanolic extract from leaves of E. suberosum, reported for the first time in this species. In the evaluation for cathepsins K, L and V, the extracts (concentration of 50 mg/mL), showed significant inhibition of all enzymes with percentage inhibition values above 60%. The fractions showed significant activity against cathepsin V and L when evaluated at concentrations of 5 and 50 mg/mL. The quercetin flavonol showed IC50 value of 2.2 ± 0.2 μM against cathepsin V and low affinity for cathepsins K and L (100 μM). This is an important result since literature reports for flavonoids as inhibitors of cathepsin V are quite limited. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES