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Acute myeloid leukemia is a group of metabolic heterogeneous cancers, of which the long-term overall survival is still poor, especially in elderly patients. Targeting metabolic reprogramming in leukemic cells is becoming a promising strategy. The aim of our research was to explore the relation of genetic mutations with the metabolic phenotype and potential therapeutics to target metabolic pathway dependence. We confirmed the metabolic heterogeneity in AML cell lines and found the high dependence on oxidative phosphorylation in MLL/AF9 AML cells. Metformin could significantly repress the proliferation of MLL/AF9 AML cells by inhibiting oxidative phosphorylation., Acute myeloid leukemia (AML) is a group of hematological cancers with metabolic heterogeneity. Oxidative phosphorylation (OXPHOS) has been reported to play an important role in the function of leukemic stem cells and chemotherapy-resistant cells and are associated with inferior prognosis in AML patients. However, the relationship between metabolic phenotype and genetic mutations are yet to be explored. In the present study, we demonstrate that AML cell lines have high metabolic heterogeneity, and AML cells with MLL/AF9 have upregulated mitochondrial activity and mainly depend on OXPHOS for energy production. Furthermore, we show that metformin repressed the proliferation of MLL/AF9 AML cells by inhibiting mitochondrial respiration. Together, this study demonstrates that AML cells with an MLL/AF9 genotype have a high dependency on OXPHOS and could be therapeutically targeted by metformin., Finanziert durch den Open-Access-Publikationsfonds der Westf��lischen Wilhelms-Universit��t M��nster (WWU M��nster).

Poster-Abstract

Neben den klassischen Verfahren zur Chemotherapie, Operation und Strahlentherapie stellt mittlerweile auch die Immuntherapie eine etablierte Komponente in der Therapie von Tumorerkrankungen dar, deren Bedeutung in der letzten Zeit zwar langsam, aber stetig zunimmt.

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2010 Treg gewinnen in der Medizin immer mehr an Bedeutung. Insbesondere, da sie einen negativen Einfluss auf das Ergebnis verschiedener Therapieansätze, wie beispielsweise einer Immuntherapie haben können, ist es von großem medizinischem Interesse, diese Population zu erforschen und gegebenenfalls zu manipulieren. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle der Treg bei MM-Patienten untersucht werden. Hierzu mussten zunächst durchflußzytometrische Protokolle erstellt werden, mit deren Hilfe Treg in Blutproben und Knochenmarkproben identifiziert werden konnten. Die Identifikation der Treg erfolgte hierbei mittels einer Kombination der Treg-spezifischen Oberflächenmarker: CD4+, CD25high, CD62L+, CTLA-4+, CD45RO+, CD45RA+, CD27+ und CD127low. Es ergab sich eine 70,8%ige bis 97,4%ige Positivität für die verwendeten Marker. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchten Treg eher dem „Memory“-Phänotyp als dem naiven Phänotyp entsprachen. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden Blutproben von 11 normalen Spender und 13 Bronchialkarzinompatienten, sowie Blut- und Knochenmarkproben von 42 MM-Patienten miteinander bezüglich der relativen und absoluten Treg-Zahlen verglichen. Die Patienten wurden hierfür in Gruppen eingeteilt, um den Einfluss verschiedener Krankheitsparameter und der Therapie auf die Treg-Zahlen sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigten nur dann eine erhöhte prozentuale Treg-Zahl im peripheren Blut von MM-Patienten gegenüber normalen Spendern, wenn sowohl therapierte, als auch unbehandelte MM-Patienten in einer Gruppe zusammengefasst wurden, was auf einen möglichen Einfluss der Therapie hindeutet. Die Ergebnisse für den Vergleich von untherapierten Patienten mit CTX-Patienten bestätigten diese Vermutung, da gegenüber den unbehandelten Patienten in den Gruppen mit CTX erhöhte Treg-Frequenzen nachgewiesen werden konnten. Eine Einteilung der Patienten bezüglich verschiedener Krankheitsparameter ergab hingegen keine signifikanten Unterschiede in den Treg-Werten. Auch die Auswertugen der Treg-Zahlen im Knochenmark zeigten keinen direkten Einfluß der Krankheit auf die Treg-Werte. Der Vergleich von BK- und MM-Patienten ergab wie erwartet eine signifikant höhere Treg-Frequenz bei BK-Patienten im Vergleich zu normalen Spendern und MM-Patienten. Die in der Literatur beschriebene Erhöhung der Treg-Frequenz bei soliden Tumoren konnte also bestätigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Analysen wurden auch Treg-Zahlen bei zwei Patienten vor, während und nach einer Immuntherapie gemessen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass bei beiden Patienten ein kontinuierlicher Anstieg der prozentualen und absoluten Treg-Zahlen zu sehen ist. Dies weist auf eine Erhöhung der Treg bedingt durch die Immuntherapie hin. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Isolierung, Expansion und mit funktionellen Tests von Treg normaler Spender. Bei der Analyse verschiedener Isoliermethoden, basierend auf magnetischen Beads oder einem FACS, erwies sich diejenige Treg-Aufreinigung als am besten geeignet, die ausschließlich ein FACS verwendet und auf eine Voraufreinigung mittels magnetischer Beads verzichtet. Aufreinigungen durch magnetische Beads ergaben nur sehr geringe Ausbeuten und wurden deshalb als nicht geeignet eingestuft. Bei In-vitro-Expansionen zuvor isolierter Zellen konnte zwar eine Vermehrung der Treg-Fraktion um den Faktor 10 erreicht werden, eine FOXP3-Färbung nach Expansion zeigte allerdings nur eine Positivität der Treg-Fraktion von 9,5%. Somit konnte gezeigt werden, dass eine große Reinheit der Treg-Fraktion von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Treg-Expansion ist, um die Problematik des Überwachsens durch andere in der Treg-Fraktion verbliebene Zellen zu minimieren. Auch die in dieser Arbeit durchgeführten Suppressionstests zeigten eine deutlichere Suppression durch Treg bei Verwendung von zuvor nicht expandierten Zellen. Die vorliegende Arbeit gibt demnach Hinweise auf eine Beeinflussung der Treg-Zahlen bei MM-Patienten sowohl durch die Chemotherapie als auch durch die Immuntherapie. Im Gegensatz zu den Ergebnissen für BK-Patienten konnten für MM-Patienten keine Ergebnisse erzielt werden, die auf einen direkten Einfluss der Krankheit auf Treg schließen lassen. Somit wäre eine weitere Analyse der Reaktion der Treg auf verschiedene Therapien von klinischer Bedeutung, da so eine mögliche negative Beeinflussung der Treg auf den Therapieerfolg verhindert werden kann. Des Weiteren könnten die Mechanismen, mit deren Hilfe Treg resistent gegen konventionelle Chemotherapien werden bzw. schneller als andere CD4-positive Zellen rekonstituieren von medizinischer Bedeutung sein.

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2006 E1A ist ein adenovirales Gen, dessen transkribierte Proteine in die Wachstumssteuerung der Wirtszelle eingreifen und die Virusreplikation vorbereiten. E1A kann in Tumorzellen die Transformation, die Tumorigenität und das Metastasierungspotential supprimieren, Apoptose induzieren und diese für Zytostatika sensibilisieren. Daneben kann es jedoch auch Zellen transformieren und immortalisieren. Es wurden E1A-Derivate entwickelt, die einerseits die onkogenen Potenziale verloren haben, andererseits weiterhin antionkogene Eigenschaften besitzen. Für die Derivate E1AdelCR2 und E1ASpm2 konnten diese Voraussetzungen nachgewiesen werden. Ziel der vorgelegten Arbeit war es, zytostatikaresistente Tumorzellen durch transiente Transfektion mit transformationsdefekten E1A-Derivaten für die Behandlung mit Zytostatika zu sensibilisieren. Eine Induktion von Apoptose und Nekrose sollte quantifiziert werden. Hierzu wurden zunächst Tumorzellen auf Resistenz gegenüber Cisplatin und Doxorubicin untersucht, verschiedene transiente Transfektionsmethoden hinsichtlich Transfektionseffizienz und Zellschädigung evaluiert und ein Modellsystem aufgestellt. Spezifische Zellfärbungen wurden zur Differenzierung zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen verwendet. Es konnten BLM-Zellen mit E1ASpm2 für Cisplatin sensibilisiert werden. Die kombinierte Behandlung mit Derivat und Zytostatikum führte im Wesentlichen zur Nekrose der Melanomzellen. Die Apoptoseinduktion durch die E1A-Konstrukte war dagegen gering. Dies ist besonders interessant, da in der Literatur vor allem der apoptoseinduzierende Effekt von E1A diskutiert wird, sich aber kaum quantitative Auswertungen finden. Für E1AdelCR2 wurde keine signifikante zytostatikasensibilisierende Wirkung nachgewiesen. Die Ergebnisse aus den unspezifischen Vitalitätsassays ließen auf eine hohe Vektortoxizität schließen. Es sollten daher in weiterführenden Versuchen die Derivate in weniger schädigende Vektoren kloniert und die zellulären Mechanismen der Nekrose-induktion durch E1A untersucht werden. Die transiente Transfektion mit E1A könnte schließlich auch in vivo eingesetzt werden.

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2012

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2009 Ziel der Arbeit war es, das auf dem kurzen Arm des humanen Chromosoms 3 (3p) lokalisierte FAM107A-Gen näher zu charakterisieren und eine Funktion als "klassisches" Tumorsuppressorgen (TSG) zu überprüfen. Dazu wurden Untersuchungen an Primärmaterial von Tumor- und korrespondierendem Normalgewebe sowie an Zellkulturen durchgeführt. Die Untersuchungen von diversen Gewebeproben und Tumorzelllinien mit qualitativer RT-PCR zeigten z.T. eine verringerte transkriptionelle Aktivität von FAM107A in unterschiedlichen Tumorproben. Eine in vielen Tumorzelllinien sporadisch detektierte Expression von FAM107A deutete auf bislang unbekannte Regulationsmechanismen hin, die möglicherweise in einer zusätzlichen und/oder anderen Funktion als bei der umorgenese oder -suppression zu suchen sind. Die Expression von FAM107A-mRNA wurde nicht durch Faktoren wie zirkadiane Rhythmik, Temperatur, Zellzyklus oder Konfluenz in den vorliegenden Zellsystemen beeinflusst. Zusätzlich konnte anhand vorliegender Expressionsdaten kein Zusammenhang zwischen der Expression von FAM107A und einer Virusinfektion aufgezeigt werden.Durch Karyotypisierung konnte in einzelnen Zelllinien Aneuploidien des Chromosoms 3 und auch Deletionen von 3p nachgewiesen werden. PCR-Voruntersuchungen an genomischer DNA jedoch schlossen homozygote Deletionen in den untersuchten Genabschnitten von FAM107A aus. In der Nierenkarzinomzelllinie RCC-1 zeigte sich eine Heraufregulation der Expression der FAM107A-mRNA sowohl durch Decitabin- als auch durch TSA-Behandlung. Dies stellte aber eine Einzelbeobachtung epigenetischer Beeinflussung dar, die andere Linien nicht zeigten. Sowohl die Expressionsdaten als auch funktionalen Analysen an den FAM107A-ORF ektopisch exprimierenden Nierenkarzinomzelllinien RCC-1 und HTB-46 konnten eine TSG-Aktivität von FAM107A, wie sie von anderen Gruppen postuliert wurde, in den hier untersuchten Systemen nicht eindeutig belegen. Bei den Analysen fielen Revertanten auf, bei denen die Expression von FAM107A-mRNA verlorengegangen war. Dies könnte als Hinweis auf eine Selektion gegen die FMA107A-Expression sein, was als ein Hinweis auf FAM107A als TSG gewertet werden kann. Diverse Proliferationsanalysen zeigten aber nur entsprechende Tendenzen und dies auch nicht in allen Experimenten. Die Heterogenität der Zelllinien führte dazu, dass keine statistisch auswertbaren Unterschiede detektierbar waren. Wachstumsanalysen in Weichagar zeigten in den mit FAM107A-ORF-Vektor transfizierten Zellen ein verstärktes Koloniewachstum in der Anzahl und der Größe der Kolonien. Dies sprach für eine invasionsfördernde Wirkung von FAM107A, was aber nicht im Zymografieassay belegt werden konnte. Die Sensitivität der Nierenzellkarzinomzelllinien HTB-46 gegenüber Cisplatin in den mit FAM107A-ORF-Vektor transfizierten Zellen wurde erhöht, nicht aber die der RCC-1-Zellen. Weitere, später untersuchte Surrogatmarker der Tumorigenität wie die Expression von Survivin und HLA-Antigenen zeigten, dass die ausgewählten Testsysteme der nativen RCC-1- und HTB-46-Zellen an sich eine geringere Tumorigenität aufwiesen, die durch eine Überexpression von FAM107A nicht moduliert werden konnte. Insgesamt ist festzustellen, dass die Funktion von FAM107A als "klassisches" TSG nicht belegt werden konnte. Dies könnte, wie sich im Verlauf der Arbeit herausstellte,in den in dieser Arbeit verwendeten Zellsystemen begründet sein. Bis jetzt wurden In-vitro-Analysen durchgeführt; bei In-vivo-Experimenten könnten sich weitere und auch andere Resultate ergeben.

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2009

Duisburg, Essen Univ., Diss., 2005 Das Humane Herpesvirus 8 (HHV-8) wird mit der Entstehung des Kaposi-Sarkoms und anderer lymphoproliferativer Erkrankungen, wie das pleurale Effusionslymphom und Morbus Castleman, in Verbindung gebracht. HHV-8 infiziert Zellen des lymphatischen Systems, wie die Endothelzellen der Lymphgefäße und B-Zellen. Drei Proteine von HHV-8, das virale Cyklin, das virale FLIP und LANA werden benötigt, um die latente Phase der Infektion aufrecht zu erhalten. Diese drei Proteine sind Produkte verschiedener Spleißvarianten, die von einem primären RNA-Transkript exprimiert werden und unter der Kontrolle des LANAp stehen. Adenovirale E1A-Proteine sind in der Lage, Tumorwachstum und Metastasierung zu supprimieren, Zellen für Chemotherapeutika zu sensibilisieren und die Aktivität von verschiedenen zellulären und viralen Genen zu regulieren. Es konnte unseres Wissens nach erstmalig gezeigt werden, dass E1A den LANAp in Melanomzellen signifikant regulieren und aktivieren kann. Darum kann der LANAp zu den vielen zellulären und viralen Promotoren, die durch E1A moduliert werden, hinzugefügt werden. An der Aktivierung des LANAp durch E1A sind maßgeblich die Transkriptionsfaktoren AP-2 und SP1 beteiligt. Unter Verwendung von Deletionsmutanten von E1A konnte nachgewiesen werden, dass ein intakter N-Terminus von E1A mit den Aminosäuren 1 – 119 essentiell für die Aktivierung des LANAp durch E1A ist. Die konservierte Region 3 (CR3) von E1A schien dabei nicht von Bedeutung zu sein, obwohl diese Region bisher als die Haupttransaktivierungs-Domäne beschrieben wurde. Die Spm2-Mutante, in deren “Spacer”-Region sechs konsekutive Alaninreste deletiert wurden, aktivierte den LANAp ca. 15-fach gegenüber der Vektorkontrolle in der Melanomzelllinie MV3. In HHV-8-positiven Lymphozyten konnte keine Regulation des LANAp durch E1A beobachtet werden. Möglicherweise wird die Funktionalität von E1A durch lymphogene regulatorische Elemente verursacht. Da bereits beschrieben wurde, dass der LANAp durch LANA autoreguliert wird, wurden Expressionsvektoren, die sowohl LANA alleine als auch die drei latenten Gene (vCyclin, vFLIP und LANA) trugen, mit E1A-cDNA und LANAp kotransfiziert. Es konnte keine Minderung in Bezug auf die Aktivierung des LANAp durch E1A festgestellt werden. Weiterhin konnte kein Hinweis auf einen möglichen Zelltod durch E1A in den HHV-8-positiven Lymphozyten gefunden werden. Allerdings wurde die Sensibilisierung der BC-3-Zellen durch Ad12 E1A gegenüber dem Zytostatikum Cyclophosphamid beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der LANAp durch E1A-Proteine mit intaktem N-Terminus in MV-3-Zellen aktiviert wird. Da aber eine Regulation des LANAp durch E1A in den HHV-8-positiven B-Lymphozyten ausblieb und auch das Überleben dieser Zellen durch die Transfektion von E1A-cDNA nicht verändert werden konnte, scheint E1A als Transgen in der Gentherapie HHV-8-assoziierter Tumore nicht geeignet zu sein.