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Olive tree (Olea europaea subsp. europaea) is one of the oldest cultivated trees in the world and plays a critical role in the sustainability of Mediterranean ecosystems. As an agricultural system with important economic, sociological and environmental roles its cultivation should be maintained and preserved. However, nowadays, the health of the olive groves is seriously threatened by a notable increase, both in incidence and severity of diseases caused by various pathogens which are affecting its growth and production. Among olive diseases, those caused by the vascular plant pathogenic bacterium Xylella fastidiosa (in particular from subspecies multiplex and pauca) and the soilborne vascular fungus Verticillium dahliae are, without a doubt, global threats to olive production worldwide. The most practical and economically efficient method for the management of olive vascular diseases is the use of resistant cultivars. However, most olive cultivars widely grown in the Mediterranean Basin including Spain, are moderate to highly susceptible to the most virulent strains of these pathogens, which include V. dahliae defoliating (D) pathotype or X. fastidiosa subsp. pauca ST53. Thus, an integrated management strategy is recommended to prevent the spread and reduce the incidence and severity of those pathogens. This approach combines preventive and palliative measures to mitigate the development of the disease among which the exploitation of the beneficial plant-associated microbiome by using biological control agents might represent a long-term sustainable and environmentally friendly strategy. In nature, healthy plants live in permanent association and interact with a myriad of microorganisms, collectively called the plant microbiome, which are known to play essential roles in plant health. Thus, endophytes, known as bacteria and fungi that live within plants where they establish nonpathogenic relationships with their hosts, can control the growth of pathogens through inter-microbial interactions and by stimulating host plant immunity. The potential role that microbial communities may play in the resistant response to olive vascular pathogens has been overlooked and remains unexplored to date. Therefore, a thorough knowledge of the microbial communities inhabiting the xylem vessels of olive trees may be crucial for understanding their potential influence on the healthy growth of this tree as well as on the resistance shown by specific olive genotypes against vascular plant pathogens. This Doctoral Thesis has been focused on the characterization of the microbial communities inhabiting the xylem vessels of the olive tree, optimizing the methodological approaches for its study and cultivation, determining the main biotic and abiotic factors that determine and modify the structure, diversity and the interactions existing among the members of these microbial communities. For this, as a first step, a Next Generation Sequencing (NGS) protocol was optimized for analysis of xylem-associated microbial communities, which included the evaluation of: i) the procedure for extracting the microbiome when using xylem sap or xylem tissue, ii) the influence of the DNA extraction kits (Chapter II), iii) the choice of PCR primers targeting 16S rRNA (Chapter III). In Chapter II it was shown the significant effect that the DNA extraction protocol has on xylem sap bacterial community assessment. Thus, significant differences in the alpha (Richness) and beta (UniFrac distances) diversity measures of xylem-inhabiting bacterial communities were found among 12 DNA extraction kits, which could be clustered in four groups. Although the core number of taxa detected by all DNA extraction kits included four phyla, seven classes, 12 orders, 21 families, and 14 genera, some specific taxa, particularly those identified at low frequency, were only detected by some DNA extraction kits. The most accurate recovery and assessment of a bacterial mock community artificially inoculated on sap samples was generated when using the PowerPlant and PowerSoil DNA extraction kits. Chapter III addressed another important drawback in metabarcoding studies, such is the primer choice for amplification of 16S rRNA. For that, four PCR-primer pairs targeting a different región of the 16S rRNA were compared for their efficacy to avoid the co-amplification of mitochondria and chloroplast plant rRNA. The highest yields of mitochondria and chloroplast reads were obtained when using xylem woody chips and the PCR1-799F/1062R (76.05%) and PCR3-967F/1391R (99.96%) primer pairs. On the contrary, the PCR2-799F/1115R and PCR4-799F/1193R primer pairs showed the lowest mitochondria 16S rRNA amplification (76% of reads). Among the genera identified using NGS, 14 (41.2%) were also recovered in the culture collection, whereas 20 (58.8%) of the isolated bacteria were not detected by the NGS approach. In Chapter VI, we evaluated six different broth media (SXM, XVM2, XF26, PD3, 3G10R and XDM2) mimicking xylem sap composition for their ability to sustain growth of olive xylem-inhabiting bacteria. A total of 66 olive xylem-inhabiting bacterial genera could be cultured in vitro, of which 28 (42.4%) were previously described as endophytes of the plant stem in other studies; but 38 of them, were described, for the first time, as cultivable plant-endophytic bacteria. Alpha and beta-diversity measures of bacterial communities developed during cultivation indicated that the main differences were due to the broth media used, followed by the olive genotype from which the xylem sap was extracted, with no effect (Richness and Shannon alpha-diversity) or a minor effect (UniFrac beta-diversity distance) of incubation time. PD3 was the medium that best supported bacterial growth but enriched for the lowest number of bacterial amplicon sequence variants (ASVs); whereas XVM2 medium showed the highest number of ASVs detected when using sap extracted from “Picual” and “Arbequina” genotypes (258 in both), followed by 3G10R (244) in “Picual” sap and XDM2 (244) in “Arbequina” sap. These culture media can facilitate the in vitro cultivation of synthetic microbial communities that can be later used to modify the plant xylem microbiome to enhance plant resilience to vascular pathogens. Additionally, this Doctoral Thesis elucidated whether in vitro olive propagation may alter the diversity and composition of the xylem-inhabiting microbiome and if those changes may modify the resistance response that a wild olive clone shows to the highly virulent D pathotype of V. dahliae (Chapter VII). Results from this chapter indicated that although there were differences in microbial communities among the different plant propagation methods, most substantial changes occurred when plants were inoculated with V. dahliae, regardless of whether the infection process of the stem took place. Thus, a significant increase in the diversity of bacterial communities occurred when the pathogen was present in the soil. Furthermore, it was noticeable that olive plants multiplied under in vitro conditions developed a susceptible reaction to D V. dahliae, characterized by severe wilting symptoms and a 100% of stem vascular colonization. Moreover, those in vitro propagated plants showed an altered xylem microbiome with a decrease in total OTU numbers as compared to that of plants multiplied under non-aseptic conditions. Pseudomonas spp. appeared as the most predominant bacterial group in micropropagated plants and Anoxybacillus was revealed as a keystone bacterium in V. dahliae-inoculated plants, irrespective of their propagation process. Our results showed a breakdown of resistance to V. dahliae in a wild olive genotype that could potentially be related to a modification of its xylem microbiome. These results have contributed to expand our knowledge of the role of indigenous xylem-associated microorganisms on host resistance, which can be of use to fight against the main vascular diseases of olive. Finally, this Doctoral Thesis characterized the structure and diversity of the olive microbiome under natural conditions and their potential determinant and modifying factors including plant-associated host factors such as plant niche and olive genotype, and the influence of environment including climate, soil and agronomic conditions of the orchard and the season of sampling (Chapter VIII). This chapter resulted in the identification of a total of 7,132 bacterial ASVs, distributed in 28 phyla and 3,469 genera, whereas 1,356 ASVs were identified for fungal communities that were composed of 10 phyla and 714 genera. Proteobacteria was the most abundant bacterial phylum (45.21%) followed by Actinobacteriota (25.22%); whereas Pseudomonas and Sphingomonas (7.37% and 5.11%, respectively) were the dominant genera. For fungal communities, Ascomycota (87.81%) followed by Basidiomycota (9.02%) were the most abundant phyla; whereas Aureobasidium and a member of the order Saccharomycetales (18.54% and 15.00%, respectively) were the dominant fungal genera. Alpha diversity showed main significant differences for the Richness and Shannon indexes according to the plant niche, both for bacterial and fungal communities. Similarly, ANOSIM analysis of beta diversity weighted UniFrac distances indicated a significant main effect of the plant niche, followed by the field location and season of sampling, with a minor effect of the olive genotype. Network analysis identified co-presence or mutual exclusion associations between the above- and below-ground compartments of olive trees. Interestingly, specific ASVs were identified showing different relative number of positive and negative associations with other ASVs in the network analysis within each studied factor. Our results are pioneer in describing the olive holobiont and its main shaping factors including the plant niche, environmental conditions (soil physico-chemical properties, climate and seasonality) and host genotype. These results will contribute to facilitate the exploration and selection of specific keystone microorganisms that can live in close association with olive under a range of environmental/agronomic conditions and could be ideal targets for the design of biofertilizers, biostimulants and biocontrol agents for management of olive diseases. To conclude, this Doctoral Thesis has settled the methodological approaches to unravel the biotic and abiotic factors that affect the xylem microbial communities and have characterized some members of the core xylem microbiome, establishing the basis to isolate and culture them. These isolated microorganisms could be used to produce a consortium of xylem-inhabiting microorganisms that can be artificially inoculated into xylem vessels of olive plantlets to modify their native xylem microbiome to obtain plants more resilient to infection by xylem-inhabiting pathogens or to enhance olive plant physiology and growth. El olivo (Olea europaea subsp. europaea) es uno de los árboles cultivados más antiguos del mundo y desempeña un papel fundamental en la sostenibilidad de los ecosistemas mediterráneos. Al ser un sistema agrícola con importantes funciones económicas, sociales y ambientales, su cultivo debe mantenerse y preservarse. Sin embargo, en la actualidad, la salud de los olivares se está viendo seriamente amenazada por un notable incremento, tanto en incidencia como en severidad, de enfermedades causadas por diversos patógenos que están afectando tanto a su desarrollo como producción. Entre las enfermedades del olivo, las causadas por la bacteria patógena Xylella fastidiosa (en particular de las subespecies multiplex y pauca) y el hongo vascular del suelo Verticillium dahliae son, sin duda, las principales amenazas globales para la producción del olivar a nivel mundial. El método más practico y económicamente eficiente para el manejo de las enfermedades vasculares del olivo es el uso de cultivares resistentes. Sin embargo, la mayoría de los cultivares de olivo más ampliamente utilizados en la cuenca mediterránea, incluida España, presentan una reacción de moderada a altamente susceptible a las variantes más virulentas de estos patógenos, que incluyen el patotipo Defoliante (D) en V. dahliae o la subespecie pauca ST53 en X. fastidiosa. Por lo tanto, es necesaria una estrategia de gestión integrada para poder prevenir la propagación y reducir la incidencia y severidad de esos patógenos. Este enfoque debe combinar medidas preventivas y paliativas para mitigar el desarrollo de la enfermedad, entre las que se incluye la explotación del microbioma beneficioso asociado a las plantas mediante el uso de agentes de control biológico que puede representar una estrategia sostenible y respetuosa con el medio ambiente a largo plazo. En la naturaleza, las plantas sanas viven en asociación permanente e interactúan con una gran variedad de microorganismos, denominados microbioma vegetal, que desempeña funciones esenciales en la salud de las plantas. Así, los microorganismos endofitos, entre los que se incluyen las bacterias y hongos que viven en el interior de las plantas estableciendo relaciones no patogénicas con su huésped, pueden controlar el crecimiento de patógenos a través de interacciones inter-microbianas y al estimular la inmunidad de la planta huésped. El potencial papel que pueden desempeñar las comunidades microbianas en la respuesta de resistencia en olivo a patógenos vasculares no ha sido considerada y permanece inexplorado. Por tanto, un mejor conocimiento de las comunidades microbianas que habitan en los vasos del xilema del olivo puede ser crucial para comprender su influencia potencial en el crecimiento saludable de la planta, así como en la resistencia que muestran genotipos específicos de olivo frente a patógenos vasculares. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en la caracterización de las comunidades microbianas que habitan el xilema del olivo optimizando los enfoques metodológicos para su estudio y determinando el efecto de los principales factores bióticos y abióticos que son claves en la configuración de su estructura, diversidad y las interacciones existentes entre los componentes del microbioma. Para ello, como primer paso, se optimizo un protocolo de secuenciación masiva (NGS) para el análisis de comunidades microbianas asociadas al xilema, que incluía la evaluación de: i) el procedimiento de extracción del microbioma cuando se utiliza savia o tejido xilemático, ii) la influencia de los kits de extracción de ADN (Capítulo II) y iii) la elección de los cebadores de PCR dirigidos al ARNr 16S (Capítulo III). En el Capítulo II se mostró el efecto significativo del protocolo de extracción de ADN en la evaluación de la comunidad bacteriana de la savia del xilema. Así, se encontraron diferencias significativas en los valores de diversidad alfa (riqueza) y beta (distancias UniFrac) de las comunidades bacterianas que habitan en el xilema entre 12 kits de extracción de ADN, que pudieron agruparse en cuatro grupos. Aunque el número principal de taxones detectados por todos los kits de extracción de ADN incluía cuatro filos, siete clases, 12 órdenes, 21 familias y 14 géneros, algunos taxones, en particular los identificados con baja frecuencia, solo se detectaron con algunos de los kits de extracción de ADN. La recuperación y evaluación más precisa de una comunidad bacteriana inoculada artificialmente en muestras de savia se generó al utilizar los kits de extracción de ADN PowerPlant y PowerSoil. El Capítulo III abordo otro aspecto importante en los estudios de secuenciación masiva, como es la elección del cebador para la amplificación del ARNr 16S. Para ello, se compararon cuatro pares de cebadores de PCR dirigidos a diferentes regiones del ARNr por su eficacia para evitar la coamplificación de ARNr de mitocondrias y cloroplastos de la planta. Las amplificaciones más altas de secuencias de mitocondrias y cloroplastos se obtuvieron cuando se utilizó tejido xilemático con los pares de cebadores PCR1-799F/1062R (76,05 %) y PCR3-967F/1391R (99,96 %). Por el contrario, los pares de cebadores PCR2-799F/1115R y PCR4-799F/1193R mostraron la menor amplificación de ARNr 16S mitocondrial (76% de las lecturas). Entre los géneros identificados mediante NGS, 14 (41,2%) también se recuperaron en cultivo, mientras que 20 de los géneros aislados (58,8%) no pudieron ser detectados mediante NGS. En el Capítulo VI, se evaluaron seis medios de cultivo liquido diferentes (SXM, XVM2, XF26, PD3, 3G10R y XDM2) que imitan la composición de la savia del xilema por su capacidad para favorecer el crecimiento de bacterias que habitan en el xilema del olivo. Se pudieron cultivar in vitro un total de 66 géneros bacterianos habitantes del xilema del olivo, de los cuales 28 (42,4%) habían sido previamente descritos como endofitos del tallo de la planta en otros estudios, pero 38 de ellos fueron descritos por primera vez como bacterias endofitas cultivables de plantas. Las medidas de diversidad alfa y beta de las comunidades bacterianas desarrolladas durante el cultivo indicaron que las principales diferencias entre ellas se debían al medio de cultivo, seguido del genotipo de olivo del que se extrajo la savia, sin verse afectado (diversidad alfa de Riqueza y Diversidad-Shannon) o con un efecto menor (distancia de diversidad beta UniFrac) por el tiempo de incubación. PD3 fue el medio que mejor sustento el crecimiento bacteriano, pero enriqueció con el menor número de ASV bacterianos; mientras que el medio XVM2 mostro el mayor número de ASVs al utilizar savia extraída de los genotipos “Picual” y “Arbequina” (258 en ambos), seguido de 3G10R (244) en savia de “Picual” y XDM2 (244) en savia de “Arbequina”. Estos medios de cultivo pueden facilitar el cultivo in vitro de comunidades microbianas sintéticas que posteriormente pueden utilizarse para la modificación del microbioma del xilema de olivo para mejorar la reacción de este a patógenos vasculares. Además, en esta Tesis Doctoral se ha dilucidado si la propagación in vitro del olivo puede alterar la diversidad y composición del microbioma que habita en el xilema y si esos cambios pueden modificar la respuesta de resistencia que muestra un clon de olivo silvestre al patotipo D altamente virulento de V. dahliae (Capítulo VII). Los resultados indicaron que, aunque hubo diferencias en las comunidades microbianas xilemáticas en función del método de propagación de olivo, los cambios más sustanciales ocurrieron cuando las plantas se inocularon con V. dahliae D, independientemente de si se produjo colonización del tallo por el patógeno. Así, se produjo un aumento significativo en la diversidad de comunidades bacterianas en plantas crecidas en suelo infestado por el patógeno. Además, se observo que las plantas de olivo multiplicadas en condiciones in vitro desarrollaron una reacción susceptible a V. dahliae D, caracterizada por síntomas severos de marchitez y un 100% de infección vascular del tallo. Además, esas plantas propagadas in vitro mostraron un microbioma de xilema alterado con una disminución en el número total de OTUs en comparación con las plantas multiplicadas en condiciones no asépticas. Pseudomonas spp. fue el género bacteriano predominante en plantas micropropagadas y Anoxybacillus se revelo como una bacteria clave en las plantas inoculadas con V. dahliae D independientemente de su método de propagación. Nuestros resultados mostraron una ruptura de la resistencia a V. dahliae D en un genotipo de olivo silvestre que podría estar potencialmente relacionada con una modificación de su microbioma xilemático. Estos resultados han contribuido a ampliar nuestro conocimiento sobre el papel de los microorganismos asociados al xilema en la resistencia del huésped, lo cual puede ser útil para luchar contra las principales enfermedades vasculares del olivo. Finalmente, en esta Tesis Doctoral se caracterizó la estructura y diversidad del microbioma del olivo en condiciones naturales y sus posibles factores determinantes y modificadores, incluidos diversos factores asociados a la planta huésped, como el nicho de esta y su genotipo, así como la influencia del medio ambiente incluyendo las condiciones climáticas, del suelo y agronómicas del olivar y la estación del año en que se lleva a cabo el muestreo (Capítulo VIII). En este capítulo se identificaron un total de 7.132 variantes de secuencia de amplicón (ASV) bacterianos, distribuidos en 28 filos y 3.469 géneros, mientras que se identificaron 1.356 ASV fúngicos que se encuadraban en 10 filos y 714 géneros. Proteobacteria fue el filo bacteriano más abundante (45,21%) seguido de Actinobacteriota (25,22%); mientras que Pseudomonas y Sphingomonas (7,37% y 5,11%, respectivamente) fueron los géneros dominantes. Para las comunidades fúngicas, Ascomycota (87,81%) seguido de Basidiomycota (9,02%) fueron los filos prevalentes; mientras que Aureobasidium y un miembro del orden Saccharomycetales (18,54% y 15,00%, respectivamente) fueron los géneros fúngicos dominantes. La diversidad alfa mostro diferencias significativas para los índices de Riqueza y Shannon según el nicho de la planta, tanto para las comunidades bacterianas como fúngicas. De manera similar, el análisis ANOSIM de disimilaridad UniFrac de la diversidad beta indico que el nicho de la planta fue el factor de mayor influencia, seguido de la localidad y el momento de muestreo, con un menor efecto del genotipo del olivo. El análisis de redes identifico asociaciones de copresencia o exclusión mutua entre los compartimentos del olivo en la parte aérea y suelo. Curiosamente, este análisis permitió identificar ASV específicos que mostraban un numero relativo diferente de asociaciones positivas y negativas con otros ASV para cada factor estudiado. Nuestros resultados son pioneros en la descripción del holobionte del olivo y sus principales factores de configuración, incluidos el nicho de la planta, las condiciones ambientales (clima y estacionalidad) y el genotipo del huésped. Estos resultados contribuirán a facilitar la exploración y selección de microorganismos clave específicos que pueden vivir en estrecha asociación con el olivo en una diversidad de condiciones ambientales/ agronómicas, y podrían ser componentes idóneos para el diseño de biofertilizantes, bioestimulantes y agentes de biocontrol para el manejo de enfermedades en olivar. Para concluir, esta Tesis Doctoral ha establecido los enfoques metodológicos para esclarecer los factores bióticos y abióticos que afectan a las comunidades microbianas del xilema de olivo. Asimismo, se han caracterizado algunos componentes clave del microbioma del xilema, sentando las bases para su aislamiento y cultivo. Estos microorganismos podrían utilizarse para la creación de un consorcio de microorganismos habitantes del xilema que pueden inocularse artificialmente en los vasos xilemáticos de plantones de olivo para modificar su microbioma xilemático nativo y así hacer frente a la infección por patógenos vasculares o mejorar su desarrollo fisiológico y su crecimiento.

Trabajo presentado en la 9th Meeting of the IOBC-WPRS Working Group "Integrated Protection of Olive Crops", celebrado en Lisboa del 26 al 29 de octubre de 2021., Xylem-inhabiting plant pathogenic organisms, such as Verticillium dahliae and Xylella fastidiosa, compromise and seriously threat the health of olive crop worldwide by collapsing the xylem vessels and ultimately causing the death of the olive tree. Nowadays, the use of host resistance is the most practical and efficient control measure for vascular diseases in olive. However, research on endophytic microorganisms is gaining a special interest as a potential tool to confer protection against infection by xylem-inhabiting pathogens or suppress disease development. This work pursues i) the modification of xylem microbiome composition of cultivated olive plantlets (‘Picual’ and ‘Arbequina’) by transplanting an external xylem microbiome obtained from wild (‘Acebuche’) and cultivated (‘Picual’ and ‘Arbequina’) adult olive trees through endotherapy treatment, and ii) the evaluation of the changes in the xylem microbial composition of challenged plants over time. A total of 1,015 ASVs (grouped in 361 bacterial genera) were identified for all treatments. Globally, Massilia (12.91%) was the most abundant genus followed by Hymenobacter (9.62%), Sphingomonas (9.32%), Curtobacterium (9.05%) and Methylobacterium (6.09%). Furthermore, alpha diversity measure showed an increase of observed ASVs after endotherapy treatment from ‘Picual’ and ‘Acebuche’ xylem sap to ‘Arbequina’ olive plantlets whereas the endotherapy inoculation of ‘Arbequina’ and ‘Acebuche’ xylematic fluid to ‘Picual’ showed the opposite behaviour. Additionally, beta diversity using ASV frequencies showed some trends across the different sampling times in each olive genotype treated. These results indicated that consortia of xylem microorganisms can be artificially inoculated in xylem vessels of seedling plants modifying their native xylem microbiome with the aim to control diseases caused by xylem-inhabiting pathogens or modify olive plant physiology and growth., Study supported by Projects XF-ACTORS 727987 (EU-H2020) and AGL2016-75606-R (MICINN Spain and FEDER-EU).