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Lasso peptides are natural products that assume a unique lariat knot topology. Lasso peptide isopeptidases (IsoPs) eliminate this topology through isopeptide bond cleavage. To probe how these enzymes distinguish between substrates and hydrolyze only isopeptide bonds, we examined the structure and mechanism of a previously uncharacterized IsoP from the proteobacterium Sphingopyxis alaskensis RB2256 (SpI-IsoP). We demonstrate that SpI-IsoP efficiently and specifically linearizes the lasso peptide sphingopyxin I (SpI) and variants thereof. We also present crystal structures of SpI and SpI-IsoP, revealing a threaded topology for the former and a prolyl oligopeptidase (POP)-like fold for the latter. Subsequent structure-guided mutational analysis allowed us to propose roles for active-site residues. Our study sheds light on lasso peptide catabolism and expands the engineering potential of these fascinating molecules. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Lassopeptide gehören zu den ribosomal synthetisierten und posttranslatorisch modifizierten Peptiden. Ihr gemeinsames Erkennungsmerkmal ist ein N‐terminaler Makrolactamring, der von einem C‐terminalen Schwanz durchfädelt wird. Diese "Lassofaltung" wird durch sterische Wechselwirkungen aufrechterhalten. In dieser Studie werden die Isolierung und Charakterisierung der Xanthomonine I–III, der ersten Lassopeptide mit einem nur aus sieben Aminosäuren bestehenden Makrolactamring, sowie die Kristallstruktur von Xanthomonin I und die NMR‐spektroskopisch ermittelte Struktur von Xanthomonin II beschrieben. Insgesamt wurden 25 Xanthomonin‐II‐Varianten generiert, um Aspekte der Biosynthese, der Stabilisierung und der Aufrechterhaltug der Lassofaltung zu testen. Diese Mutagenesestudie offenbart die Einschränkungen, die ein so kleiner Ring für das Durchfädeln bedeutet, und zeigt, dass jede Stöpselaminosäure größer als Serin eine hitzestabile Lassofaltung in Xanthomonin II aufrechterhalten kann. [ABSTRACT FROM AUTHOR]