Search

Tez çalışmasında, Hidrofilik Etkileşim Kromatografisi (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC) modunda, polar analitlerin ayırımında kullanılmak üzere, polimerik ligand içeren partikül bazlı, polar kolon materyallerinin sentezi amaçlanmıştır. ?Çok basamaklı mikro süspansiyon polimerizasyonu? ile 6.6 µm boyutuna sahip poli(gliserol dimetakrilat-co-gliserolat diakrilat) (poli(GDMA-co-GDGDA)) ve 6.1 µm boyutuna sahip poli(3-kloro-2-hidroksipropilmetakrilat ?co- etilenglikoldimetakrilat ) (poli(HPMA-Cl-co-EGDMA)) eş boyutlu, gözenekli hidrojel partiküller sentezlenmiştir. Partiküllerin karakterizasyonu Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electron Microscopy, SEM), BET (Brunauer-Emmett-Teller) yüzey alanı ve gözeneklilik ölçüm sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Başlatıcı içeren poli(GDMA-co-GDGDA) partiküller üzerinde, 2-metakriloksietildimetil(3-sülfopropil)amonyumhidroksit (MESH)'in atom transfer radikal polimerizasyonu ile zwitteriyonik formda, moleküler fırça türü ligand içeren partiküller elde edilmiştir. Poli(HPMA-Cl-co-EGDMA) partiküller ise yapılarına ligand olarak seçilen tris(hidroksimetil)aminometan'ın (THMAM) bağlanması ile türevlendirilmiştir. Elde edilen partiküller 2 mm çap x 300 mm uzunluğa sahip çelik kolonlara doldurulmuştur. Kolonlar izokratik koşullarda mikro-HILIC modunda organik asit, polar akrilik bileşenler, nükleosit ve peptidlerin analit olarak kullanımıyla test edilmiştir. AcN/tampon oranı ve mobil faz akış hızının kolon performansı üzerindeki etkileri, teorik tabaka sayısı, teorik tabaka yüksekliği, pik çözünürlüğü ve alıkonma faktörü değerleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Kromatografik çalışmalarda 150000 m-1 değerine ulaşan teorik tabaka sayısı değerleri elde edilmiştir. Geliştirilen kolonların nükleosit, organik asit ve polar akrilik bileşenlerin ayırımında mikro-HILIC modu için başarı ile kullanılabileceği gösterilmiştir. In thesis, it was aimed to synthesize particle-based polar column materials for the separation of polar analytes in Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) mode. Monodisperse-porous hydrogel particles in the form of poly(glycerol dimethacrylate-co-glycerol-1,3-diglycerolate diacrylate), poly(GDMA-co-GDGDA) copolymer 6.57 µm in size and poly(3-chloro-2-hydroxypropyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate), poly(HPMA-Cl-co-EDMA) particles 6.1 µm in size were synthesized by ?multi-stage microsuspension copolymerization? of respective monomers. Particles characterization was assessed by scanning electron microscopy (SEM), BET (Brunauer-Emmett-Teller) surface area and porosity measurement system.Zwitterionic molecular brushes were generated on the surface of poly(GDMA-co-GDGDA) beads via surface initiated atom transfer radical polymerization (ATRP). On the other hand, another chromatographic ligand in the form of a single molecule, tris(hydroxymethyl)aminomethane (THMAM) was covalently attached onto poly(HPMA-Cl-co-EDMA) particles via a simple and single-stage reaction. Both types of particles were slurry packed into a stainless steel columns 2 mm i.d.x300 mm length. The columns was tested in micro-HILIC mode using the stationary medium developed, under isocratic conditions by the separation of organic acids, polar acrylic compounds, nucleosides and peptides. The effects of AcN/buffer ratio and mobile phase flow rate on column efficiency, theoretical plate number, peak resolution and retention factor were investigated. The highest column efficiency was obtained at the theoretical plate number of 150000 m-1. The separation of nucleosides, organic acids and polar acrylic compounds were successfully performed using microbore columns developed for micro-HILIC mode. 186

IV ÖZET Yapılan tez çalışmasında, fonksiyonel gruplu, monodispers ve gözenekli formda polimerik mikrokürelerin eldesine yönelik yeni bir sentez yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen sentez yöntemi ile oksiran ve karboksil gruplu polistiren bazlı polimerik mikroküreler üretilmiştir. Yöntemin ilk basamağında, monodispers polimerik partiküller dispersiyon polimerizasyonu ile sentezlenmiştir. Çıkış lateksi olarak 1.86-7.44 um aralığmda ve üç farklı boyda partikül seçilmiştir. Çıkış lateksleri sulu emülsiyon ortamında düşük molekül ağırlıklı organik bileşen (dibütil ftalat, DBF) ile uniform olarak şişirilmiştir. DBF ile şişirilen partiküller, stiren, divinil benzen, fonksiyonel monomer ve başlatıcıdan (benzoil peroksit) oluşan monomer fazı ile etkileştirilerek bu faz ile şişmeleri sağlanmıştır. Oksiran ve karboksil gruplu partiküllerin sentezinde sırasıyla glisidil metakrilat ve metaakrilik asit komonomer olarak seçilmiştir. Yöntemin son basamağında monomer fazı, sulu ortamda dispers ve stabilize edilen partiküller içerisinde polimerize edilmiştir. Farklı ortalama boyutta ve gözenek yapısında sonuç partiküler, çıkış lateksi türü (lateks boyu ve molekül ağırlığı), DBF/çıkış lateksi ve monomer faz/çıkış lateksi oranları, monomer fazdaki fonksiyonel monomer derişimi ve polimerizasyon sıcaklığı değiştirilerek elde edilmiştir. Partiküllerin ortalama boy ve boy dağılımı ile gözenek yapılan Taramalı Elektron Mikroskopisi ile analizlenmiştir. Partiküllerin fonksiyonel grup içerikleri potansiyometrik titrasyon ile belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar, artan çıkış lateksi boyu, DBF/çıkış lateksi monomer/çıkış lateksi oranı ile sonuç partikül boyunun arttığım göstermiştir. Ortalama- gözenek boyutu ise azalan çıkış lateksi molekül ağırlığı ve artan DBF/çıkış lateksi oranı ile azalmıştır. ABSTRACT In this thesis, a synthesis procedure for macroporous and monodisperse polymeric particles carrying functional groups was developed. The oxirane and carboxyl functionalities were introduced into the polystyrene based polymeric particles by the developed procedure. In the first step of the method, the monodisperse and polstyrene based uniform particles were produced by a dispersion polymerization procedure. These particles ranging from 1.86 to 7.44 urn were utilized as the seed latices for the preparation of macroporous particles. Then, the seed particles were uniformly swollen by a low molecular weight organic agent ( i.e., dibutyl phtalate, DBP) in an aqueous emulsion medium. In the next step, DBP swollen monomer particles wre reswollen with a monomer phase comprised of styrene, divinylbenzene. a functional komonomer and an oil phase soluble initiator (i.e., benzoyl peroxide). Glycidyl methacrylate and methacrylic acid wre selected as the comonomer for the introduction of oxirane and carboxylgroups into the particles, respectively. At the last step of the developed procedure, the monomer phase were polymerized within the swollen particles dispersed and satbilized in an aqueous medium. The fina macroporous particles with differen average sizes and pore structures wre achieved by changing the seed latex type (i.e., the size and the molecular weight of seed latex), DBP/seed latex and monomer phase/seed latex ratios, functional comonomer concentration in the monomer phase and polymerization temperature. The average size and size distribution and the surface pore structures of the prodoced particles wre analyzed by Scanning Electron Microscopy. The functional group contents of final particles wre determined by potentiometric titration. The results indicated that, the size of final particles icreased with the increasingseed latex size, DBP/seed latex and monomer/seed latex ratios. The average pore size decreased with the decreasing molecular weight of seed latex and icreasing DBP/seed latex ratio. 132

ÖZET Bu çalışmada, a-kemotripsin fiziksel tutuklama yolu ile eş boyutlu ve yaklaşık 3mm çaplı küresel poli(akrilamid), poli(AA), partiküller içerisine tutuklanmıştır. Jel partiküller, kalsiyum aljinat jel'in polimerizasyon kalıbı olarak kullanıldığı sulu dağıtma ortamında hazırlanmıştır. Bu çalışmada potasyum persulfat/tetrametilendiamin, sodyum- alj inat/kalsiyum klorür sırası ile redoks başlatıcı ve stabilizör olarak kullanılmıştır. Enzim-jel partiküllerinin hazırlanması sırasında sulu partikül oluşturma ortamı, önemli bir enzim kaçağına neden olmamıştır. Immobilize enzim sisteminin aktivitesini belirleyebilmek amacıyla benzoil-L-tirosin etil ester (BTEE) sentetik substrat olarak seçilmiştir. Immobilize enzim sisteminin performansı ilk olarak kesikli reaktörde incelenmiştir. Çalışmanın bu bölümünde BTEE başlangıç derişimi, reaktör sıcaklığı ve hidroliz ortamındaki alkol derişimi değiştirilmiştir. Bu deney grubunda elde edilen sonuçlar kesikli reaktörde gözlenen BTEE hidroliz hızının partikül içi difuzyon basamağı tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Enzim-jel partiküllerin aktivitesi sürekli karıştırmalı bir reaktörde de incelenmiştir. Sürekli reaktörde yapılan deneylerde, besleme çözeltisindeki BTEE derişimi, besleme akış hızı ve reaktör sıcaklığı değişken olarak seçilmiştir. Herbir değişken, farklı enzim yüklemeleri ile hazırlanan iki ayrı enzim-jel partikül örneği kullanılarak incelenmiştir. Polimerik matriks içerisindeki substrat etkin difuzyon katsayısının belirlenmesi amacıyla, yatışkın durumda çalıştırılan sürekli karıştırmalı reaktör sisteminde enzim-jel partikülleri ile farklı sıcaklıklarda elde edilen görünür reaksiyon hızları, difüzyon-reaksiyon modelinde kullanılmıştır. 11 ABSTRACT In this study, ct-chymotrypsin was immobilized via physical entrapment within monosize poly(Acrylamide), poly(AA), beads. The gel beads were prepared in an aqueous dispersion medium by using Ca-alginate gel as the polymerization mold. In this preparation, potassium persulfat/tetramethylethylene diamine and sodium- alginate/calcium chloride were used as the redox initiator and the stabilizer systems, respectively. The use of aqueous bead forming medium did not cause a significant enzyme leakage during the preparation of enzyme-gel beads. Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester, BTEE, was chosen as syntethic substrate to determine the immobilized enzyme activity. Firstly, the performance of immobilized enzyme was examined in a batch reactor. BTEE initial concentration, reaction temperature and alcohol concentration of the reaction medium were changed at these experiments. The results showed that, BTEE hydrolysis rate was controlled by internal mass transfer resistance against the substrate diffusion. The activity of enzyme-gel particles was also determined in a continously stirred tank reactor. BTEE feed concentration, feed flow rate and the reaction temperature were changed in this reactor. Two different enzyme-gel particles including different amounts of enzyme were used in these experiment. Apparent reaction rates of enzyme-gel particles, which were determined in the continous stirred tank reactor at different temperatures, were used for diffusion-reaction model to determine effective diffusion of substrate in the polymeric matrix. 76

IV ÖZET Yapılan çalışmada, hemoperfüzyon, endotoksin uzaklaştırılması ve protein saflaştırılması uygulamalarında sorbent olarak kullanılmak üzere, 50-200 um boyut aralığında fonksiyonel gruplu ve hidrojel yapısında polimerik mikroküreler sentezlenerek, yığın ve yüzey karakterizasyonlan yapılmıştır. Ayrıca hazırlanan polimerik mikrokürelerin kan uyumluluğu test edilmiştir. Polimerik mikrokürelerin temel yapısının hazırlanması amacıyla etilenglikoldimetakrilat (EGDMA) monomeri kullanılmıştır. Çalışmanın ilk bölümünde polietilenglikoldimetakrilat mikroküreler, EGDMA monomerinin süspansiyon polimerizasyonu ile elde edilmiştir. îlk kez denenen bu polimerizasyon yönteminde benzoil peroksit başlatın, polivinilalkol ise stabilizör olarak kullanılmıştır. Bu gruptaki çalışmalarda, başlatın, stabilizör ve monomer konsantrasyonları ile, sıcaklık ve karıştırma hızının polimerizasyon kinetiği ve mikroküre boy ve boy dağılımı üzerine etkisi incelenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde ise fonksiyonel gruplu ve hidrojel yapısında EGDMA bazlı polimerik mikrokürlerin sentezi hedeflenmiştir. Polimerik yapıya karboksil, hidroksil ve amin gruplarının bağlanabilmesi amacıyla sırasıyla akrilik asit, 2-hidroksietilmetakrilat ve akrilamid monomerleri kullanılmıştır. Polimerik yapıya fonksiyonel grupların bağlanabilmesi amacıyla, kopolimerizasyon iki farklı yöntemle gerçekleştirilmiştir, tik yöntem olan klasik süspansiyon kopolimerizasyonunda yapıya fonksiyonel gruplu monomer girişinin düşük olduğu yapılan FTIR ve FTIR-DRS analizleri ile görülmüştür. Bunun üzerine, ilk kez bu çalışmada kullanılan modifiye süspansiyon kopolimerizasyonu yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemle fonksiyonel grup içeriği yüksek, sulu ortama ve ışığa duyarlı, çapraz bağlı polimerik mikroküreler sentezlenmiştir. Elde edilen mikrokürelerin yığın ve yapı karakterizasyonlan FTIR, FTIR-DRS, Elektron ve Optik Mikroskopi yöntemleri ile yapılmıştır. Çalışmanın üçüncü bölümünde ise modifiye süspansiyon kopolimerizasyonu ile elde edilen fonksiyonel gruplu mikrokürelerin sağlıklı insan kanı ile etkileşimi incelenmiştir, incelenen bütün fonksiyonel gruplu mikroküre örneklerinde düşük sayılabilecek platelet yapışması değerleri elde edilmiştir. Ancak, karboksil gruplu mikroküre örneğinde platelet yapışmasının hiç oluşmadığı görülmüştür. Abstract In this study, hydrogel microspheres 50-200 urn in size range and carrying functional groups were synthesized and their bulk and surface characterizations were performed for use in hemoperfusion, endotoxin removal and protein purification as a sorbent. The blood compatibility of these polymeric particles were also studied. Ethyleneglycoldimethacrylate was used for the preparation of the base matrix of the polymeric microspheres. In the first part of the study, p(EGDMA) microspheres were obtained by the conventional suspension polymerization of EGDMA. In this method, benzoyl peroxide and polyvinyl alcohol were used as initiator and stabilizer, respectively. In this group of experiments the effects of initiator, stabilizer, monomer concentrations, stirring rate and temperature on the polymerization kinetics, average particle size and size distribution were investigated. In the second part of the study, EGDMA based polymeric microspheres having functional group and hydrogel structure were synthesized. Acrylic acid, 2- hydroxyethylmethacrylate and acrylamide were selected for the preparation of polymeric microspheres with carboxyl, hydroxyl and amide groups, respectively. In this method EGDMA was copolymerized with one of these monomers in the suspension medium. Two different procedures were followed to introduce the functional groups into the polymeric structure. The conventional suspension copolymerization procedure was tried, first and the bulk and surface characterizations by FTIR and FTIR-DRS indicated that, the functional group incorporation to the EGDMA based polymeric structure was reasonably low by this method. Therefore, modified suspension copolymerization method was developed. Crosslinked hydrogel microspheres which were sensitive to light and water and containing functional groups at reasonably high concentrations, were produced by this method. The bulk and surface characterizations of these microspheres were performed with FTIR, FTIR-DRS, electron and optical microscopy. In the third part of the study, the interaction of the healthy human blood with functional group containing microspheres synthesized by modified suspension copolymerization recipe was investigated. For all microspheres, low levels of platalet adhesion values were observed. No platalet adhesion was detected with the hydrogel microspheres containing acrylic acid on their surfaces. 99