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Three commercial kits of One-Step RT-qPCR were evaluated for the molecular diagnosis of Canine Distemper Virus. Using the kit that showed better performance, two systems of Real-time RT-PCR (RT-qPCR) assays were tested and compared for analytical sensitivity to Canine Distemper Virus RNA detection: a One-Step RT-qPCR (system A) and a One-Step RT-qPCR combined with NESTED-qPCR (system B). Limits of detection for both systems were determined using a serial dilution of Canine Distemper Virus synthetic RNA or a positive urine sample. In addition, the same urine sample was tested using samples with prior centrifugation or ultracentrifugation. Commercial kits of One-Step RT-qPCR assays detected canine distemper virus RNA in 10 (100%) urine samples from symptomatic animals tested. The One-Step RT-qPCR kit that showed better results was used to evaluate the analytical sensitivity of the A and B systems. Limit of detection using synthetic RNA for the system A was 11 RNA copies µL-1 and 110 RNA copies µl-1 for first round System B. The second round of the NESTED-qPCR for System B had a limit of detection of 11 copies µl-1. Relationship between Ct values and RNA concentration was linear. The RNA extracted from the urine dilutions was detected in dilutions of 10-3 and10-2 by System A and B respectively. Urine centrifugation increased the analytical sensitivity of the test and proved to be useful for routine diagnostics. The One-Step RT-qPCR is a fast, sensitive and specific method for canine distemper routine diagnosis and research projects that require sensitive and quantitative methodology. RESUMO: Três kits comerciais de One-Step RT-qPCR foram avaliados para o diagnóstico molecular do Vírus da Cinomose Canina.Utilizando o kit que apresentou melhor desempenho, dois sistemas de RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) foram comparados quanto à sensibilidade analítica na detecção do RNA do Vírus da Cinomose Canina:One-Step RT-qPCR (Sistema A) e One-Step RT-qPCR seguido da NESTED-qPCR (Sistema B).Os limites de detecção dos dois sistemas foram determinados utilizando diluição seriada de RNA sintético do Vírus da Cinomose Canina ou de uma amostra de urina positiva. Adicionalmente, uma amostra de urina foi avaliada com centrifugação ou ultracentrifugação prévia. Os kits comerciais de One-Step RT-qPCR amplificaram o RNA do vírus da cinomose canina em 10 (100%) amostras de urinas de animais sintomáticos. O kit de One-Step RT-qPCR que apresentou melhor resultado foi utilizado para avaliar a sensibilidade analítica dos sistemas A e B. Na reação da curva padrão com RNA sintético, o limite de detecção do sistema A foi de 11 cópias de RNA µL-1. No sistema B foi de 110 cópias de RNA µL-1 na One-Step RT-qPCR e 11 cópias de RNA µL-1 na NESTED-qPCR. A relação entre os valores de Ct e concentração de RNA foi linear. O RNA extraído das diluições da urina foi detectado nas diluições de 10-3 e10-2 pelos sistemas A e B, respectivamente. A centrifugação prévia da urina aumentou a sensibilidade analítica da análise e mostrou ser importante para a rotina diagnóstica. A reação de One-Step RT-PCR é um método rápido, sensível, específico e aplicável na rotina de diagnóstico molecular da cinomose e em projeto de pesquisa que requer metodologia quantitativa e sensível.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:51:00Z No. of bitstreams: 1 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T19:42:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) S0100-736X2012000200002.pdf.txt: 26444 bytes, checksum: 8aa490d5d623e1ef42bb0f809e5c221a (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:39:09Z No. of bitstreams: 2 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) S0100-736X2012000200002.pdf.txt: 26444 bytes, checksum: 8aa490d5d623e1ef42bb0f809e5c221a (MD5) Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:39:09Z No. of bitstreams: 2 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) S0100-736X2012000200002.pdf.txt: 26444 bytes, checksum: 8aa490d5d623e1ef42bb0f809e5c221a (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) S0100-736X2012000200002.pdf.txt: 26444 bytes, checksum: 8aa490d5d623e1ef42bb0f809e5c221a (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 Made available in DSpace on 2014-05-20T13:39:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-736X2012000200002.pdf: 142755 bytes, checksum: 2f558294e5f6cfed098a384f752ddc56 (MD5) S0100-736X2012000200002.pdf.txt: 26444 bytes, checksum: 8aa490d5d623e1ef42bb0f809e5c221a (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) é um preparado do sangue total que contém diversos fatores de crescimento responsáveis pela proliferação e diferenciação celular, angiogênese, como também pelo aumento da produção da matriz extracelular. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi testar 10 protocolos diferentes de centrifugação para obtenção de PRP a partir do sangue total de equinos hígidos. Para isso foram utilizadas 10 amostras de 27mL de sangue total de cinco animais, as quais foram centrifugadas conforme cada protocolo proposto. Os resultados revelaram que os protocolos com menor força de centrifugação relativa resultaram em maior (p0,05) influência do tempo de centrifugação em relação a essa variável. A influência do tempo foi observada apenas no número de leucócitos em protocolos com menor força de centrifugação relativa (FCR). Os quatro melhores protocolos, que obtiveram as maiores concentrações de plaquetas, foram submetidos à análise pelo teste de ELISA para dosar a quantidade de TGF-β que não revelou diferença (p>0,05) entre os protocolos. Platelet-rich plasma (PRP) is a prepared of the whole blood which contains several growth factors responsible for cellular proliferation and differentiation, angiogenesis, and for the increase of the extracellular matrix. Thus, the aim of this study was to test 10 different centrifugation protocols to obtain PRP from the whole blood of healthy equines. Ten samples of 27mL of the whole blood of 5 healthy equines were used, which were centrifuged in accordance to the proposed protocols. The results showed that the protocols with less relative centrifugation force resulted in greater (p 0.05) between the protocols. Universidade Estadual Paulista Faculdadede Medicina Veterinária e Zootecnia Universidade Estadual Paulista Faculdadede Medicina Veterinária e Zootecnia

Artificial insemination is routinely used in the swine industry to reduce the costs of production through to increase the efficiency of the refrigerated boar semen process. The objective of this study was to evaluate the effect of different levels of cysteine (CYS) added to the Beltsville Thawing Solution (BTS) extender semen during cooling for up to 72 hours. Ejaculated from three boars were collected with the gloved-hand technique and semen aliquots were diluted in BTS as follow: BTS only (BTS), BTS + 0.1mM cysteine (CYS0.1), BTS + 0.5mM cysteine (CYS0.5), BTS + 1.0mM cysteine (CYS1.0), BTS + 2.5mM cysteine (CYS2.5), BTS + 5.0mM cysteine (CYS5.0), BTS + 10.0mM cysteine (CYS10.0), and BTS + 20.0mM cysteine (CYS20.0). Evaluation of sperm integrity were analyzed using 0.5mg/ml propidium iodide (plasma membrane), 100µg/ml isothiocynate-conjugated Pisum sativun agglutinin (acrosomal membrane) and 153µM 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (mitochondria potential) after semen dilution at specific times (0, 24, 48 and 72 hours). Additionally, we also evaluated the effects of 5.0 mM CYS addition in the BTS extender on the maintenance of sperm quality and their influence on fertility in the swine production. After artificial insemination, animals were evaluated based on the estrous return and the number of piglet's born. Cysteine at concentrations of 10.0 and 20.0mM resulted in more pronounced reductions even at the time zero. Semen viability decreased to levels below 10% at these high levels of CYS in the first 24 hour of storage at 17ºC. At the end of the storage time, less than 65% of sperm cells had intact plasma membrane in all groups. The sperm viability decreased significantly when the semen was added at high concentrations of CYS (time "0"; CYS10.0 and CYS20.0; p

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:56:30Z No. of bitstreams: 1 S0102-09352011000300002.pdf: 233493 bytes, checksum: 5094bd900d00f38cb747d4ff63b4af05 (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0102-09352011000300002.pdf: 233493 bytes, checksum: 5094bd900d00f38cb747d4ff63b4af05 (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T18:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0102-09352011000300002.pdf: 233493 bytes, checksum: 5094bd900d00f38cb747d4ff63b4af05 (MD5) S0102-09352011000300002.pdf.txt: 30539 bytes, checksum: ae43cbd6b0eb5b6c0e7561636e91399e (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:15:20Z No. of bitstreams: 2 S0102-09352011000300002.pdf: 233493 bytes, checksum: 5094bd900d00f38cb747d4ff63b4af05 (MD5) S0102-09352011000300002.pdf.txt: 30539 bytes, checksum: ae43cbd6b0eb5b6c0e7561636e91399e (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:15:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0102-09352011000300002.pdf: 233493 bytes, checksum: 5094bd900d00f38cb747d4ff63b4af05 (MD5) S0102-09352011000300002.pdf.txt: 30539 bytes, checksum: ae43cbd6b0eb5b6c0e7561636e91399e (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O objetivo do presente estudo foi determinar o enriquecimento de espermatozoides portadores do cromossomo X após a centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll ou OptiPrep, utilizando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) do DNA do espermatozoide e dos embriões bovinos produzidos in vitro resultantes pela PCR convencional. Espermatozoides descongelado foram depositados em gradientes de densidade e os tubos foram centrifugados. Os sobrenadantes foram gentilmente aspirados e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. As taxas de clivagem e de blastocisto foram determinadas pela produção in vitro de embriões e a PCR foi realizada para a identificação genética do sexo dos embriões. Verificou-se diferença na taxa de blastocistos entre os grupos Percoll e OptiPrep (P

Protocols for cooling or freezing goat semen usually recommend centrifugation for seminal plasma removal. However, little is known about the effect of this process on goat sperm viability and functionality. The present study evaluated the effects of centrifugation force on the plasma membrane, acrosomes, and DNA integrity of goat semen. Four ejaculates from each of the four different Anglo Nubian male goats were used. Semen samples were obtained using artificial vagina, and immediately after collection, ejaculates were diluted using Ringer’s sodium lactate solution and split into three groups: Control (CG, without centrifugation), G1 (centrifugation 600 x g/10 min), G2 (centrifugation 1200 x g/10 min). After centrifugation, seminal plasma was removed, the sperm pellets were resuspended using Tris-egg yolk extender (80 x 106 spermatozoa/mL) and the sperm morphology was analyzed. Samples were cooled at 5°C for 5, 24, 36, and 48 h and then sperm plasma membrane and acrosome integrity (PMAI, %) and sperm DNA fragmentation index (SDF, %) were evaluated at each time-point, using a flow cytometer. Additionally, sperm movement was determined using computer semen analysis (CASA) after 5, 24, and 48 h of refrigeration period. The semen centrifugation did not induce additional sperm morphology defect or reduction in sperm kinetics in the experimental groups. Differences were not observed (p > 0.05) in PMAI and SDF among different groups, in any of each timepointof the cooling process. In conclusion, centrifugation, even at high speeds, did not affect goat sperm integrity and functionality when submitted to refrigeration process. A maior parte dos protocolos de refrigeração e criopreservação do sêmen caprino recomenda o uso de centrifugação para remoção do plasma seminal. No entanto, não existe consenso sobre o risco que esse tipo de processamento pode ocasionar à viabilidade espermática. Nesse contexto, o presente trabalho investigou os possíveis efeitos deletérios da centrifugação sobre a integridade estrutural e DNA de espermatozoides caprinos. Para a pesquisa foram selecionados quatro reprodutores para colheita de sêmen (n = 4 ejaculados/bode). Cada ejaculado foi fracionado em três alíquotas iguais, diluídas em ringer e divididas em três grupos: Controle (GC, não centrifugado), G1 (centrifugação a 600 g/10 minutos) e G2 (centrifugação a 1200 g/10 minutos). As amostras seminais por grupo foram diluídas em meio Tris gema respeitando-se a concentração final de 80 milhões de espermatozoides/mL e foram submetidas à avaliação de morfologia espermática. Todas as amostras foram acondicionadas a 5°C, sendo analisadas nos momentos 5, 24, 36 e 48 horas do processo de refrigeração por meio da avaliação da integridade de membrana plasmática e acrossomal (MPAI, %) e índice de fragmentação de DNA (IDF, %). Adicionalmente, a cinética espermática foi avaliada com o emprego de um sistema computadorizado de análise (CASA) nos momentos 5, 24 e 48 horas da refrigeração. A centrifugação não induziu a manifestação de defeitos morfológicos ou redução significativa da cinética deespermatozoides caprinos. Não foram observadas diferenças para a integridade de membrana plasmática e para o índice de fragmentação de DNA quando comparados, respectivamente, GC, G1 e G2 em cada um dos quatro momentos experimentais. Conclui-se que mesmo quando empregadas altas forças de rotação não ocorre lesão à ultraestrutura dos espermatozoides caprinos submetidos ao processo de refrigeração.

ResumoA azoospermia é definida como a ausência de espermatozoide no líquido seminal ejaculado pelo homem depois de aplicada a técnica de centrifugação em pelo menos duas amostras. Dada a importância de um diagnóstico correto da análise seminal para os casais, toda amostra que não apresentar espermatozoides no exame a fresco deve seguir em avaliação laboratorial. Com isso, o presente estudo tem como objetivo analisar os resultados de centrifugação de uma alíquota do sêmen ejaculado ou de todo o volume ejaculado de pacientes com diagnóstico de azoospermia para determinar qual o melhor método a ser empregado na análise seminal para esse grupo de pacientes.AbstractThe azoospermia is defined as the absence of sperm in the ejaculate by the seminal fluid man after centrifugation technique conducted in at least two samples. Given the importance of a correct diagnosis of the seminal analysis for couples, all sample no sperm present in fresh examination should follow in laboratory tests. Thus the present study aims to analyze the results of a spin rate of ejaculate or all of the ejaculate volume of patients with azoospermia to determine the best method to be used in semen analysis for this group of patients.