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O arroz (Oryza sativa L.) é uma das principais culturas alimentares do mundo, alimento básico para cerca de três bilhões de pessoas. Apesar de sua importância como fonte de carboidratos, o arroz branco possui baixas concentrações de nutrientes essenciais, dentre eles os micronutrientes ferro (Fe) e zinco (Zn), essenciais à saúde humana. Devido às mudanças climáticas, a temperatura pode aumentar 2,5 °C até 2050. Nesse cenário, eventos como ondas de calor seriam mais frequentes e de maior duração. O estresse por alta temperatura pode causar danos significativos às plantas com subsequente perda de rendimento e produtividade. O arroz é especialmente suscetível ao calor durante seu desenvolvimento e fertilização. O gênero Oryza inclui 27 espécies, dentre as quais duas espécies cultivadas, sendo distribuídas e adaptadas a diferentes ambientes ao redor do planeta, o que as torna uma fonte potencial de alelos e de novos mecanismos que podem contribuir para o melhoramento de características nutricionais e adaptabilidade a estresses bióticos e abióticos em Oryza sativa. Oryza australiensis é uma planta perene, amplamente distribuída ao norte de Queensland (Austrália), e a única representante do genoma EE no gênero Oryza. Em trabalhos já publicados, foi demonstrado que a espécie possui uma rubisco ativase (Rca) termotolerante que mantém suas variáveis fotossintéticas e de crescimento ativos quando exposta à altas temperaturas. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a termotolerância de nove acessos de O. australiensis e identificar novos mecanismos envolvidos na termotolerância dessa espécie. Adicionalmente, avaliamos a concentração de macro e micronutrientes em folhas e sementes desses acessos. Em experimentos de estresse por calor o acesso AUS1 apresentou indução de crescimento de parte aérea e variáveis de fotossíntese comparáveis ao tratamento controle, ao contrário do que foi observado para O. meridionalis e O. sativa. Esse mesmo acesso teve aumento significativo apenas para Fe e Zn no grão, dos 14 elementos analisados, quando comparado com genótipos de O. sativa. Por fim, montamos o experimento de estresse por calor com plantas do acesso AUS1 e Oryza sativa cv. Nippombare e coletamos amostras de folha para análise de transcriptoma. As extrações de RNA já foram realizadas e as amostras serão enviadas para sequenciamento o mais breve possível. Com o transcriptoma, acreditamos que novos genes e mecanismos serão encontrados na resposta de tolerância ao calor de O. australiensis. Rice (Oryza sativa L.) is one of the main food crops in the world, a staple food for about three billion people. Despite its importance as a source of carbohydrates, white rice has low concentrations of essential nutrients, including the micronutrients iron (Fe) and zinc (Zn), essential to human health. Due to climate change, the temperature may rise by 2.5 °C by 2050. In this scenario, events such as heat waves would be more frequent and of longer duration. High temperature stress can cause significant damage to plants with subsequent loss of yield and productivity. Rice is especially susceptible to heat during development and fertilization. The Oryza genus includes 27 species, in addition to two cultivated species, being distributed and adapted to different environments around the planet, which makes them a potential source of alleles and new mechanisms that can contribute to the improvement of nutritional characteristics and adaptability to biotic and abiotic stresses in Oryza sativa. Oryza australiensis is a perennial plant, widely distributed in northern Queensland (Australia), and the only representative of the EE genome in the Oryza genus. In works already published, it was demonstrated that the species has a thermotolerant rubisco activase (Rca) that keeps the photosynthetic and growth parameters active when exposed to high temperatures. Thus, the present study aimed to evaluate the thermotolerance of nine accessions of O. australiensis and to identify new mechanisms involved in the thermotolerance of this species. Additionally, we evaluated the concentration of macro and micronutrients in leaves and seeds of these accessions. In heat stress experiments, the AUS1 access showed shoot growth induction and photosynthesis parameters comparable to the control situation, contrary to what was observed for O. meridionalis and O. sativa. This same access had a significant increase only for Fe and Zn in the grain, of the 14 elements analyzed, when compared with O. sativa genotypes. Finally, we set up the heat stress experiment with plants from the AUS1 and Oryza sativa cv. Nippombare and collected leaf samples for transcriptome analysis. The RNA extractions have already been carried out and the samples will be sent for sequencing as soon as possible. With the transcriptome, we believe that new genes and mechanisms will be found in the heat tolerance response of O. australiensis.

O ferro é um micronutriente essencial para saúde humana e desenvolvimento vegetal por estar envolvido em diversos processos metabólicos, como transporte de oxigênio, síntese de DNA e transporte de elétrons. No Brasil, o estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor de arroz do país e possui caracteristicamente solos ácidos ricos em ferro. Mesmo com a alta disponibilidade de ferro para as plantas, os grãos de arroz acumulam muito pouco deste mineral. Os mecanismos envolvidos no transporte de ferro para as sementes, visando a biofortificação de grãos de arroz, ainda são pouco conhecidos. Os transportadores vacuolares de ferro OsVIT1 e OsVIT2 são altamente expressos em folhas bandeira, nós e camada de aleurona, regulando o transporte de ferro e zinco através do tonoplasto para o vacúolo, aprisionando os metais nesses tecidos. Mutantes perda de função para cada gene acumularam mais ferro nas sementes de arroz, tornando-os bons alvos para biofortificação. Para elucidar a participação de OsVIT1 e OsVIT2 na translocação de ferro, dois mutantes perda-de-função osvit1/2.1 e osvit1/2.2 foram gerados utilizando CRISPR/Cas9. Os mutantes osvit1/2 não apresentaram alterações significativas no desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, assim como nenhuma redução na produtividade de sementes foi observada em condições controle. Entretanto, a presença dos genes VIT é relevante para produção de sementes em situações de deficiência de ferro, assim como para a homeostase de Mg2+ e Cu2+ na base da parte aérea. Ambos os mutantes osvit1/2 apresentaram maior acúmulo de ferro nos embriões de sementes, entretanto a quantificação desse aumento deve ser realizada em breve. Investigações sobre o processo de translocação de Fe das raízes e folhas bandeira para as sementes também estão em curso, visando um melhor entendimento desse processo para geração de arroz biofortificado. Iron is an essential nutrient for human health and plant development because is involved in a wide variety of metabolic processes, including oxygen transport, DNA synthesis and electron transport. In Brazil, the state of Rio Grande do Sul is the major producer of rice in the country and have characteristically iron-rich acid soils. Even with the high iron availability to the plants, rice seeds accumulate low amounts of this mineral. The mechanisms that lead to iron transport to seeds allowing rice grain biofortification are still poorly understood. The rice vacuolar iron transporter genes OsVIT1 and OsVIT2 are expressed in the flag leaves, nodes and aleurone layer, regulating the transport of iron and zinc through the tonoplast to the vacuole, imprisoning those metals in these tissues. Loss-of-function mutants for each gene presented higher accumulation of iron on the seed, making them good targets for rice biofortification. To investigate the role of OsVIT1 and OsVIT2 on Fe translocation, we used CRISPR/Cas9 to generate two independent double knockout mutants, osvit1/2.1 and osvit1/2.2. No significative alterations were observed during osvit1/2 vegetative and reproductive developments, nether concerning seed production under control conditions. Although, VITs seem to be important for seed production under low Fe treatments, as well as for Mg2+ and Cu2+ homeostasis at the shoot basal region. Both osvit1/2 mutants displayed higher Fe deposition on seed’s embryos, although the enhancement needs to be yet quantified. Further investigations regarding the Fe translocation through the roots and flag leaves to the seeds are ongoing, aiming for a better understanding of this process to facilitate the development of biofortified rice.

O arroz (Oryza sativa) é uma das espécies mais importantes do mundo e um excelente modelo para entender a interação entre genes e as mudanças ambientais. Entretanto, sua produtividade é comumente desafiada por muitos estresses, como os abióticos e oxidativos. As glutationa peroxidases (GPXs) fazem parte do mecanismo pelo qual as plantas lidam com o estresse oxidativo. GPXs podem controlar a equilíbrio redox atuando também na sinalização celular. Neste trabalho investigou-se o papel do gene GPX3 de arroz em resposta ao estresse salino, usando plantas RNAi com o gene OsGPX3 silenciado (GPX3s). Os resultados indicam que essas plantas são mais sensíveis à salinidade, mostrando menor biomassa, assimilação de CO2, condutância estomática e pressão parcial intercelular de CO2. Plantas GPX3s também apresentaram significantes danos na atividade do fotossistema II e declínio no conteúdo de clorofila. O estresse salino induziu acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO) em ambas plantas, NT (não transformadas) e GPX3s, indicando que a sensibilidade das plantas GPX3s ao sal não é devida à uma significante deficiência no equilíbrio redox. Para elucidar as rotas reguladas por OsGPX3, utilizou-se a técnica de proteômica livre de marcação, comparando plantas NT e GPX3s. Plantas GPX3s apresentaram alterações na abundância de proteínas relacionadas com resposta ao ABA e processos epigenéticos. RT-qPCR e coloração usando linhagens repórter mostraram que o gene OsGPX3 é induzido pelo tratamento com ácido abscísico (ABA), sugerindo que esse gene pode desempenhar um importante papel na via de sinalização do ABA. A aplicação exógena de ABA não inibiu a germinação das sementes, tampouco induziu acumulação de ERO e o fechamento estomático em GPX3s. Ademais, GPX3s e NT apresentaram fenótipo similar ao de plantas submetidas ao estresse de seca. Entretanto, GPX3s foram mais sensíveis à indução da senescência no escuro promovida por ABA. Esse trabalho fornece importantes informações sobre a interrelação entre cloroplastos e mitocôndrias, mostrando a importância da proteína GPX3 na aquisição da tolerância à salinidade em arroz via mecanismos independente da acumulação de ERO. Além disso, é um estudo pioneiro demonstrando o papel do OsGPX3 na sinalização do ABA, corroborando com o fato de enzimas antioxidantes agirem em diferentes e complexas vias nas células. Rice is one of the world’s most important crops and an excellent model system for understanding the interaction between genes and environmental changes. However, its productivity is often challenged by stresses, as abiotic and oxidative. Glutathione peroxidases (GPXs) are part of the mechanism by which plants cope with oxidative stress. GPXs can control redox homeostasis and also play a role in redox signaling. Here, we investigated the rice GPX3 role in plant responses to salt stress using OsGPX3-RNAi silenced rice plants (GPX3s). Results indicate that GPX3s plants are more sensitive to salinity showing decreased biomass, CO2 assimilation rate, stomatal conductance, and intercellular CO2 partial pressure. These plants also present significant damage to photosystem II activity and decline in chlorophyll content. Salt stress induced ROS accumulation in both non-transformed (NT) and GPX3s plants, indicating that GPX3s sensibility to salt stress was not due to the significant impairment in redox equilibrium. To elucidate the routes regulated by OsGPX3 we performed a proteomic approach comparing NT and GPX3s. The GPX3s plants presented altered the abundance of proteins involved in abscisic acid (ABA) response and epigenetic processes. RT-qPCR and GUS-staining using reporter gene lines to GPX3 promoter showed that OsGPX3 is induced by ABA treatment, suggesting that this gene could be important in ABA pathway. The analysis of ABA-related responses showed that ABA is unable to inhibit seed germination, ROS accumulation and stomata closure in GPX3s plants. GPX3s and NT plants presented similar phenotype under drought stress. However, GPX3s were more sensitive to dark-induced senescence after ABA treatment compared with NT plants. Together, this work provides new light into the cross-talk between chloroplasts and mitochondria, showing GPX3 protein importance in rice to achieve salt stress tolerance via an ROS-accumulation independent mechanism, not acting as the major ROS-scavenger enzyme. Moreover, it also suggests a novel role to this enzyme beyond its role as ROS-scavenger, as a signaling compound. This is a pioneer study demonstrating that OsGPX3 play a role in ABA signaling and corroborate that redox homeostasis enzymes can act in different and complex pathways in plants cells.

O arroz (Oryza sativa L.) é extremamente versátil, é planta modelo das monocotiledôneas, seu grão é base alimentar de milhões de pessoas ao redor do mundo, e é amplamente cultivado, agregando valor econômico e social à cultura. As proteínas do tipo bHLH (basic helix-loop-helix) são membros de uma das maiores famílias de fatores de transcrição em plantas e participam da regulação de uma grande variedade de processos. Para entender a função de um membro desta família, foi realizado um ensaio de mono-híbrido em levedura, que permitiu identificar três membros da família GRF (Growth Regulating Factor), OsGRF3, OsGRF4 e OsGRF11, como reguladores transcricionais do gene OsbHLH35. A fim de fornecer informações adicionais sobre a função de OsbHLH35 e para confirmar a regulação de OsGRF11 sobre OsbHLH35 in vivo, plantas de arroz superexpressando os genes separadamente foram previamente obtidas através de transformação de calos embriogênicos de arroz via Agrobacterium tumefaciens. Quatro linhagens de OsbHLH35 e sete de OsGRF11 foram obtidas e analisadas molecularmente através da análise da expressão relativa dos genes OsbHLH35 e OsGRF11 que confirmou a superexpressão dos genes de interesse. A análise fenotípica das plantas superexpressando OsbHLH35 mostrou que essas plantas produziam significativamente menor número de sementes que as plantas não transformadas, além de apresentarem fenótipo de pálea e lema abertas, flores não fecundadas e poucas sementes maduras. Ao realizar uma análise detalhada da flor, foram observadas anteras com aspecto curvo. Para abordar em quais tecidos OsbHLH35 é expresso, um estudo do promotor foi realizado em plantas de arroz expressando o gene repórter da β-glucuronidase sob o controle do promotor de OsbHLH35. Através dessa abordagem observou-se a expressão de OsbHLH35 na antera, nos primórdios florais, na pálea e lema, e no ovário. A análise da expressão relativa de OsGRF11 e OsbHLH35 ao longo do desenvolvimento da panícula em plantas do tipo selvagem mostrou que OsGRF11 é altamente expresso em todos os estágios de desenvolvimento analisados, enquanto a expressão de OsbHLH35 é baixa nas mesmas condições. Entender como OsbHLH35 está envolvida no desenvolvimento da antera, quais são os genes regulados por esse fator de transcrição, e como é sua relação com outras bHLHs permitirá elucidar onde este gene está inserido no processo de desenvolvimento floral de arroz. Rice (Oryza sativa L.) is not only a monocotyledonous model plant, but also a food base for millions of people, and is widely cultivated having social and economic importance. Basic helix-loop-helix (bHLH) proteins are members of one of the largest families of transcription factors in plants and participate in the regulation of a wide variety of processes. To understand the role of one member of this family, a yeast monohybrid assay was performed which identified three members of the Growth Regulating Factor (GRF) family, OsGRF3, OsGRF4 and OsGRF11, as transcriptional regulators of the OsbHLH35 gene. In order to provide additional information on OsbHLH35 function and to confirm the regulation of OsGRF11 on OsbHLH35 in vivo, rice plants overexpressing the genes separately were obtained previously by transformation of embryogenic rice calli via Agrobacterium tumefaciens. Four lines of OsbHLH35 and seven lines of OsGRF11 were obtained and molecularly analyzed. Analysis of relative expression of the OsbHLH35 and OsGRF11 genes confirmed overexpression of these genes. Phenotypic analysis of plants overexpressing OsbHLH35 showed that these plants produced significantly fewer seeds than untransformed plants, besides presenting open palea and lemma phenotype, nonfertilized flowers and few mature seeds. When performing a detailed analysis of the flower, curved anthers were observed. To address which tissues OsbHLH35 are expressed, a promoter study was performed on rice plants expressing the β-glucuronidase reporter gene under the control of the OsbHLH35 promoter. Through this approach, the expression of OsbHLH35 was observed in the anther, floral primordia, palea and lemma, and in the ovary. Analysis of the relative expression of OsGRF11 and OsbHLH35 throughout panicle development in wild type plants showed that OsGRF11 is highly expressed at all developmental stages analyzed, while OsbHLH35 expression is low under the same conditions. Understanding how OsbHLH35 is involved in anther development, which genes are regulated by this transcription factor, and how it relates to other bHLHs will allow us to clarify where this gene is inserted in the floral development process of rice.

A enzima ascorbato peroxidase (APX) desempenha um papel essencial no controle dos níveis intracelulares de peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 é uma molécula continuamente produzida pelo metabolismo aeróbio, sendo citotóxica quando presente em níveis elevados, mas em níveis adequados pode atuar como uma molécula de sinalização. Para entender a função de um gene que codifica uma APX peroxisomal (OsAPX4) do arroz (Oryza sativa L), foram estudadas linhagens transgênicas silenciadas no referido gene (RNAiOsAPX4), através de uma caracterização fenotípica detalhada ao longo dos diferentes estádios de desenvolvimento. Após 40 dias de crescimento, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram maior número de folhas senescentes quando comparadas com as plantas não transformadas (NT). No entanto, as plantas não apresentaram diferenças significativas em altura, no conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nos parâmetros de eficiência do fotosistema II das folhas bandeira. Curiosamente, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram floração antecipada, de aproximadamente uma semana em relação às plantas NT. A viabilidade do pólen e o número de grãos de pólen por antera não diferiram entre os genótipos. Além disso, os fragmentos de folhas RNAiOsAPX4 foram mais suscetíveis à senescência induzida por escuro. Foi realizada uma análise de transcriptoma para identificar os genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e NT, comparando bibliotecas de mRNA preparadas de folhas de diferentes idades de uma mesma planta (análise ainda está sendo concluída). As comparações realizadas nesta análise demonstraram que as folhas 1 (folha mais antiga) das plantas RNAiOsAPX4 e NT, possui 11 genes diferencialmente expressos com “fold-change” maior ou igual a 2, enquanto que as comparações realizadas entre as bibliotecas preparadas com o material das folhas 2 (folha mais jovem) mostraram 71 genes diferencialmente expressos e cinco genes sobrepostos nas plantas transformadas e não-transformadas. A comparação entre as bibliotecas das folhas 1 e 2 da mesma planta mostrou apenas 2 genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e nenhum gene em plantas NT. Em conclusão, o silenciamento do gene OsAPX4, por conseguinte, a menor expressão de seu produto não afeta o crescimento da planta, mas influencia o tempo de floração e a senescência foliar, sugerindo um papel importante para o gene OsAPX4 na sinalização de ERO. Ascorbate peroxidase (APX) enzyme plays an essential role in the control of intracellular H2O2 levels. H2O2, which is continually produced by aerobic metabolism, is a cytotoxic molecule when in high levels, but in low levels it can act as a signalling molecule. To understand the function of a gene encoding a peroxisomal APX (OsAPX4) from rice (Oryza sativa L), silenced transgenic lines (RNAiOsAPX4) were studied. A careful phenotypic characterization was carried out, following all growth stages of RNAiOsAPX4 and non transformed plants (NT). Under growth chamber conditions, 40 days old RNAiOsAPX4 plants clearly displayed more senescent leaves than NT plants. However, the plants did not present significant differences in height, in the ROS content on flag leaves and in efficiency parameters of photosystem II of flag leaves. Interestingly, RNAiOsAPX4 plants started to flower a week earlier than NT plants. Assessments of pollen viability and the number of pollen grains per anther did not differ between genotypes. In addition, RNAiOsAPX4 leaf fragments were more susceptible to dark induced senescence. A transcriptome analysis to identify differentially expressed genes in RNAiOsAPX4 and NT plants was performed comparing leaves of different ages within a plant and the results are under evaluation. The comparisons between leaf 1 (older leaf) of RNAiOsAPX4 and NT plants showed 11 genes differentially expressed with ≥ 2 fold-change, while the comparisons of leaf 2 (younger leaf) showed 71 genes differentially expressed, with five overlapping genes. The comparison between leaves 1 and 2 within the same plant showed only 2 genes differentially expressed in RNAiOsAPX4 plants and no genes in NT plants. In conclusion, silencing of OsAPX4 gene does not affect plant growth, but it does influence flowering time and leaf senescence, suggesting a role for OsAPX4 gene in ROS signaling.

Os estresses abióticos impostos à planta no campo, tais como o estresse salino, toxidez por alumínio, frio, seca, entre outros, afetam seu crescimento, desenvolvimento e produtividade. Dentre as gramíneas cultivadas, o arroz (Oryza sativa) é uma das culturas de maior importância no Brasil, cuja oscilação na produção acarreta prejuízos consideráveis à economia brasileira. Dessa forma, o estudo das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais é fundamental para um conhecimento detalhado desses mecanismos. O arroz é um dos cereais mais tolerantes ao alumínio (Al), sendo um ótimo modelo para o estudo de mecanismos de tolerância. Neste trabalho, foi estudado o papel das proteínas ASR na tolerância ao Al. A expressão dos genes ASR (ABA, Stress and Ripening) é induzida por ABA, estresses e amadurecimento do fruto. Essas proteínas foram caracterizadas como chaperonas e fatores de transcrição. Os genes da família OsASR também têm o nível de transcritos aumentado em resposta ao Al, sendo OsASR1 e OsASR5 os genes com expressão mais abundante em arroz. No entanto, as regiões promotoras responsivas ao Al e os fatores de transcrição reguladores da expressão desses genes ainda não foram descritos. Assim, este trabalho tem como objetivo geral a identificação dos fatores que regulam a transcrição dos genes OsASR1 e OsASR5. Para tanto, construções contendo fragmentos dos promotores desses genes dirigindo a expressão do gene repórter GUS foram obtidas, visando ensaio de expressão transiente em protoplastos de arroz submetidos ao tratamento com Al. Os fragmentos das regiões promotoras de ambos os genes OsASR1 e OsASR5 foram todos responsivos ao Al. Também foi realizado ensaio de transativação em protoplastos de Arabidopsis thaliana para verificar a existência de auto-regulação nesses genes. Tanto ASR1 quanto ASR5 foram capazes de transativar seus próprios promotores. Além disso, foi realizada uma triagem de biblioteca de cDNAs por mono-híbrido em levedura com fragmento da região promotora de OsASR5. Com essa abordagem, foram identificados sete genes candidatos a codificadores de fatores capazes de interação DNA-proteína. The abiotic stress that plants in the field are subjected to, such as salt, aluminum, cold, drought, among others, affect their growth, development and productivity. Among cultivated grasses, rice (Oryza sativa) is one of the most important crops in Brazil, whose oscillation in production causes considerable costs to the Brazilian economy. Thus, the study of interactions between abiotic stresses and plant responses to these environmental stimuli is essential to a detailed knowledge of these mechanisms. Rice is one of the most Al-tolerant crops, being a great model for studying Al-tolerance mechanisms. In this work, the role of ASR proteins in Al tolerance was studied. The expression of ASR (ABA, Stress and Ripening) genes is induced by ABA, stresses and fruit ripening. These proteins were characterized as chaperones and transcription factors. The OsASR genes also have increased transcript accumulation in response to Al, and OsASR1 and OsASR5 have the most abundant expression in rice. However, the Al-responsive promoter regions and the transcription factors that regulate these genes have not yet been described. Therefore, the goal of this work is to identify regulating factors of OsASR1 and OsASR5 gene transcription. For this, vectors containing promoter fragments of these genes driving the expression of the GUS gene were constructed and transient expression assays were performed in rice protoplasts subjected to Al treatment. All of the promoter fragments were Al-responsive for both OsASR1 and OsASR5 genes. Transactivation assays in Arabidopsis thaliana protoplasts were also conducted in order to verify the existence of auto-regulation in these genes. Both ASR1 and ASR5 were able to transactivate its own promoters. Furthermore, a library screening was performed by yeast one-hybrid using a promoter fragment from OsASR5. With this approach, seven candidate genes encoding transcription factors capable of DNA-protein interactions were identified.

As plantas são organismos sésseis que continuamente enfrentam situações ambientais adversas, o que acarreta em reduções significativas da biomassa e da produtividade. O trabalho, aqui exposto, teve como objetivo avaliar o papel dos fatores de transcrição ASR (do ingles ABA, stress and ripening) na resposta a estresses abióticos em plantas de arroz. Também teve como objetivo avaliar as respostas de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse produzido nos momentos iniciais da exposição ao metal alumínio. O capítulo 1 da presente tese, compara a expressão de miRNAs entre plantas silenciadas para o gene ASR5 (ASR5_RNAi) e plantas não transformadas (controle). De um total de 279 miRNAs maduros identificados, distribuídos em 60 famílias, 159 foram diferencialmente expressos quando as duas bibliotecas foram comparadas. Uma correlação negativa entre o MIR167 e seu gene alvo (LOC_Os07g29820) também foi confirmada por PCR em tempo real. Este é o primeiro trabalho sugerindo o envolvimento das proteínas ASR na regulação da expressão de miRNAs em planta. O segundo capítulo apresenta o estudo das proteínas ASR na manutenção da homeostase do pH em plantas de arroz. Verificou-se uma diminuição do crescimento radicular em plantas silenciadas em solução ácida, quando comparadas com plantas não transformadas nas mesmas condições. Também foi analisada a viabilidade da ponta de raízes quanto ao dano causado pelo baixo pH e diferentes concentrações de Ca+2, demonstrando que a adição de CaCl2 é capaz de aliviar o efeito tóxico do excesso de protons H+. Diversos genes reprimidos nas plantas silenciadas e envolvidos no mecanismo de manutenção do pH em células vegetais, também foram investigados. O terceiro e último capítulo é dedicado ao estudo da resposta inicial de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse por alumínio. Plantas com 7 dias de idade foram expostas a uma concentração de 25 μM de AlCl3 durante 3 horas e modificações na abundância de proteínas foi investigada com a técnica de espectrometria de massa. Um total de 3.213 proteínas foram identificadas, sendo que destas, 293 apresentaram variação no nível de expressão. Diversas proteínas com expressão induzida são funcionalmente associadas com a detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando que o tratamento ocasionou estresse oxidativo nas raízes de A. thaliana. Também foram identificadas uma proteína mitocondrial carreadora de substrato e uma acyl-CoA oxidase com possível papel nos mecanismos de defesa em resposta a alumínio e com potencial para futuros estudos funcionais na planta modelo. De uma maneira geral, os resultados aqui apresentados mostram, pela primeira vez, que ASR5 está envolvida na regulação de miRNAs e na homeostase do pH em plantas de arroz, além de identificar proteínas responsivas ao estresse por alumínio em A. thaliana. Plants are sessile organisms that continuously face adverse environmental situations, leading to a significant reduction in biomass and yield. The aim of the present work was to further study the ASR (ABA, stress and ripening) transcription factors in rice plants. Moreover, the responses of Arabidopsis thaliana to aluminum stress were also analyzed. The chapter 1 of this thesis compares the expression of mature miRNAs in the ASR5 silenced plants (ASR5_RNAi) and in non-transformed plants (control). From a total of 279 mature miRNA of 60 families, 159 were differentially expressed. A negative correlation of MIR167 and its target gene (LOC_Os07g29820) was also confirmed by real time RT-qPCR. This is the first report showing the involvement of ASR proteins in miRNA gene expression regulation. The second chapter presents the study of participation of ASR proteins in the maintenance of pH homeostasis in rice plants. The evaluation of root growth in ASR5_RNAi plants upon acid solution showed inhibition of root growth when compared to non-transformed plants in the same condition. Root tip feasibility and damage caused by low pH and different concentrations of Ca+2 was also analyzed. The results indicate that addition of CaCl2 is capable of alleviating the toxic effects of H+ protons. Several genes downregulated in silenced plants and involved in pH maintenance in plant cells have also been investigated. This work demonstrates the importance of ASR transcription factors in a biological process not yet described. The third and final chapter describes the study of the initial response of Arabidopsis thaliana to aluminum stress. Seven-day old seedlings were treated with 25 μM AlCl3 for 3 hours and submitted to quantitative analyses by mass spectrometry. A total of 3,213 proteins were identified, from which 293 proteins were differentially responsive upon aluminum treatment. Several proteins with increased expression in response to the treatment are functionally associated with reactive oxygen species (ROS), indicating that the Al3+ exposure caused oxidative stress in the roots of A. thaliana. A mitochondrial substrate carrier (At1g78180) and an acyl-CoA oxidase (At3g51840) with a putative role in Al defense were also up-regulated and constitute interesting targets for functional studies of aluminum toxicity in the model plant. Overall, the results here presented show for the first time that ASR5 is involved in miRNA and pH homeostases regulation in rice plants and also identify proteins responsive to aluminum stress in A. thaliana.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) afetam significativamente a homeostase redox celular. No entanto, o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma das ERO mais estudadas, é considerado regulador chave em uma série de processos fisiológicos, dependendo de sua concentração na célula: em baixas concentrações atua como molécula sinalizadora envolvida na aclimatação da planta a estresses, desencadeando tolerância a estresses bióticos e abióticos; por outro lado, em altas concentrações o H2O2 pode levar à morte celular. Gradientes de ERO e fitohormônios têm influência nas respostas de crescimento local e consecutivamente afetam o estado redox celular. Diversos fitohormônios afetam a sinalização redox celular controlando processos de crescimento e defesa. Os níveis de H2O2 intracelulares são controlados pela ação de diversas enzimas da classe das peroxidases e catalases. Dentre as peroxidases, a família de proteínas GPX pode ser encontrada em praticamente todos os reinos e vem sendo cada vez mais estudada em plantas. Em arroz, essa família é composta de cinco genes, enquanto em Arabidopsis foram identificados oito genes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as GPX mitocondriais e cloroplastídica de arroz e sete dos oito genes de Arabidopsis thaliana. Mutantes knockout de Arabidopsis para os genes AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, AtGPX7 e AtGPX8 foram obtidos.Nesta espécie, pelo menos AtGPX2, AtGPX3 e AtGPX6 são necessárias para a correta formação da arquitetura da raiz dependente dos hormônios ABA, auxina e SL. O sileciamento por RNAi em arroz para os genes OsGPX1, OsGPX3 e OsGPX4 gerou plantas com crescimento deficiente de raiz, parte área e formação de panículas. A redução em 80% da expressão gênica da isoforma cloroplastídica (OsGPX4) foi letal para o desenvolvimento de plântulas regeneradas a partir de calos de arroz, enquanto que a redução da expressão de 40% e 95% de OsGPX1 (GPX1s) e OsGPX3 (GPX3s), respectivamente, não impediu a regeneração de plantas. No entanto, plantas GPX1s apresentaram menor tamanho, menor número de panículas e menor produção de sementes em comparação com as plantas NT (não transformadas). Adicionalmente, plantas GPX3s apresentaram redução do comprimento tanto da parte aérea quanto das raízes, além de acúmulo de H2O2 cerca de vinte vezes maior do que a planta NT. Neste trabalho, foi demonstrada a participação das enzimas GPX durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de plantas de arroz e o estabelecimento da arquitetura da raiz dependente de hormônios em Arabidopsis. O conjunto de dados obtidos contribuempara o entendimento do papel dessas enzimas na homeostase redox, como também na interação com fitohormônios nos processos de desenvolvimento e defesa vegetais. Reactive oxygen species (ROS) affect significantly cellular redox homeostasis. Hydrogen peroxide (H2O2), one of the most studied ROS, is considered a key regulator in a number of physiological processes dependent of its concentration in the cell: at low concentrations acts as a signaling molecule involved in plant acclimation to stress, triggering tolerance to biotic and abiotic stresses; on the other hand, at high concentrations can promote cell death. Gradients of ROS and phytohormones can influence the responses of local growth and consecutively can affect the cellular redox state. Several phytohormones affect redox signaling processes controlling cell growth and defense. The intracellular levels of H2O2 are controlled by the action of several enzymes like peroxidases and catalases. Among the peroxidases, the GPX family of proteins can be found in virtually all kingdoms and is being increasingly studied in plants. In rice, this family consists of five genes, while in Arabidopsis eight genes were identified. This study aimed to characterize functionally rice and Arabidopsis GPX genes. Arabidopsis thaliana nockout mutants for AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, and AtGPX7 AtGPX8 genes were obtained. In Arabidopsis, at least AtGPX2, AtGPX3 and AtGPX6 are necessary to hormone-dependent control of root achitecture formation. RNAi knockdown in rice of OsGPX1, and OsGPX3 OsGPX4 generated plants with shorter root and shoot lengths, and deficient panicle formation. An 80% gene expression reduction of the chloroplastic isoform (OsGPX4) was lethal, and impaired the regeneration of plants from rice calli, whereas the reduction of expression in 40% and 95% of OsGPX1 (GPX1s) and OsGPX3 (GPX3s), respectively, did not prevent plant regeneration. However, GPX1s plants were smaller and had fewer panicles and seed compared to NT (non-transformed) plants. Additionally, GPX3s plants showed reduced length of the shoot as roots and accumulation of H2O2 about twenty times greater than the plant NT. GPX participation during vegetative and reproductive development of rice plants and the hormone-dependent root arquitecture formation in Arabidopsis was demonstrated in this work. The data set obtained contributed to the understanding of the role of these enzymes in the redox homeostasis, as well as how the interaction with phytohormones in development processes and plant defense occurs.

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

O arroz é considerado o cereal mais tolerante ao alumínio (Al). Entretanto, a variabilidade entre os genótipos leva a uma considerável diferença quanto ao grau de tolerância para cultivares distintas. Diversos estudos mostram que plantas de arroz toleram o Al por intermédio de mecanismos internos e externos. Neste trabalho foi analisada a modulação da expressão da família gênica ASR (Aba, Stress and Ripening) em função do tratamento com Al. O gene ASR5 foi diferencialmente expresso em raízes de arroz tolerante ao Al (ssp Japonica cv Nipponbare). Entretanto, ASR5 não respondeu a exposição ao Al em raízes de arroz sensíveis ao Al (ssp Indica cv Taim). Plantas transgênicas silenciadas para os genes ASR apresentaram um aumento da sensibilidade ao Al. Calos embriogênicos de arroz transformados com a fusão ASR5-GFP revelaram que a proteína ASR5 localiza-se no núcelo e no citoplasma. Em protoplastos transformados, ASR5 localizou-se nos cloroplastos. Usando uma abordagem proteômica, comparando plantas não-transformadas e plantas ASR5_RNAi, um total de 41 proteínas com padrões contrastantes foi identificado. No intuito de identificar genes com expressão alterada pelo Al em arroz, e buscar genes afetados pelo silenciamento de ASR5, foi realizado o sequenciamento total dos transcritos utilizando plantas de arroz não transformadas e ASR5_RNAi em duas condições: controle e tratamento com Al. Essas análises transcriptômicas revelaram que 961 genes responderam ao Al em raízes de plantas de arroz não transgênicas submetidas ao Al. Nas plantas ASR5_RNAi, apenas 309 genes responderam ao tratamento com Al. Entretanto, apenas 52 desses genes se sobrepuseram quando comparados ao grupo de genes modulados em plantas não transformadas, sugerindo que a planta ASR5_RNAi perdeu a capacidade de regular um conjunto de genes. Além disso, análises de imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento em massa, revelaram que ASR5 liga-se ao promotor do gene STAR1, entre outros, regulando sua expressão em resposta ao Al. Os resultados mostram pela primeira vez que ASR5 atua como fator de transcrição em arroz e que está envolvido na regulação de genes responsivos ao Al conferindo tolerância frente à toxicidade do Al. Among cereal crops, rice is considered the most aluminium (Al) tolerant species. However, variability among rice genotypes leads to remarkable differences in the degree of Al tolerance for distinct cultivars. A number of studies have demonstrated that rice plants achieve Al tolerance through internal and external mechanisms. We have analyzed expression changes of the rice ASR (Aba, Stress and Ripening) gene family as a function of Al treatment. The gene ASR5 was differentially regulated in the Al-tolerant rice ssp Japonica cv Nipponbare. However, ASR5 expression did not respond to Al exposure in Indica cv Taim rice roots, which are highly Al-sensitive. Transgenic plants carrying RNAi constructs that targeted the ASR genes displayed increased Al susceptibility in T1 plants. Rice embryogenic calli expressing an ASR5-GFP fusion revealed that ASR5 was localized in both the nucleus and cytoplasm. In transformed protoplasts, ASR5-GFP appears in chloroplast cells. Using a proteomic approach to compare non-transformed and ASR5_RNAi plants, a total of 41 proteins with contrasting expression patterns were identified. In order to identify genes with differential modulation under Al stress in rice, and search for genes affected by ASR5 silencing, RNA-seq was made in non-transformed plants and ASR5_RNAi plants in control conditions and after Al treatment. These analyses revealed that 961 genes responded to Al in non-transformed rice roots under Al stress. A total of 309 genes responded to Al in ASR5_RNAi plants. Only 52 genes overlapped between non transformed and ASR5_RNAi plants when comparing genes modulated by Al, showing that ASR-silenced plants lost the ability to modulate a set of genes in response to Al treatment. Furthermore, ChIP-Seq analysis revealed that ASR5 can bind to the promoter of STAR1, among other genes, regulating its expression under Al stress. These results show for the first time that ASR5 act as a transcription factor in rice and that it regulates Al-responsive genes conferring tolerance in rice against Al toxicity.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular dessas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do peróxido de hidrogênio. Em arroz, a família APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplastidial. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as ascorbato peroxidases citosólicas (APx1 e APx2) e peroxissomais (APx3 e APx4) de arroz, estudando o papel destas isoformas nos mecanismos de defesa das plantas. A estratégia utilizada foi a obtenção e caracterização de plantas silenciadas para diferentes genes por RNA de interferência (RNAi). O padrão de expressão global da planta silenciada para os genes de APx citosólicas, em comparação com a planta não-transformada, foi avaliado através de análises de microarranjo e proteômica. A análise das plantas silenciadas APx1/2s revelou a existência de um mecanismo de compensação, com alteração de parâmetros fotossintéticos, ativação de outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de peróxido de hidrogênio. As plantas silenciadas para os genes de APx peroxissomais apresentaram atraso no desenvolvimento da panícula e maior susceptibilidade à senescência. Os genes OsAPx3 e OsAPx4 são mais expressos em folhas. A isoforma APx4 apresentou expressão em folhas, raízes e panícula de arroz, principalmente nas regiões do sistema vascular. Estas análises mostram que as isoformas de APx de arroz possuem funções diferentes, relacionadas com o compartimento celular em que estão localizadas. As enzimas APx fazem parte do complexo sistema antioxidante vegetal e estes resultados visam contribuir para um melhor entendimento do papel de APx no metabolismo celular e na defesa da planta. The reactive oxygen species (ROS) are produced constantly by aerobic metabolism. In abiotic and biotic stress, the production is increased and ROS toxicity can cause several cellular damages. ROS also act as signaling molecules in the regulation of defense gene expression, senescence, programmed cell death, plant growth and development and other processes. Since ROS are toxic and also participate of signaling events, plant cells require mechanisms that tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is an antioxidant metabolism enzyme, which catalyzes the hydrogen peroxide scavenging. In rice, the APx family is formed by eight genes, which isoforms are characterized by their subcellular localization: cytosol, peroxisome, mitochondria and chloroplast. This work aimed to characterize at functional level the cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and the peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) ascorbate peroxidase encoding genes in rice, studying the role of their products in plant defense mechanisms. The general strategy used was to produce and to characterize plants silenced for different APx genes by RNA interference (RNAi). The global expression pattern of silenced plants for cytosolic APx, compared with the non-transformed plant, was analyzed by microarray and proteomics experiments. These revealed the existence of a compensatory mechanism, which include alterations in photosynthetic parameters, activation of other antioxidant enzymes and acclimation, possibly induced by higher levels of hydrogen peroxide. Plants silenced for peroxisomal APx genes showed a delay in panicle development and were more susceptible to senescence. The expression analyses revealed that OsAPx3 and OsAPx4 genes present higher expression in leaves. The APx4 isoform is expressed in leaves, roots and panicles of rice, mainly in the vascular system. These analyses showed that rice APx isoforms may play different functions related to the cellular compartment in which they are located. APx enzymes are part of the complex plant antioxidant system and these results may contribute to a better understanding of the APx role in the cellular metabolism and plant defense.

O número de genes atualmente identificados no genoma do arroz (Oryza sativa ssp japonica) é de cerca de 32.000. Graças aos esforços de diferentes grupos ao redor do globo, o papel de muitos desses genes é melhor compreendido no momento. A função de um gene pode ser inferida principalmente pela análise de seu padrão de expressão, da estrutura da proteína codificada e pela análise de mutantes nos quais o gene se encontre interrompido, silenciado ou super-expresso. Para esse propósito, nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo linhagens transgênicas pela inserção de uma construção de T-DNA baseada no sistema de transposons de dois componentes iAc/Ds. Uma dessas linhagens (Ds72) apresenta estatura reduzida e sua inserção de T-DNA interrompe um locus, cuja função gênica ainda é desconhecida. O objetivo desse trabalho é a identificação e caracterização desse gene, que denominamos de OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). Para tal, analisamos a linhagem mutante, a estrutura da proteína prevista, as possíveis relações filogenéticas com outros genes e o padrão de expressão desse gene. Em paralelo, induzimos a mobilização do elemento Ds da sua inserção original no T-DNA da linhagem original para gerar novas linhagens mutantes. A proteína codificada por esse gene contém um motivo de associação a metais pesados e um sítio de prenilação. Identificamos esse gene como um membro de um ramo até agora desconhecido da família das Proteinas Farnesiladas (FP), proteínas preniladas que se ligam a íons metálicos. Nossas análises mostram que a expressão de OsPMBP1 é semelhante em raízes e na porção aérea de plântulas, porém, em condições de excesso de alumínio, a expressão nesses órgãos se altera, sendo induzida em folhas e caules enquanto que em raízes é reprimida. Outros genes da família FP também respondem à estresses por excesso de íons metálicos, e foram caracterizados como diretamente envolvidos no transporte e/ou detoxicação de metais pesados. Em condições normais, esse gene parece ser regulado pelo relógio circadiano, sendo um gene de expressão tardia, com pico de expressão próximo ao entardecer. A análise detalhada da linhagem Ds72 indicou que não há ligação entre o fenótipo observado e a inserção de T-DNA. Os dados obtidos demonstram que OsPMBP1 pode estar envolvido na resposta a estresse por metal pesado ou no transporte desses íons, porém ainda são necessários mais estudos para melhor entender a função desse gene na planta. The current number of identified genes in the rice genome (Oryza sativa ssp japonica) is about 32,000. Thanks to the efforts of different researchers around the world, the role of many of these genes is currently better understood. The gene function can be inferred mainly by the analysis of its expression pattern, the structure of the encoded protein and by the analysis of mutants where the gene is interrupted, silenced or over-expressed. For that purpose, our research group has developed transgenic lines by the insertion of a T-DNA construction that is based on the two-component iAc/Ds system of transposons. One of these lines shows reduced height and has the T-DNA tag interrupting a locus, whose gene function is yet unknown. The aim of the present study is the identification and characterization of this gene, which we named as OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). For that, we analyzed the mutant line, the predicted protein structure, the filogenetic relationship with others proteins, and its expression pattern. In parallel, we induced the mobilization of the Ds element from the original T-DNA insertion to generate new mutant lines. OsPMBP1coded protein has a heavy metal associated domain (HMA) and a prenylation site. We identified this gene as a member of an unknown branch of the Farnesylated Proteins family (FP), composed mostly of prenylated metal binding proteins. Ours analyses showed that the OsPMBP1 expression is equivalent in seedling roots and shoots, but, under aluminum excess, its expression change in these organs, it was inducted in the shoots and repressed in the roots. Others genes of the FP family also respond to metallic ion stresses and have been characterized as directly involved in heavy metal transport and detoxification. In normal conditions, this gene is apparently regulated by the circadian clock, with expression apices close to the evening/dusk interface. The detailed analysis of the Ds72 line indicated that there isn’t a relationship between the observed phenotype and the T-DNA insertion. The data showed that OsPMBP1 may be involved in the response to heavy metal stress or in its transport, but more analyses are required to a better understanding of the role of this gene in the plant.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.

Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do arroz e os efeitos extremamente danosos desses estresses sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O alumínio (Al) é considerado um dos principais fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes e a absorção de minerais. A toxicidade do Al em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou solos ácidos. Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) são induzidos por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e seus níveis de expressão são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e seca. Recentemente, foi demonstrado que o gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao Al em raízes de arroz. Apesar do arroz ser considerado um dos cereais mais resistentes a Al, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos no arroz em comparação a outros cereais. Por meio do presente trabalho objetivamos: i) a caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao Al; e ii) a construção de vetores binários de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsASR5, e o silenciamento gênico da família ASR de arroz. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz ssp Japonica respondem ao Al. Por outro lado, OsASR5 não sofre modulação de sua expressão em resposta ao Al em raízes de arroz ssp Indica. Essas diferenças de respostas dos genes OsASR5 em distintas variedades pode refletir diferenças no grau de tolerância ao Al de cada um desses genótipos. One of the major obstacles to maintain the stability of the national production of rice (Oryza sativa) lies on the susceptibility of the different genotypes to abiotic stress. In view of the social and economic importance of rice and due to the extremely harmful effects of stress in agriculture, detailed knowledge of the interactions between these stresses and plant responses to environmental stimuli is necessary. Aluminum (Al) is considered one of the main limitation factors for agricultural productivity, inhibiting root growth and mineral absorption. Al toxicity occurs by its solubilization in soils with low pH or acid soils. The ASR (ABA, Stress and Ripening) genes are induced by stress and abscisic acid (ABA) in plants, and their expression levels are quickly increased in response to salinity and drought. Recently, it was demonstrated that the ASR5 gene is responsive to Al in rice roots. Despite the fact that rice is considered one of the most resistant crops to Al, the basic mechanisms of tolerance to this metal are poorly known when compared to other crops. This study aimed the functional characterization of the gene expression of rice ASR family members in response to Al, and the construction of binary vectors for the subcellular localization of the protein codified by the OsASR5 gene, and the construction of a gene silencing binary vector for the ASR family. Analyses of transcripts by qRT-PCR showed that in the ssp Japonica, all ASR genes responded to Al. In contrast, OsASR5 do not suffer expression modulation in response to Al in rice roots of ssp Indica. These differences in response of the OsASR5 gene in distinct varieties may reflect differences in the degree of Al tolerance in each genotype.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos metabólicos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular destas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástica. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente as APx citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2) e peroxissomais (OsAPx3 e OsAPx4). A estratégia utilizada foi o silenciamento pós-transcricional por RNA de interferência (RNAi) dos genes individualmente e de ambos os genes codificantes de isoformas do mesmo compartimento subcelular. A redução da expressão de cada gene, assim como de ambos os genes de um compartimento, resultou na produção de diferentes sinais. As plantas RNAi mostraram diferentes fenótipos e padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. Analisando as plantas silenciadas para os genes OsAPx1 e OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, foi observada compensação por outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de H2O2. Estes resultados indicam que cada isoforma de OsAPx pode apresentar funções específicas na célula. Reactive Oxygen Species (ROS) are continually produced by aerobic metabolism. Under biotic and abiotic stresses, the production is enhanced and the ROS toxicity can lead to cell damage. ROS act also as signalling molecules and are able to regulate the expression of resistance genes, senescence, programmed cell death, plant growth and development, among other metabolic processes. By the fact that ROS are cytotoxic and make part of signalling events, plant cells need mechanisms to tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is a fundamental enzyme of the antioxidant metabolism, it catalyses the H2O2 decomposition. In rice, APx are encoded by a small multigene family, and the different isoforms are classified according to their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mithocondrial or chloroplastic. The present work aimed to characterize the function of cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) APx isoforms. The strategy was the post-transcription silencing by interference RNA (RNAi) of single genes and both genes of the same subcellular localization. The reduced expression of each gene or both genes from the same compartment resulted in the development of different signals. RNAi plants showed changes in the phenotype and in the transcriptional expression of the OsAPx gene family. The analyses of OsAPx1 and OsAPx2 silenced plants under stresses with UV radiation and aluminum revealed that the lack of APx was compensated by other antioxidant enzymes and the acclimation could be signaled by the increased level of H2O2. These results indicate that each isoform of APx should have specific functions in the cell.