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RESUMEN El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus. ABSTRACT Potato virus Y (PVY) is one of the most limiting viruses in the production of potato (Solanum tuberosum and S. phureja) worldwide. This virus is transmitted by aphids and infected tuber-seeds, and for this reason, disease management of PVY requires, among others, using certified planting material through highly sensitive techniques such as ELISA and RT-PCR. However, RT-PCR-based methods require primers of high specificity to allow the unequivocal detection of viruses in asymptomatic tissues. In this work, we report a new set of primers (PVY_Col) for detection of PVY by RT-PCR and real-time RT-PCR (RT-qPCR). These primers were designed using sequences of PVY isolates from Colombia and the rest of the world. An essential feature of these primers is their specificity, since they don't amplify templates from Potato virus V (PVV), a close PVY relative that also infects potato crops in Colombia. It is expected that the PVY_Col primer set will be useful to support potato seed certification programs, epidemiological studies, and PVY disease management programs.

Las enfermedades virales son uno de los problemas más limitantes para la producción de papa en el mundo. Uno de los materiales de papa más susceptibles a los virus corresponde a Solanum phureja; sin embargo, en Colombia son pocos los estudios adelantados sobre los agentes causales que lo afectan. En este trabajo se realizó una caracterización molecular del Potato virus V (PVV) infectando plantas de S. phureja en Antioquia, utilizando métodos de secuenciación de nueva generación (NGS), pruebas de DAS-ELISA, RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) y RT-PCR convencional. Los resultados indican la ocurrencia de niveles muy variables de incidencia del virus entre lotes de cultivo (6,7 % a 86 %). El PVV tiene un genoma de 9828 nt que codifica para una poliproteína de 3066 aa y presenta dos variantes principales (Var_A y Var_B) en proporciones de 72 y 28 %. Estas variantes comparten altos niveles de identidad genética (99,7 % en todo el genoma) entre ellas y con respecto a la cepa PVV-Phureja reportada en Colombia, pero no con otras cepas del mundo (82-83 %). Con base en dichos genomas, se diseñaron y evaluaron en muestras foliares de S. phureja, dos pares de cebadores para la detección del virus en pruebas de RT-PCR (459 pb) y RT-qPCR (89 pb, Ct=12,08-21,86 y Tm= 78,7°C-80,2 °C), confirmándose la presencia de este virus en tejidos sintomáticos y asintomáticos de papa criolla. La ocurrencia generalizada de PVV en los cultivos de S. phureja indica la necesidad de incorporar en los programas de certificación de tubérculos-semilla de S. phureja en Colombia el diagnóstico de este virus. Viral diseases are one of the most limiting problems in the production of potato worldwide. Solanum phureja constitutes one of the most susceptible materials to viral diseases in Colombia; however, there are few studies on viruses infecting this crop. In the current study, we performed a molecular characterization of Potato virus V (PVV) that infects S. phureja, using different potato plots located in the province of Antioquia, using Next-Generation Sequencing (NGS), DAS-ELISA, real time RT-PCR (RT-qPCR) and RT-PCR. Results revealed variable levels of incidence among plots (6.7 %-86 %) and the presence of two slightly different variants (Var_A and Var_B) present in approximately 72 %:28 % ratio. These PVV strains have a genome of 9828 nt codifying for a polyprotein of 3066 aa and share high nucleotide sequence identity (99,7 % in their complete genome) with respect to PVV-Phureja, recently described in Colombia, but are very divergent with respect to currently available PVV genomes (82-83 %). The genome information was used to design two sets of primers, useful in the specific detection of this virus in S. phureja leaf samples through RT-PCR (459 bp) and RT-qPCR (89 bp, Ct=12.08-21.86; Tm=78.7 °C-80.2 °C). This study underscores the importance of including diagnostics of PVV in S. phureja tuber-seed certification programs in Colombia.

El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes en cultivos de solanáceas. En la región andina es frecuente encontrar cultivos mixtos de estas especies vegetales, lo cual facilita la inoculación cruzada con este virus. Estudios recientes en el departamento de Antioquia, Colombia, han detectado altos niveles de incidencia y variación genética de PVY en papa y tomate de árbol. Con el fin de evaluar si esta situación también ocurre en los cultivos de tomate de esta región, se realizó una secuenciación de nueva generación (NGS) del transcriptoma de tejido foliar de tomate, como base para la caracterización molecular del PVY en este hospedero. Se determinó, además, su incidencia en tres lotes de cultivo con TAS-ELISA y se confirmó su presencia por RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). El PVY fue detectado en el 13,3% de las 45 muestras foliares analizadas mediante TAS-ELISA y se confirmó por RT-qPCR con valores de ciclo umbral (Ct) de 14,31 a 33,8 y temperaturas de fusión (Tm) de 77,5 ± 1,5 °C. Los análisis bioinformáticos identificaron la ocurrencia de dos variantes de PVY en proporciones de 3:2. Sus genomas tienen un tamaño de 9726 nt y comparten 97,5 % de identidad; codifican para una poliproteína de 3061 aminoácidos, con regiones no traducidas (UTR) 5’ y 3’ de 218 y 325 nt, respectivamente. Los análisis filogenéticos, tanto de la poliproteína como de la cápside de ambas variantes, indican su afinidad con genotipos de PVY NTN, y constituyen el primer reporte en América del genoma completo de este virus en el cultivo de tomate. PVY is one of the most limiting viruses in solanaceous plants. These crops are frequently planted together facilitating their cross-inoculation with this virus. Recent studies in Antioquia, Colombia, detected high levels of incidence and genetic variability of PVY infecting potato and tamarillo. In this study, Next-Generation Sequencing (NGS) transcriptome analysis of tomato leaves was used to confirm the presence of PVY in tomato crops in that region; virus incidence was evaluated in three plots using TAS-ELISA and further confirmed by real-time RT-PCR (RT-qPCR). TAS-ELISA of 45 leaf samples detected PVY in 13.3 % of them; RT-qPCR confirmed the serological results with threshold cycle values in the 14.31 and 33.8 range and a Tm of 77.5 ± 1.5 °C. Bioinformatic analysis confirmed the presence of two PVY variants (proportion 3:2), sharing 97.5 % of sequence identity. Both genomes are 9726 nt in size and code for 3061 amino acids polyprotein flanked by 5´and 3´ untranslated regions (UTR) of 218 and 325 nt. Phylogenetic analysis of both the sequences coding for the coat protein and the complete polyprotein suggest phylogenetic affinity with PVY NTN. To our knowledge, this is the first American report of a complete PVY genome naturally infecting tomato.

Título en ingles: Generation of policlonal antibodies for detection of the PVY genotypic variant GIII in tamarillo and potato crops from Colombia Resumen: El potyvirus PVY es uno de los agentes causales más frecuentemente asociados a problemas virales en cultivos de papa y tomate de árbol en Colombia. Dada la importancia económica de las enfermedades causadas por PVY y a la necesidad de generar material de siembra certificado por su sanidad viral, es fundamental la generación de herramientas de diagnóstico que permitan la detección temprana de este virus. En este trabajo se reporta la obtención de anticuerpos policlonales específicos, útiles para la detección del genotipo III de PVY (GIII), una de las tres variantes que recientemente han sido reportadas en cultivos de papa y tomate de árbol de la región Andina de Colombia. Como antígeno, se utilizó un péptido sintético diseñado a partir de la región variable del extremo N-terminal del gen de la cápside viral. La sensibilidad de los anticuerpos fue evaluada mediante pruebas de ELISA y dot-blot utilizando péptidos sintéticos. Se realizó una prueba piloto para validar el uso de los anticuerpos a partir de plantas sintomáticas y asintomáticas obtenidas de una región donde confluyen cultivos de ambas solanáceas, encontrándose que los anticuerpos generados ofrecen mayores niveles de detección que los anticuerpos comerciales comúnmente utilizados para detectar los serotipos PVY-O,C y PVY-N de este virus. Palabras clave: anticuerpos policlonales; ELISA; potyvirus; RT-PCR; virus Y de la papa Abstract: PVY is one of the potyvirus more frequently associated with viral infections in tomato and tamarillo crops in Colombia. Due to the economic impact of PVY and the need to certify seeds as virus-free it is important to develop diagnostic tools that allow its premature detection. In this work, the obtention of antibodies detecting the genotype III of PVY is reported. This genotype is one of the three PVY variants infecting tamarillo and potato in the Andean region of Colombia. The N-terminal variable region of the coat protein was chosen as antigen for antibody production. The sensibility of these antibodies was tested by ELISA and dot-blot using synthetic peptides. A pilot test was performed on symptomatic and non-symptomatic plants from a mixed orchard of tamarillo and potato. The generated antibodies showed higher detection levels than the commercial antibodies commonly used to detect the PVY-O,C and PVY-N serotypes. Key words: ELISA; policlonal antibodies; potyvirus; RT-PCR, Potato virus Y

El PVY es uno de los problemas virales más incidentes y limitantes para la producción de papa en Colombia y otros países. Es transmitido por áfidos y por tubérculo-semilla, lo que genera un proceso de acumulación de virus y disminución progresiva de rendimientos cuando no se utiliza semilla certificada. En este trabajo se determinó la presencia y distribución de PVY en tubérculos de Solanum tuberosum variedad Diacol-Capiro y S. phureja variedad Criolla-Colombia obtenidos en Antioquia (Colombia), utilizando TAS-ELISA y qRT-PCR. Se evaluaron 16 muestras de cada variedad y cuatro tipos de tejido (cáscara, yemas, ápice y base de brotes) y se compararon los niveles de detección alcanzados por ambas técnicas. Cuando se utilizó qRT-PCR se encontró PVY en 100 % de los tubérculos de Diacol-Capiro y en 66,6 % de Criolla-Colombia; mientras que mediante TAS-ELISA este valor fue de 75 % para Diacol-Capiro y no se detectó el virus en ninguna muestra de Criolla-Colombia. Al evaluar los ciclos umbral (Ct) obtenidos por qRT-PCR, fue evidente que dichas diferencias se debían principalmente al bajo título viral alcanzado en Criolla-Colombia (Ct promedio=32,4) con respecto a Diacol-Capiro (Ct promedio=15,54), lo que imposibilita la detección de PVY por pruebas menos sensibles como TAS-ELISA. Con respecto a la distribución de PVY, se encontró mayor acumulación viral en los ápices de los brotes de ambas variedades (Diacol-Capiro Ct =11,53 y Criolla Colombia Ct=27,52). Estos hallazgos enfatizan la necesidad de utilizar tubérculo-semilla certificado por su sanidad viral en los cultivos de papa y del fortalecimiento de dichos programas a partir del empleo de técnicas de detección viral altamente sensibles como qRT-PCR. PVY is one of the viruses with highest incidence and severity in potato crops in Colombia and other countries. This virus is transmitted by aphids and tuber seeds and can progressively reduce crop yields due to viral accumulation when non-certified seed is used. In this work, the incidence and distribution of PVY in tubers of Solanum tuberosum v. Diacol-Capiro and S. phureja v. Criolla-Colombia from Antioquia (Colombia) was evaluated using TAS-ELISA and qRT-PCR. For both varieties, 16 samples from four different tissues (skin, dormant buds, base and tip of sprouts) were used and detection levels were compared for both techniques. With qRT-PCR, PVY was detected in 100 % and 66.6 % of Diacol-Capiro and Criolla-Colombia tubers, respectively. In contrast, TAS-ELISA detected PVY in only 75 % of Diacol-Capiro samples and none of Criolla-Colombia. Low titer values may explain the failure to detect PVY by TAS-ELISA in some samples that tested positive by qRT-PCR in Criolla-Colombia (Ct=32.4) and Diacol-Capiro (Ct=15.54). Distribution analysis revealed that the highest accumulation of PVY was the tip region of sprouts in both varieties (Diacol-Capiro Ct=11.53 and Criolla-Colombia Ct=27.52). These findings demonstrate the need of using certified seed-tubers tested with highly sensitive methods like qRT-PCR.

El Potato virus Y (PVY) es el virus más limitante de los cultivos de solanáceas en el mundo. Este virus tiene una alta diversidad de variantes gracias a sus altas tasas de mutación y recombinación genética. En este estudio se realizó un análisis filogenético de 24 aislamientos de PVY obtenidos en cultivos de papa y tomate de árbol de tres regiones de Colombia, con base en la secuenciación parcial del gen de la cápside viral (CP). Adicionalmente, en 12 de los aislamientos, se secuenció completamente dicho gen, con el fin de evaluar su similitud a nivel de aminoácidos con respecto a secuencias de referencia mundial. Los resultados indicaron la presencia de tres variantes principales de PVY en el país (denominadas I-Col, II-Int y IV-Col), dos de las cuales (I-Col y IV-Col) no se asociaron con ninguna secuencia de referencia de las razas tradicionales de PVY; mientras que el tercer grupo hizo parte del clado representando el linaje PVY N/NTN. Los tres grupos incluyeron conjuntamente cepas de papa y tomate de árbol, lo que permite inferir que ambas especies son hospedantes alternos de los mismos genotipos del virus. El análisis de aminoácidos de CP, reconfirmó la presencia de las tres variantes, aunque la variante I-Col se presentó asociada con dos aislamientos recombinantes (PVY NTN x PVYNE-11) del Brasil, pero con un bajo soporte de bootstrap. Los resultados obtenidos señalan la necesidad de ajustar los sistemas de diagnóstico del PVY y profundizar en la caracterización biológica de las variantes de este virus en Colombia. Potato virus Y (PVY) is the most limiting virus in solanaceous crops worldwide. This virus is highly variable due to a combination of high mutation and recombination rates. In this study, a phylogenetic analysis was performed on 24 PVY isolates obtained from potato and tamarillo crops from three regions of Colombia, using partial sequences of the viral coat (CP). Additionally, a complete gene sequence was obtained for 12 isolates and their similarities at the amino acid level were compared to PVY reference strains from the rest of the world. Our results revealed the presence of three main PVY variants in Colombia (named as I-Col, II-Int, and IV-Col). Two of them (I-Col y IV-Col) are not related to traditional PVY strains while II-Int is related to the PVYN/NTN clade. All three groups comprise sequences from potato and tamarillo, suggesting that both plants can act as alternative hosts to the same PVY genotypes. Amino acid analysis of CP confirmed the presence of three PVY variants; however variant I-Col showed affinity, although with low bootstrap values, to recombinant strains PVY NTN x PVYNE-11 from Brazil. The results indicate the need to adjust the systems for PVY detection and to undertake further biological studies of this virus in Colombia.

El tomate de árbol (Solanum betaceum) es una fruta andina altamente nutritiva, con propiedades organolépticas únicas para el procesamiento industrial y el mercado internacional. En Antioquia, este cultivo presenta diferentes problemas fitosanitarios, siendo especialmente limitante la Virosis, causada por un complejo viral del que hacen parte entre otras, especies del género Potyvirus. En este trabajo se evaluaron mediante pruebas de ELISA los niveles de incidencia de este grupo viral en cultivos de siete zonas del departamento de Antioquia (Colombia) y se determinó la identidad taxonómica de dos de los potyvirus asociados al cultivo. Las pruebas serológicas muestran la presencia de potyvirus en seis de las siete zonas evaluadas, alcanzando niveles superiores al 80% de incidencia, siendo la excepción los cultivos del municipio de Jardín (8%). Pruebas serológicas con anticuerpos específicos para PVY, identificaron a este virus como uno de los presentes en algunas de las muestras sintomáticas colectadas; mientras que análisis de secuencias de amplicones obtenidos mediante RT-PCR, detectaron un nuevo potyvirus, para el que se propone el nombre Tamarillo Leaf Malformation Virus (TaLMV), aunque es necesario completar la secuencia de su genoma para confirmar la validez de esta hipótesis taxonómica. Esta investigación representa un avance importante en el conocimiento que se tiene en Colombia sobre los agentes causales virales del tomate de árbol. Sin embargo, es necesario profundizar en aspectos como los mecanismos de transmisión de estos virus y los efectos individuales y de su interacción sobre las variedades de este cultivo en el país.

El género Potyvirus incluye un amplio grupo de virus de plantas que afectan diversos cultivos de gramíneas y dicotiledóneas en Colombia y el mundo. Su especie tipo, el Potato virus Y (PVY), es uno de los principales virus de distribución global que afecta severamente diferentes plantas solanáceas de importancia económica como la papa y el tomate, lo que ha promovido el desarrollo de investigaciones en métodos de detección, manejo y comprensión de su ciclo infectivo. La secuenciación de nueva generación (NGS) ha permitido establecer estrategias para la identificación rápida de especies virales, aún en condiciones de bajo título viral, y que en conjunto con aplicaciones bioinformáticas, representan una herramienta fundamental para el apoyo de los estudios de detección asintomática, relaciones filogenéticas y biología de los virus. Sobre este último aspecto, se destacan los estudios dirigidos a la comprensión de los mecanismos de replicación y expresión de los genomas virales, específicamente en las etapas que involucran interacciones proteína-proteína, tales como el procesamiento postraduccional de las poliproteínas potyvirales. En este trabajo se presenta la caracterización molecular de aislamientos de PVY infectando plantas de Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro en las dos principales regiones cultivadoras de papa de Antioquia (Oriente y Norte), utilizando metodologías de biología molecular como RT-PCR, pruebas de ELISA, secuenciación Sanger y NGS. Dicha información fue posteriormente empleada para proponer un modelo cinético de maduración de la poliproteína de PVY, a partir de simulaciones por Dinámica Molecular y tomando como referencia la estructura cristalográfica de la proteasa NIa-Pro del potyvirus Tobacco etch virus (TEV). La ejecución del trabajo permitió obtener un panorama de los niveles de diversidad genómica y de incidencia de PVY en las principales regiones cultivadoras de papa en Antioquia. Adicionalmente, la aplicación del modelo desarrollado aporta nueva información básica sobre el procesamiento postraduccional de este virus, un aspecto fundamental de la biología de los potyvirus. Se espera que estos resultados en su conjunto, apoyen los programas de manejo integrado de las enfermedades causadas por PVY en papa y otros cultivos en el país. Abstract: The genus Potyvirus comprises a large number of plant viruses that affect several gramineous and dicotyledonous crops worldwide. Potato virus Y (PVY), the type species of the genus, is one the most important viruses affecting solanaceous crops of economic importance around the world like potato and tomato. With the advent of Next-generation sequencing (NGS) technologies, it is now possible to quickly identify the presence of viruses infecting plants, even at low titers. In combination with bioinformatic analysis tools, NGS has become an important method for studying the basic biology of viruses, their evolutionary relationships and as a detection tool in asymptomatic plants. This work presents the molecular characterization of two PVY isolates infecting Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro in the two main potato-producing regions of Antioquia using RT-PCR, ELISA, Sanger sequencing and NGS. The genomic data was used to model the dynamic behaviour of the NIa-Pro protease in presence of each of its cognate cleavage sites and predict the maturation kinetics of each PVY isolate. This model was first tested using the X-ray structure of the NIa-Pro protein Tobacco etch virus (TEV) and validated using published experimental data. This investigation gives an overview on the genomic diversity and incidence levels of PVY in potato-producing regions of Antioquia. Upon experimental validation, the theoretical methods developed in this work could be used after NGS sequencing to make predictions on the infection cycle of potyviruses. The results presented here will be useful for integrated disease management programs against PVY in potato and other solanaceous crops. Maestría