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Orientador: William Dias Belangero Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A Terapia por ondas de choque (TOC) é uma alternativa não invasiva utilizada como método de indução a formação óssea que consiste em pulsos sonoros de alta energia transmitidas de modo focal a um tecido específico. Artigos demonstram aumento de vascularização, que ativação de proteínas como BMP (bone morphogenic protein) e Erk (extracellular signal-regulated kinase) induzindo diferenciação osteogênica após sua utilização no tecido ósseo. O presente estudo visou avaliar os níveis das proteínas Erk e Akt (akutely transforming), envolvidas na cascata protéica responsiva a deformação celular gerada por estímulo mecânico e consequente transformação em estímulo bioquímico induzindo a osteogênese. Os animais selecionados para o estudo foram anestesiados e divididos em dois diferentes grupos, onde no dia 1, o primeiro grupo foi submetido a TOC em sessão única de 500 impulsos gerados por aparelho eletrohidráulico a 0,12mJ/mm²na tíbia intacta e o segundo não recebeu TOC. Na sequência, os animais foram divididos em 3 subgrupos para cada tempo de segmento de 7, 14 e 21 dias A determinação dos níveis das proteínas propostas foi realizada por meio de immunoblotting. A fosforilação das proteínas Erk e Akt dos tecidos ósseos das tíbias extraídas dos ratos aumentou nos grupos submetidos a TOC após 7, 14 e se manteve elevado até o 21° dia quando comparado ao controle Abstract: Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) is a non-invasive alternative used as a method for inducing bone formation that consists of high-energy acoustic pulses transmitted in a focal way to a specific tissue. Studies show increase in vascularization which activate proteins such as BMP and Erk inducing osteogenic differentiation after its use in the bone tissue. The present study aimed at evaluating the levels of Erk and AKT proteins involved in the protein cascade responsive to cell deformation in biochemical stimulus inducing osteogenesis. The animals selected for the study were under anesthesia and divided in two different groups where on day 1 the first group was submitted to ESWT in one 500 pulse-session generated by an electrohydraulic device at 0,12mJ/mm² in intact tibia and fibula and the second did not receive ESWT. Then the animals were divided into 3 sub-groups, one for each segment times of 7, 14 and 21 days. Immunoblotting analysis was performed to determine the levels of the proposed proteins. The Erk and Akt protein phosphorylation of the bone tissues of extracted tibia from the animals increased in the groups submitted to ESWT and kept elevated until the 21st day when compared to the control group Mestrado Fisiopatologia Cirúrgica Mestra em Ciências

Orientador: William Dias Belangero Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Ondas acústicas, como ultrassom pulsado de baixa intensidade, ondas de choque e ondas de pressão radial interferem na osteogênese por meio da modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) e TGF-?1 (transforming growth factor-?1). Apesar do uso habitual na prática médica, não está claro se as terapias acústicas aceleram o reparo de fraturas agudas. Ademais, nenhum estudo comparou o efeito do ultrassom, ondas de choque e de pressão radial na modulação da expressão e do perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1 durante o reparo ósseo. A presente tese foi desenvolvida para determinar se o ultrassom, as ondas de choque e as de pressão radial modulam a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1 durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos; e, caso afirmativo, se a modulação proteica difere entre as terapias acústicas. Para tanto, defeitos ósseos nas tíbias de ratos foram expostos a uma sessão de 500 pulsos e 0.12mJ/mm2 de ondas de choque, uma sessão de 500 pulsos e 2.0 bar de ondas de pressão radial, ou sessões diárias de 20 minutos de ultrassom pulsado a 30mW/cm2. Após seguimento de 1, 3 e 6 semanas, o tecido ósseo foi coletado para análise da expressão e perfil de atividade de Akt, BMP-2, ERK-2, FAK e TGF-?1. Os animais expostos ao ultrassom foram acompanhados por até 3 semanas. Identificou-se que o ultrassom pulsado de baixa intensidade modulou a expressão de BMP-2 na terceira semana; as ondas de choque modularam, na primeira semana, a expressão de BMP-2 e TGF-?1, e o perfil de atividade de Akt e FAK; e as ondas de pressão radial modularam o perfil de atividade de FAK na terceira semana. Com base nesses achados, conclui-se que, durante o reparo de defeitos ósseos produzidos em tíbias de ratos, o ultrassom pulsado de baixa intensidade, as ondas de choque e as de pressão radial modularam, de maneira distinta, a expressão e o perfil de atividade de Akt, BMP-2, FAK e TGF-?1, mas não de ERK-2. Além disso, entre as terapias avaliadas, as ondas de choque exibiram o efeito mais expressivo na modulação proteica Abstract: Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), extracorporeal shockwaves (ESWT) and radial pressure waves (RPWT) influence osteogenesis via Akt, BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), ERK-2 (extracellular signal-regulated kinase-2), FAK (focal adhesion kinase) and TGF-?1 (transforming growth factor-?1) modulation. In spite of that, it is not clear whether those acoustic waves are effective to accelerate fracture healing. Additionally, to our knowledge no study compared the effect of different acoustic therapies on Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1 during bone healing. An experimental study was conducted to determine whether LIPUS, ESWT and RPWT modulate Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1 during bone healing in rat tibial defects; and, if so, to compare the results between the different modalities of acoustic therapies. Rat tibial defects were exposed to 500 shots of ESWT delivered at 0.12mJ/mm2, 500 impulses of RPWT operated at 2.0 bar, or daily 20-minute 30mW/cm2 sonication. Following 1, 3 and 6 weeks, bones were harvested to determine the expression and activity of Akt, BMP-2, ERK-2, FAK and TGF-?1. Animals exposed to ultrasound were followed up to 3 weeks. It was demonstrated that LIPUS modulates BMP-2 expression at three weeks; ESWT modulate Akt and FAK activity profiles, and the expression of BMP-2 and TGF-?1 at one week; and RPWT modulate FAK activity profile at 3 weeks. In conclusion, LIPUS, ESWT and RPWT exhibit distinct mechanisms to modulate Akt, BMP-2, FAK and TGF-?1, but not ERK-2 ¿ which is not modulated ¿, during bone healing in rat tibial defects Doutorado Fisiopatologia Cirúrgica Doutor em Ciências CAPES 02-P-3369/2017 FAPESP 2014/26729-0

Sob a influência da gravidade, o tecido ósseo sofre maior ou menor deformação de acordo com a intensidade das atividades da vida diária. Sabe-se que as atividades que resultam em impacto são as que mais estimulam a osteogênese e assim reduzem a perda de massa óssea. Conhecer como as células ósseas reconhecem a deformação mecânica imposta ao osso e iniciam uma série de reações bioquímicas em cadeia é de fundamental importância para o desenvolvimento de práticas terapêuticas e preventivas na atividade ortopédica. Ainda há um longo caminho para o entendimento de todo esse processo, mas o conhecimento atual progrediu bastante e há pesquisas com finalidade terapêutica. O sinal mecânico para ser transformado em biológico (mecanotransdução) deve ser amplificado no nível celular pela estrutura histológica do tecido ósseo, gerando tensões em proteínas da membrana celular (integrinas) e alterando a estrutura espacial dessas proteínas. Essa alteração ativa ligações entre elas e o citoesqueleto, originando as adesões focais, locais onde proteínas citoplasmáticas são recrutadas para facilitar as reações bioquímicas. A quinase de adesão focal (FAK) é a principal delas, sendo autoativada após sofrer alteração estrutural pelas integrinas. A FAK ativada incita reações em cascata, resultando na ativação da ERK-1/2 e da Akt, proteínas que, junto com a FAK, regulam a produção da massa óssea. Acredita-se que o osteócito seja a célula óssea responsável por reconhecer o estímulo mecânico e transmiti-lo aos osteoblastos e osteoclastos. Canais iônicos e gap junctions são cogitados como meios de comunicação intercelular para a transmissão bioquímica do estímulo mecânico. Esses eventos ocorrem continuamente no tecido ósseo e regulam a remodelação óssea. Influenced by gravidity, bone tissue experiences stronger or lighter deformation according to the strength of the activities of daily life. Activities resulting in impact are particularly known to stimulate osteogenesis, thus reducing bone mass loss. Knowing how bone cells recognize the mechanical deformation imposed to the bone and trigger a series of biochemical chain reactions is of crucial importance for the development of therapeutic and preventive practices in orthopaedic activity. There is still a long way to run until we can understand the whole process, but current knowledge has shown a strong progression, with researches being conducted focused on therapies. For a mechanical sign to be transformed into a biological one (mechanotransduction), it must be amplified at cell level by the histological structure of bone tissue, producing tensions in cell membrane proteins (integrins) and changing their spatial structure. Such change activates bindings between these and the cytoskeleton, producing focal adhesions, where cytoplasmatic proteins are recruited to enable easier biochemical reactions. Focal adhesion kinase (FAK) is the most important one being self-activated when its structure is changed by integrins. Activated FAK triggers a cascade of reactions, resulting in the activation of ERK-1/2 and Akt, which are proteins that, together with FAK, regulate the production of bone mass. Osteocytes are believed to be the mechanosensor cells of the bone and to transmit the mechanical deformation to osteoblasts and osteoclasts. Ionic channels and gap junctions are considered as intercellular communication means for biochemical transmission of a mechanical stimulus. These events occur continuously on bone tissue and regulate bone remodeling.