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Orientador: Valeria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Reservatórios de petróleo são ambientes de subsuperfície poli-extremos, portanto micro-organismos que apresentam características que os permitem suportar e se desenvolver sob uma gama de condições adversas. Muitos destes micro-organismos estão relacionados à degradação de hidrocarbonetos, causando efeitos negativos na qualidade do óleo e impactando o refino do petróleo. Dessa maneira, o intuito deste estudo foi de caracterizar a microbiota de um reservatório de petróleo brasileiro, a fim de determinar seus principais micro-organismos e vias metabólicas prevalentes, e avaliar a influência da temperatura e salinidade sobre a capacidade de degradação de hidrocarbonetos pelos membros da comunidade microbiana sob diferentes condições redutoras. Para isso, foram implementados microcosmos anaeróbios, que foram incubados sob diferentes condições de temperatura (40ºC, 50ºC e 70ºC), salinidade (15 gL-1, 60 gL-1 e 120 gL-1) e aceptores de elétrons (sulfato, H2 / CO2 e acetato - metanogênese), sendo a microbiota autóctone do óleo bruto usada como inóculo. Análises de sequenciamento shotgun dos microcosmos, quantificação de metano e de redução de sulfato, revelaram as vias de degradação predominantes, os micro-organismos mais abundantes em cada condição e as funções necessárias à sobrevivência em seu micro-ambiente. Os resultados demonstraram que temperatura e salinidade combinadas são fatores limitantes da degradação de hidrocarbonetos. Além disso, os resultados também demonstraram que a ativação dos hidrocarbonetos, etapa inicial da degradação, ocorre via adição de fumarato e carboxilação, e que a degradação ocorre sob condições metanogênicas apenas. As diferenças taxonômicas entre três condições degradadoras (15 gL -1 de sal a 40ºC e 50ºC e 60 gL -1 a 50ºC) se deram, principalmente, em nível de abundância relativa. Entretanto, foi possível observar a existência de um microbioma central, comum a todas as condições, formado por bactérias dos gêneros Petrotoga e Acetomicrobium e arqueias do gênero Methanoculleus. A comunidade microbiana apresentou, também potencial para degradação de compostos como tolueno e fenol, assim como de produzir metano a partir de diferentes moléculas (metanol, metilaminas, acetato e H2 / CO2). De maneira geral, foi possível concluir que a sintrofia é o principal mecanismo de sobrevivência dos micro-organismos. Essa estratégia permite a contínua degradação de hidrocarbonetos e formação de gás metano, ampliando a gama de vias metabólicas disponíveis para consumo do petróleo Abstract: Oil reservoirs are poly-extreme subsurface environments, therefore microorganisms that have characteristics that allow them to support and develop under a range of adverse conditions. Many of these microorganisms are related to hydrocarbon degradation, causing negative effects on oil quality and impacting oil refining. Thus, the aim of this study was to characterize the microbiota of a Brazilian oil reservoir, in order to determine its main microorganisms and prevalent metabolic pathways, and to evaluate the influence of temperature and salinity on the hydrocarbon degradation capacity by members of the microbial community under different reducing conditions. For this, anaerobic microcosms were implemented, which were incubated under different conditions of temperature (40ºC, 50ºC and 70ºC), salinity (15 gL-1, 60 gL-1 and 120 gL-1) and electron acceptors (sulfate, H2 / CO2 and acetate - methanogenesis), with the indigenous microbiota of crude oil used as inoculum. Analyzes of shotgun sequencing of the microcosms, quantification of methane and sulfate reduction, revealed the predominant degradation pathways, the most abundant microorganisms in each condition and the functions necessary for survival in their micro-environment. The results showed that combined temperature and salinity are limiting factors for hydrocarbon degradation. In addition, the results also demonstrated that the activation of hydrocarbons, the initial stage of degradation, occurs via the addition of fumarate and carboxylation, and that the degradation occurs under methanogenic conditions only. The taxonomic differences between three degrading conditions (15 gL-1 of salt at 40ºC and 50ºC and 60 gL-1 at 50ºC) occurred mainly in the level of relative abundance. However, it was possible to observe the existence of a central microbiome, common to all conditions, formed by bacteria of the genera Petrotoga and Acetomicrobium and archaea of the genus Methanoculleus. The microbial community also showed potential for the degradation of compounds such as toluene and phenol, as well as for producing methane from different molecules (methanol, methylamines, acetate and H2 / CO2). In general, it was possible to conclude that syntrophy is the main survival mechanism of microorganisms. This strategy allows the continuous degradation of hydrocarbons and the formation of methane gas, expanding the range of metabolic pathways available for oil consumption Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2015/06991-4; 2016/24976-5 CAPES

Orientador: Valéria Maia Merzel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os reservatórios de petróleo são ambientes de subsuperfície profunda de importância global como recurso energético e nos ciclos biogeoquímicos. Os micro-organismos que habitam os reservatórios de petróleo tem a capacidade de utilizar os hidrocarbonetos de petróleo como fontes de carbono, levando à degradação e afetando negativamente a qualidade e valor econômico do petróleo. Estudos anteriores sugerem que os micro-organismos anaeróbios são responsáveis pelos processos de biodegradação que ocorrem nos reservatórios de petróleo. No entanto, pouco se conhece sobre a real diversidade microbiana e os processos metabólicos envolvidos na biodegradação, principalmente devido à dificuldade em recuperar a complexa comunidade microbiana presente em tais ambientes extremos. Este trabalho teve como objetivos caracterizar a microbiota em amostras de reservatórios de petróleo através de métodos independentes de cultivo e acessar o potencial de degradação anaeróbia de hidrocarbonetos pelos micro-organismos indígenas do reservatório sob diferentes condições físico-químicas. O estudo revelou diferenças claras na diversidade filogenética entre as amostras de óleo degradada (BA-1) e não degradada (BA-2) com base nas análises de bibliotecas de clones do gene rRNA 16S de bactérias e arqueias. A análise dos metagenomas das duas amostras de reservatório de petróleo também mostrou diferenças nos perfis taxonômicos e funcionais obtidos. O metagenoma da amostra BA-1 apresentou uma alta abundância de genes relacionados com a degradação anaeróbia de hidrocarbonetos, metanogênese e associações sintróficas, enquanto a amostra do reservatório BA-2 mostrou alta abundância de genes de degradação aeróbia de hidrocarbonetos. Um consórcio microbiano foi cultivado com sucesso a partir da amostra de óleo BA-1 capaz de metabolizar anaerobicamente os componentes do petróleo a metano. Maiores taxas de produção de metano foram detectadas nas condições de menor salinidade e na temperatura in situ do reservatório. A concentração mais elevada de sal (120 gl-1) e a maior temperatura (70 °C) testadas mostraram inibição da atividade metanogênica do consórcio. Os dados obtidos demonstram que o petróleo cru pode abrigar uma microbiota indígena com capacidade de degradar hidrocarbonetos de petróleo predominantemente pela via metanogênica. Estes resultados, e os estudos em curso, ajudarão a entender os possíveis papéis dos micro-organismos na degradação de hidrocarbonetos e como tais organismos respondem às condições ambientais na subsuperfície petrolífera. Além disso, o potencial demonstrado da microbiota BA-1 para converter os componentes do óleo em metano é uma contribuição importante para a indústria do petróleo, uma vez o metano é considerado o futuro da produção de energia em reservatórios profundos ou esgotados Abstract: Petroleum reservoirs are deep subsurface environments of global importance as energy resources and in biogeochemical cycles. Microorganisms living in petroleum reservoirs are able to use petroleum hydrocarbons as carbon sources, leading to biodegradation and negatively affecting the quality and economic value of oil. Previous studies suggest that anaerobic microorganisms are responsible for in-reservoir oil biodegradation. However, little is known about the actual microbial diversity and metabolic processes involved in biodegradation, mainly because of the difficulty in recovering the complex microbial community present in such extreme environments. This work aimed to characterize the microbiota of two petroleum reservoir samples using culture-independent approaches and assess the anaerobic hydrocarbon degradation potential of the indigenous microorganisms under different physicochemical conditions. The study revealed clear differences in the phylogenetic diversity between the degraded (BA-1) and non-degraded (BA-2) oil samples based on the analysis of bacterial and archaeal 16S rRNA gene clone libraries. The taxonomic and functional differences were also evident in the metagenomic profiles of the two petroleum reservoir samples. The metagenome from the BA-1 sample showed high abundance of genes related with the anaerobic hydrocarbon degradation, methanogenesis and syntrophic associations, while the BA-2 sample showed abundance of aerobic hydrocarbon degradation genes. Correspondingly, a microbial anaerobic active consortium was successfully cultivated from the BA-1 oil sample capable of metabolizing the crude oil components to methane. Higher rates of methane production were observed at the lowest salinity and at the in situ reservoir temperature. Together, the highest salt concentration (120 gl-1) and temperature (70 ºC) tested showed to inhibit the methanogenic activity of the consortium. Data obtained demonstrate that crude oil can harbour an indigenous microbiota with the ability to degrade petroleum hydrocarbons predominantly via methanogenic metabolism. Results gathered herein, and the ongoing work, will help us to understand the potential roles of microbes in hydrocarbon biodegradation and how such organisms respond to the environmental conditions in the petroliferous subsurface. In addition, the unveiled potential of the BA-1 microbiota to convert oil components to methane has an important contribution to the petroleum industry, as methane might be the future for energy production from deep or depleted reservoirs Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES FAPESP 2011/14501-6