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There are no records of autochthonous cases of canine visceral leishmaniasis in the city of Curitiba, Paraná state, Brazil. In 2020, a male French bulldog (CW01), approximately 2 years old was taken by its owners to a private veterinarian clinic. The suspicion of CVL was confirmed by means of a serology test (ELISA/IFAT reagent), rapid chromatographic immunoassay (DPP®) (ELISA - Biomanguinhos®), parasitological culture and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The animal routinely frequented parks in Curitiba and was taken on several trips to the municipalities of Bombinhas and Balneário Camboriú (Santa Catarina) and to Matinhos (Paraná) where CVL had not previously been reported. Treatment was initiated orally with Milteforan™ which resulted in a significant reduction in the parasitic load. The suspicion of autochthony was investigated through entomological research. A total of 10 traps were installed, one at the animal’s home, seven in adjacent city blocks and two in a forest edge. No sandflies were trapped in the dog’s home and adjacent houses. The traps in the forest edge caught one Migonemyia migonei female and five Brumptomyia spp. females. This case serves as a warning of the possible introduction of CVL in the city of Curitiba. Resumo Não há registros de casos autóctones de leishmaniose visceral canina (LVC) no município de Curitiba, Paraná, Brasil. Em 2020, um "bulldog" francês macho (CW01), com aproximadamente 2 anos de idade, foi levado por seus donos a uma clínica veterinária particular. A suspeita de LVC foi confirmada por meio de teste sorológico (reagente ELISA/IFAT), imunoensaio cromatográfico rápido (DPP®) (ELISA - Biomanguinhos®), cultura parasitológica e reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR). O animal frequentava, rotineiramente, parques de Curitiba e foi levado em diversas viagens para Bombinhas e Balneário Camboriú (Santa Catarina) e para Matinhos (Paraná), onde a LVC não havia sido relatada anteriormente. O tratamento foi iniciado por via oral com Milteforan™ (Virbac) o que resultou em redução significativa da carga parasitária. A suspeita de autóctone foi investigada por meio de pesquisa entomológica. Foram instaladas 10 armadilhas, uma na casa do animal, sete em quarteirões adjacentes e duas na borda da mata. Nenhum inseto foi capturado na casa do proprietário do animal e nas casas adjacentes. As armadilhas na borda da mata capturaram uma fêmea de Migonemyia migonei e cinco Brumptomyia spp. fêmeas. Este caso serve de alerta para a possível introdução da LVC na cidade de Curitiba.

Human Visceral Leishmaniasis (VL) is expanding, and it is distributed in the five geographic regions of Brazil, with the Northeast being the region that presents the most significant number of registered cases. The main urban reservoir of the etiological agent of VL is the domestic dog, and it is known that canine cases precede human cases. One of the control actions of VL, recommended by the Ministry of Health, is performing the euthanasia of seropositive dogs. In 2013, in the municipality of Iguatama/MG, the first canine serological survey was carried out in the city, with a prevalence of 8.3% of seropositive dogs for Leishmania infantum. Of the seropositive animals for Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) in this survey, 84% were euthanized, and 16% died within two years after diagnosis. No other control measures for CVL were taken in the municipality. The objectives of the present study were to determine the current prevalence of seropositive dogs for CVL in the municipality of Iguatama and to observe the impact of euthanasia of seropositive dogs to VL as the only control measure performed in this municipality, which is considered an enzootic area of the disease. For this, a new canine epidemiological survey was carried out in the municipality of Iguatama, following the guidelines of the Manual of Surveillance and Control of Visceral Leishmaniasis. Blood samples were collected from 270 dogs and tested by DPP® immunochromatographic test and by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). The animals that presented inconclusive results had new blood samples collected and analyzed. The only animal that showed a positive result in DPP® and undetermined in the ELISA, in the first evaluation, became seropositive four months later, so this study reinforces the recommendation of the Ministry of Health to reassess dogs that present inconclusive results for CVL. From a total of 270 samples, 21 (7.8%) were reagents in both tests. Thus, the prevalence of seropositive dogs for CVL, in 2017, in the urban area of the municipality of Iguatama was 7.8%. The Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) molecular technique confirmed infection by L. infantum in the ten dogs sampled with CVL-positive serology. The comparison between the current prevalence (after euthanasia) with that found in 2013 (8.3%), there was no significant difference (p=0.764). The prevalence of CVL in the urban area of the municipality of Iguatama is still high, making it possible to presume that the euthanasia of seropositive dogs for CVL, and the absence of monitoring or other interventions measures, did not contribute to decrease the transmission of the parasite and was not sufficient for the control of CVL in the municipality of Iguatama, an area considered as non-endemic to CVL until 2013. RESUMO: A Leishmaniose visceral humana (LV) está em franca expansão e distribuída nas cinco regiões geográficas do Brasil, o Nordeste sendo a região em que há o maior número de casos registrados. O principal reservatório urbano do agente etiológico da LV é o cão doméstico e sabe-se que casos caninos antecedem o aparecimento de casos humanos. Uma das ações de controle da LV, preconizada pelo Ministério da Saúde, é a eutanásia dos cães soro reagentes. Em 2013, no município de Iguatama/MG, foi realizado o primeiro inquérito sorológico canino na cidade, sendo constatada uma prevalência de 8,3% de cães soro reagentes para Leishmania infantum. Dos animais com sorologia positiva para Leishmaniose visceral canina (LVC), neste inquérito, 84% foram eutanasiados e 16% foram a óbito em, no máximo, dois anos após o diagnóstico. Nenhuma outra medida de controle para LVC foi realizada no município. Os objetivos deste estudo foram determinar a prevalência atual de cães soro reagentes para LVC no município de Iguatama e observar o impacto das eutanásias de cães soro reagentes para LV como única medida de controle realizada neste município, considerado área enzoótica para a doença. Para isso, foi realizado um novo inquérito epidemiológico canino no município de Iguatama, seguindo as normas do Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. Foram colhidas amostras sanguíneas de 270 cães que foram examinadas pelo teste imunocromatográfico DPP® e pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). Os animais que apresentaram resultados inconclusivos tiveram novas amostras de sangue coletadas e analisadas. O único animal que apresentou resultado positivo no DPP® e indeterminado no ELISA, na primeira avaliação, soro converteu quatro meses depois, o que reforça a recomendação do Ministério da Saúde de reavaliar os cães que apresentam resultado inconclusivo para LVC. Do total das 270 amostras, 21 foram reagentes nos dois testes. Portanto, a prevalência de cães soro reagentes para LVC, em 2017, na área urbana do município de Iguatama foi igual a 7,8%. A infecção pela espécie Leishmania infantum foi confirmada através da técnica molecular de PCR-RFLP em 10 cães amostrados com sorologia positiva para LVC. A comparação entre a prevalência atual (depois das eutanásias) com a encontrada em 2013 (8,3%), não mostrou diferença significativa (p=0,764). Uma vez que a soro prevalência de LVC na área urbana do município de Iguatama ainda é alta, pode-se supor que a eutanásia dos cães soro reagentes para LVC, somada à ausência de monitoramento e de outras medidas de intervenção, não contribuiu para a diminuição da transmissão do parasito, e não foi suficiente para o controle de LVC no município de Iguatama, uma área considerada, até 2013, indene para LVC.

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduaçãoem Biociências, do Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza, da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências, área de concentração Biociências. Atualmente a Leishmaniose Visceral (LV) é considerada a mais negligenciada de todas as doenças negligenciadas e sua prevalência excede 12 milhões de casos em todo o mundo. Além de endêmica, a LV encontra-se em franca expansão em várias regiões do Brasil e do mundo. Destaca-se o aparecimento da doença em países do Mercosul, considerados anteriormente como indenes para LV. Em relação à Leishmaniose Visceral Canina (LVC), recentemente o Ministério da Saúde, junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), publicou uma nota técnica liberando o tratamento da enfermidade canina com a miltefosina (MAPA/MS, 2016). Entretanto, o tratamento com esta droga ainda não é capaz de resolver o problema no cão, permanecendo o mesmo parasitado e necessitando repetir o mesmo protocolo terapêutico após alguns meses. Nesse contexto, a utilização da imunoterapia tem ganhado grande atenção na busca por protocolos terapêuticos mais efetivos, principalmente nas formas mais graves da LV e LVC. No presente estudo, foi realizada uma pesquisa com 9 animais naturalmente infectados por Leishmania infantum, grupo tratado com imunoterápico LaSap (Antígenos totais de L. amazonensis mais saponina), seguido da administração do Alopurinol (n= 4), obedecendo o protocolo do fabricante e grupo tratado unicamente com o imunoterápico LaSap (n= 5). Todos os animais melhoraram os sinais clínicos atribuídos a LVC, não demonstraram alteração em exames hematólógicos e o qPCR de medula e pele indicaram redução da carga parasitária na medula no grupo vacina em T0 (antes do início do tratamento) e T2 (após o tratamento) P=0,038 (36,6+10,0) e ente os grupos vacina + alopurinol em T2, P=0,01, (47,0+33,7). Na pele, não houve diferenças estatísticas ente os dois grupos em T2, somente no grupo vacina em T0 e T2 P=0,01 (14,8+12,7) e grupo vacina + alopurinol em T0 e T2, P=0,05 (19,8+19,1). Neste sentido, verificamos que ambas as estratégias de tratamento foram capazes de melhorar as condições clínicas, bem como reduzir a carga parasitária na pele e medula.

The objective of this study was to estimate the prevalence of canine visceral leishmaniasis (CVL) and to identify the differences in associated factors to its occurrence in urban area and countrysides in the municipality of Santa Luzia located in the semi-arid region of Paraíba. In the years 2015 and 2016, 779 blood samples from dogs were collected. The prevalence was determined by three serological techniques, ELISA-S7® Kit, DPP® Rapid Test and EIE-LVC® Kit, considering positive the samples that reacted in at least two assays. Associated factors were determined by univariate and multivariate analyzes of the guardians’ responses to the epidemiological questionnaire. The prevalence of anti-Leishmania infantum antibodies in the studied municipality was 15.00% (117/779), being higher in the urban area (15.20%) than in the countryside (13.60%). The neighborhood with the highest prevalence was Frei Damião with 26.40% (33/125), being considered a hotspot (OR 1.245, p=0.007). Other associated factors were the semi-domiciliary breeding (OR 1.798, p=0.025), in the urban area, and hunting dog (OR 18.505, p=0.016), contact with cattle (OR 17.298, p=0.022) and environment where the dog is raised (OR 4.802, p=0.024) in the countryside. In the municipality of Santa Luzia, the prevalence of canine visceral leishmaniasis is high and the disease is widely distributed. Epidemiological differences between urban area and the countryside could be observed demonstrating the need for more adequate control measures for each locality and proving the urbanization process. RESUMO: O objetivo desta pesquisa foi estimar a prevalência da leishmaniose visceral canina (LVC) e identificar as diferenças nos fatores relacionados à sua ocorrência nas zonas urbana e rural do município de Santa Luzia, localizado no semiárido paraibano. Nos anos de 2015 e 2016, coletaram-se 779 amostras de sangue de cães. A prevalência foi determinada através de três técnicas sorológicas, Kit ELISA-S7®, teste rápido DPP® e Kit EIE-LVC®, considerando positivas as amostras que reagiram em, pelo menos, dois ensaios. Os fatores relacionados foram determinados por meio das análises estatísticas uni e multivariada das respostas dos tutores ao questionário epidemiológico. A prevalência de anticorpos anti-Leishmania infantum encontrada no município estudado foi de 15,00% (117/779), sendo maior na zona urbana (15,20%) do que na rural (13,60%). O bairro que apresentou maior prevalência foi o Frei Damião com 26,40% (33/125), sendo considerado um hotspot (OR 1,245; p=0,007). Outros fatores relacionados encontrados foram a criação semidomiciliar (OR 1,798; p=0,025), na zorna urbana, e cão de caça (OR 18,505; p=0,016), contato com bovinos (OR 17,298; p=0,022) e ambiente onde o cão é criado (OR 4,802; p=0,024), na zona rural. Verifica-se a elevada prevalência da leishmaniose visceral canina e a sua ampla distribuição no município de Santa Luzia. Diferenças epidemiológicas entre as zonas urbana e rural puderam ser observadas, demonstrando a necessidade de medidas de controle mais adequadas para cada localidade e comprovando o processo de urbanização.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose causada comumente por Leishmania (Leishmania) infatum, afetando no contexto urbano principalmente cães domésticos. Esses reservatórios apresentam intenso parasitismo visceral e cutâneo, o que favoreceria a infecção dos vetores. A enzootia canina, regularmente, precede a ocorrência da LV em humanos. A presente pesquisa tem os objetivos de caracterizar clinicamente os animais; diagnosticar a LVC; identificar as espécies de protozoários do gênero Leishmania causando LVC e caracterizar molecularmente isolados obtidos a partir de aspirados de medula óssea. O estudo foi realizado na cidade de Januária, localizada na região norte do Estado de Minas Gerais, Brasil. Foram coletadas amostras de soro, fragmentos de baço, pele de orelha e aspirados de medula óssea de 100 animais infectados em dois momentos e áreas: 2017, zona urbana e 2019 zona rural. O diagnóstico foi confirmado por meio de sorologia (DPP, RIFI e ELISA) e também por PCR-ITS1 em amostras de pele, baço e medula óssea. Para identificação da espécie foi realizada a RFLP nas amostras PCR positivas. Amostras de aspirados de medula óssea foram colocados em meio de cultura NNN/LIT para obtenção de isolados. DNA dos isolados (n=27) foi extraído, purificado, amplificado e sequenciado. Todos os animais desse estudo apresentaram sinais clínicos sugestivos de LVC, cuja pontuação observada através de confecção de escore foi de 2-17 pontos (0-19), caracterizando a população amostral como clinicamente sintomática e permitindo inferências de presença de correlação com a titulação de anticorpos (RIFI). A confirmação diagnóstica de LVC foi evidenciada em 100% dos cães, em pelo menos uma das técnicas citadas. Por PCR-RFLP foi feita a identificação de L. (L.) infantum em 72% dos animais, não tendo sido identificada outra espécie. Foram isoladas 27 cepas, das quais 20 tiveram os genomas completos sequenciados (SGC) que foram analisados juntamente com o genoma de referência de L. infantum (JPCM5). Alterações de ploidia foram detectadas independente de localização (urbana ou rural) e/ou temporalidade (2017 ou 2019). Todos os genomas sequenciados exibiram polissomia do cromossomo 31, bem como, os isolados urbanos/2017 poliploida do cromossomo 23. As análises de enriquecimento funcional por GO no cromossomo 23 revelaram enriquecimentos gênicos envolvidos em processos enzimáticos de conversão de acetato em acetil-Coa mediado por AceCS para síntese de lipídeos e em degradação de Heme, importante para limitar a produção de radicais livre em macrófagos parasitados. Tanto as análises de ploidia, como de SNVs (PCA) revelaram a existência de 2 clusters principais: 1º) Cluster urbano- constituído de todas os genomas urbanos isolados em 2017; 2°) Cluster rural: formado por todas as cepas rurais isoladas em 2019. Análises de SNVs evidenciaram entre 814 e 987 variantes em cada genoma e 99,99% de identidade entre os 20 genomas. Em suma, os 2 clusters principais formados foram caracterizados por temporalidade ou ano de coleta das espécimes clínicas (2017 e 2019) e/ou localização geográfica (urbana e rural), sendo o primeiro cluster, urbano/2017 e o segundo rural/2019, sugerindo interferências espaciais e/ou temporais nos processos evolutivos genômicos desse organismo. Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis commonly caused by Leishmania (Leishmania) infatum, affecting mainly domestic dogs in the urban context. These hosts have intense visceral and cutaneous parasitism, which would facilitate infection of the vectors. Canine enzooty regularly precedes the occurrence of VL in humans. The present research aims to clinically characterize the animals; diagnose CVL; to identify the protozoan species of the genus Leishmania causing CVL and to characterize molecularly isolates obtained from bone marrow aspirates. The study was carried out in the city of Januária, located in the northern region of the State of Minas Gerais, Brazil. Serum samples, spleen fragments, ear skin and bone marrow aspirates were collected from 100 infected animals in two moments and areas: 2017 urban area and 2019 rural area. The diagnosis was confirmed by serology (DPP, RIFI and ELISA) and also by PCR-ITS1 in samples of skin, spleen and bone marrow. For species identification, RFLP was performed on PCR positive samples. Samples of bone marrow aspirates were placed in NNN / LIT culture medium to obtain isolates. DNA from the isolates (n = 27) was extracted, purified, amplified and sequenced. All animals in this study showed clinical signs suggestive of CVL, that the score observed was 2-17 points (0-19), characterizing the sample population as clinically symptomatic and allowing inferences of correlation with antibody titers (RIFI). The diagnostic confirmation of CVL was evidenced in 100% of the dogs, in at least one of the techniques mentioned. By PCR-RFLP, L. (L.) infantum was identified in 72% of the animals, with no other species identified. 27 strains were isolated, of which 20 had the sequenced genomes that were analyzed together with the reference genome of L. infantum (JPCM5). Ploidy alteration were detected regardless of location (urban or rural) and / or temporality (2017 or 2019). All sequenced genomes exhibited polysomy of chromosome 31, as well as urban isolates / 2017 polyploid of chromosome 23. Analyzes of functional enrichment by GO revealed gene enrichments involved in enzymatic processes of conversion of acetate to acetyl-Coa mediated by AceCS for lipid synthesis (Figure 13) and Heme degradation, to limit the production of free radicals in macrophages parasitized. Both ploidy and SNVs (PCA) analyzes revealed the existence of 2 main clusters: 1st) Urban cluster - consisting of all urban genomes isolated in 2017; 2 °) Rural cluster: formed by all isolated rural strains in 2019. Analysis of SNVs showed between 814 and 987 variants in each genome and 99.99% identity among the 20 genomes. In short, the 2 main clusters formed were characterized by temporality or year of collection of clinical specimens (2017 and 2019) and / or geographic location (urban and rural), with the first cluster, urbano / 2017 and the second rural / 2019, suggesting spatial and / or temporal interferences in the genomic evolutionary processes of this organism.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Os cães são os reservatórios primários dos parasitos do gênero Leishmania. A resposta imunológica induzida por Leishmania infantum é importante para a resistência à infecção e para a patogenia nestes animais. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de enzimas proteolíticas que desempenham múltiplos papeis na resposta imunológica e no remodelamento tecidual. Entretanto, a ação destas enzimas pode levar à imunopatogênese em um processo infeccioso, que causa morbidade ou mortalidade do hospedeiro. Poucos estudos demonstram a correlação entre a expressão de MMPs e as manifestações clínicas dos animais portadores de leishmaniose visceral canina (LVC). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de MMPs em cães infectados naturalmente por Leishmania infantum e correlaciona-los aos quadros de manifestações clínicas da doença (assintomáticos, oligossintomáticos, sintomáticos). Para isso, a expressão relativa das MMPs, seus inibidores teciduais (TIMPs) e as citocinas, IL-10 e TNF-α, foi analisada no tecido hepático dos cães por meio de PCR em tempo real. O processo inflamatório e a citoestrutura do tecido hepático foi mensurado usando a coloração de hematoxilina-eosina. Cães infectados por L. infantum apresentaram aumento na expressão de MMPs (2, 3, 9, 11 e 13) e TIMPs (1 e 4) em tecido hepático, quando comparado a animais não infectados. Ademais, animais sintomáticos e oligossintomáticos apresentaram maior expressão de MMP-2 e IL-10, quando comparado ao grupo de cães assintomáticos. Cães oligossintomáticos apresentaram infiltrado inflamatório hepático maior e mais difuso, quando comparado a cães assintomáticos e sintomáticos. Os resultados indicam que a elevada expressão de MMPs (MMP2, MMP3, MMP9, MMP11 e MMP13) e TIMPs (TIMP1 e TIMP4) está correlacionada positivamente a expressão das citocinas TNF-α e IL-10 em cães naturalmente infectados por L. infantum, podendo contribuir para a destruição do parênquima hepático e para a evolução clínica da leishmaniose visceral nos animais. Dogs are the primary reservoir of Leishmania parasites. The immune response induced by Leishmania infantum is important for resistance to infection and pathogenesis in these animals. Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of proteolytic enzymes that play multiple roles in immune response and matrix remodeling. However, the enzyme action may lead to immunopathology in an infectious process that causes host morbidity or mortality and favors the the pathogen spread and its persistence. Few studies demonstrate the correlation between MMPs expression and clinical manifestations of animals with canine visceral leishmaniasis (CVL). The aim of the study was to evaluate matrix metalloproteinases expression in dogs naturally infected with Leishmania infantum and correlate them to the clinical manifestations of the disease (asymptomatic, oligosymptomatic, symptomatic). The relative expression levels of MMPs, their tissue inhibitors (TIMPs) and the cytokines, IL-10 and TNF-α, were analyzed in liver tissues of dogs by real time PCR. The inflammatory process and cytostructure of liver tissue were measured using hematoxylin-eosin staining. Dogs infected with L. infantum showed increased expression of MMPs (2, 3, 9, 11 and 13) and TIMPs (1 and 4) in liver tissue, when compared to uninfected animals. In addition, symptomatic and oligosymptomatic animals showed higher expression of MMP-2 and IL-10, when compared to the group of asymptomatic dogs. Oligosymptomatic dogs showed larger and more diffuse hepatic inflammatory infiltrate when compared to asymptomatic and symptomatic dogs. The results indicate that the high expression of MMPs (MMP2, MMP3, MMP9, MMP11 and MMP13) and TIMPs (TIMP1 and TIMP4) is positively correlated with the expression of the cytokines TNF-α and IL-10 in dogs naturally infected by L. infantum, which may contribute to the destruction of the liver parenchyma and to the clinical evolution of visceral leishmaniasis in animals.

The purpose of the present work was to evaluate the accuracy of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) performed on samples of fresh frozen tissue (FT) and formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) healthy skin. This is a validation study conducted with samples from 46 dogs from an endemic area in Brazil. After sample collection, DNA extractions were conducted using commercial kits and qPCR was oriented to kinetoplast DNA (kDNA) targets of the Leishmania infantum species. The results obtained for the FFPE samples showed 63.6% sensitivity and 77.1% specificity, whereas those obtained for the FT samples showed 100% and 48.6%, respectively. Poor agreement was observed for the results of the qPCR technique with FT and FFPE samples. Our results suggest freezing as the most suitable conservation method for the formation of sample databases considering DNA recovery

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2019. Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O controle da leishmaniose visceral canina (LVC), zoonose de caráter crônico e fatal, tem se provado um verdadeiro desafio. As medidas adotadas atualmente não parecem ser suficientes para reduzir a propagação da doença. Para que novas alternativas sejam elaboradas precisamos entender quais fatores influenciam a ocorrência da LVC e são passiveis de intervenção. O presente estudo trata-se de uma coorte aberta prospectiva para identificar fatores de risco para a LVC em localidade endêmica do DF. De junho de 2016 a dezembro de 2018, foram coletadas amostras de sangue periférico canino e informações sobre a condição socioeconômica dos donos, do ambiente do domicílio, de cuidados com cão e de suas características biológicas. Foi utilizado uma combinação dos testes ensaio imunoenzimático (EIE-LVC, Biomanguinhos), o teste imunocromatográfico rápido de duplo percurso (TR-DPP, Biomanguinhos) e PCR em tempo real do sangue total para identificação dos animais infectados. Os cães da linha de base (n=248) eram predominantemente assintomáticos ou oligossintomáticos. A prevalência na linha de base foi 27,52% (IC 95%: 22,19 a 33,34) para infecção por Leishmania. Da linha de base 162 cães estavam negativos nos três exames e poderiam, por tanto, participar do estudo de coorte. No total, 106 tiveram alguma contribuição em tempo na coorte, com um tempo médio de acompanhamento de 10,7 meses. A incidência estimada foi 1,91 casos por 100 cães-mês (IC 95% 1,33 a 2,75). Para a seleção de fatores de risco primeiro foram realizadas análises univariadas de todas as variáveis e as com p-valor≤0,25 seguiram para as próximas análises. Para a análise multivariada foram utilizado dois métodos distintos para seleção de variáveis com p-valor ≤ 0,1 no modelo de Cox: o método backward e o modelo hierárquico. Pelo método backward o maior poder aquisitivo (HR 1,04; p=0,007) e o uso de repelentes em cães (HR 0,20; p= 0,095) foram selecionados enquanto que pelo método hierárquico a presença de aves (HR 0,41; p=0,07) e o maior poder aquisitivo (HR 1,03; p=0,065) ficaram no modelo final. Os resultados refletem o desafio de se encontrar variáveis susceptíveis de intervenção. O achado de repelentes tópicos como fator protetor está de acordo com o otimismo das pesquisas recentes sobre o uso dessa medida para a prevenção da LVC. The control of canine visceral leishmaniasis (CVL), a chronic fatal zoonosis, has been a true challenge. The measures currently adopted do not seem to be enough to reduce the disease propagation. In order to elaborate new alternatives we need to understand which factors influence the occurrence of CVL and may be intervened. Our objective is to identify risk factors for CVL by a prospective open cohort study. From July 2016 to December 2018 samples of canine peripheric blood and information regarding the socioeconomic condition of the owners, the house ambient, the dog care practices and the biological characteristics of the dog. A combination of an enzyme linked immunosorbent assay (EIE-LVC, Biomanguinhos), a dual-path platform chromatographic immunoassay (TR-DPP, Biomanguinhos) and a real time PCR assay of blood samples was used to identify infected animals. The baseline (n=248) was composed mainly of asymptomatic and oligosymptomatic dogs. The baseline prevalence of Leishmania infection was 27.52% (95%CI: 22.19 to 33.34). On the baseline, 162 dogs were negative by the three tests executed, and therefore could take part on the cohort. At total 106 dogs had time contribution to the cohort study, with a mean follow up period of 10.7 months. The estimated incidence was 1.91 cases per 100 dog-months (95%CI 1.33 to 2.75). In order to select risk factors, univariate analysis were performed and all variables with p-value ≤0.25 proceeded to the next analysis. Two distinct methods were used to perform the multivariate analysis by Cox models with selection at a p-value ≤ 0.1: the backward model and the hierarchical model. By the backward method a greater acquisitive power (HR 1.04; p=0.007) and the use of repellents (HR 0.20; p= 0,095) on dogs were selected, as for the hierarchical model the presence of birds (HR 0.41; p=0.07) and a greater a acquisitive power (HR 1.03; p=0.065) were selected. This results reflects the challenges of finding an intervenable variable. The use of topical repellents as a protective factor is in line with recent researches optimism about the use of this measure to CVL prevention.

The aim of this study was to compare molecular tests used to diagnose Leishmania spp. in dogs with different stages of infection. Blood and conjunctival swab (CS) samples from dogs classified in four clinical stages were subjected to different PCR protocols (13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S and LEISH-1/LEISH-2 primers). To the study, 22.3% (48/215) of dogs were classified as without clinical signs, 67.5% (145/215) stage I (mild disease), 7.0% (15/215) stage II (moderate disease) and 3.2% (7/215) stage III (severe disease). The results showed that in blood samples, 13A/13B detected a significant higher number of positive dogs in stage I (25/145) and in total (42/215) (p≤0.05). However, when CS samples were tested, no difference was observed (p>0.05). On the other hand, in blood samples, MC1/MC2 detected significantly fewer positive dogs classified as without clinical signs (0/48), in stage I (0/145) and in total (1/215) (p≤0.05). Likewise, in CS samples, this primers showed also lower detection (1/215) (p≤0.05). So than, we can conclude that PCR on blood samples with 13A/13B primers has greater capacity to detect positive dogs, mainly at the initial of clinical disease than do other primers and MC1/MC2 are not a good choice to detect Leishmania infantum infection in dogs. Resumo O objetivo deste estudo foi comparar testes moleculares usados para diagnosticar Leishmania spp., em cães apresentando diferentes estágios de infecção. Amostras de sangue e suabe conjuntival (SC) de cães classificados em quatro estágios clínicos foram submetidas a diferentes PCRs (primers 13A/13B, MC1/MC2, LITSR/L5.8S e LEISH-1/LEISH-2). Para o estudo, 22,3% (48/215) dos cães foram classificados como sem sinais clínicos, 67,5% (145/215) estágio I (doença leve), 7,0% (15/215) estágio II (doença moderada) e 3,2% (7/215) estágio III (doença grave). Os resultados mostraram que, em amostras de sangue, 13A/13B detectou número significativamente maior de cães positivos no estágio I (25/145) e no total (42/215) (p≤0,05). No entanto, quando as amostras de SC foram testadas, nenhuma diferença foi observada (p>0,05). Por outro lado, no sangue, MC1/MC2 detectou significativamente menos cães positivos sem sinais clínicos (0/48), em estágio I (0/145) e no total (1/215) (p≤0,05). Da mesma forma, em amostras de SC, MC1/MC2 também apresentou menor detecção (1/215) (p≤0,05). Assim, a PCR em amostras de sangue com 13A/13B tem maior capacidade de detectar cães positivos, principalmente no início da doença do que outros primers, e o par de primers MC1/MC2 não é uma boa escolha para detectar infecção por Leishmania infantum em cães.

Orientador: Selma Giorgio Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A leishmaniose visceral no Brasil é uma doença causada pelo protozoário "Leishmania infantum", afetando o homem e o cão. Os cães infectados são apontados como o principal reservatório de "L. infantum" em áreas urbanas. Devido às pressões seletivas distintas sofridas pelos isolados de "L. infantum" podem ocorrer diferentes fenótipos do parasita. A existência desses diferentes fenótipos terá consequências na resistência aos fármacos, infectividade e patogenicidade. Nesse trabalho isolamos dois parasitas provenientes de casos de leishmaniose visceral de paciente humano do Hospital das Clínicas da UNICAMP e de cão proveniente da Superintendência de Controle de Endemias ¿ SP, identificamos as espécies, comparamos a morfologia dos promastigotas, capacidade proliferativa e infectiva, e susceptibilidade a fármacos desses isolados clínicos para a análise do perfil fenotípico. Através da metodologia da PCR mostrou-se que os dois isolados clínicos de "Leishmania", pertencem a mesma espécie ("L. infantum"). Como parasita referência de todos os ensaios, utilizamos a "L. infantum" MHOM/BR/1972/LD proveniente de caso clínico humano. Na comparação morfológica do tamanho dos promastigotas não observamos diferenças significativas entre os isolados clínicos e o parasita referência. Nos ensaios de infectividade, macrófagos de origem humana da linhagem THP1 e canina da linhagem DH82 foram infectados nas proporções macrófago:parasita, 1:10 e 1:20, no período de 24 e 48 horas, e camundongos BALB/c foram inoculados com 2x106 promastigotas. Os resultados indicaram que os isolados clínicos e o parasita referência infectam macrófagos humano e canino, observando-se formas amastigotas intracelulares. Camundongos BALB/c foram igualmente infectados, analisados pela histopatologia e carga parasitária. Não há diferença significativa entre os isolados clínicos e o parasita referência no padrão histopatológico e de carga parasitária. Em relação a susceptibilidade aos fármacos analisada no modelo in vitro concluímos que os parasitas são igualmente susceptíveis a anfotericina B, miltefosina e ao antimoniato de meglumina Abstract: Visceral leishmaniasis in Brazil is a disease caused by the protozoan "Leishmania infantum", infecting man and dog. The infected dogs are designated as the main reservoir of "L. infantum" in urban areas. Due to the different selective pressures of "L. infantum" isolates, different parasite phenotypes may occur. The existence of these different phenotypes will have consequences on drug resistance, infectivity and pathogenicity. In this work, we isolated two parasites from cases of visceral leishmaniasis one of them was isolated from a human patient of the Clinicals Hospital of UNICAMP and another clinical isolate was obtained from a dog of Endemics Control Superintendence - SP, identified the species, compared the morphology of promastigotes, proliferative and infective capacity, and susceptibility to drugs of these clinical isolates for the analysis of the phenotypic profile. With the methodology of the PCR it was shown that the two clinical isolates of "Leishmania" are "L. infantum". As a reference parasite of all the trials, we used "L. infantum" MHOM/BR/1972/LD from a human clinical case. In the morphological comparison of promastigote size, we did not observe significant differences between clinical isolates and reference parasite. In the infectivity assays, human macrophages THP1 and canine macrophages DH82 were infected in the macrophage:parasite, 1:10 and 1:20 ratios in the 24 and 48 hour period, and BALB/c mice were inoculated with 2x106 promastigotes. The results indicated that the clinical isolates and the reference parasite infect human and canine macrophages, observing intracellular amastigote forms. BALB/c mice were also infected, analyzed by histopathology and parasite load. Was evaluated no significant difference between clinical isolates and the reference parasite in the histopathological and parasitic load pattern. Regarding drug susceptibility, we conclude that the parasites are similarly susceptible to drugs used (amphotericin B, miltefosine and meglumine antimoniate) Mestrado Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia Mestra em Biologia Animal CAPES

Canine visceral leishmaniasisis an important disease caused by the protozoon Leishmania infantum which affects several organs and systems, including the genital tract. The L. infantum tropism to the male genital system and correlation among parasite load, immunohistochemistry detection and structural changes in these organs is controversy. Therefore, the aim of this study was to evaluate this correlation in the genital organs of the male dogs naturally infected with L. infantum. Samples from testicles, epididymis, prostate, glans penis, prepuce and scrotum were collected from 19 positive adult dogs. Structural changes were observed in the testicles (5.2%), epididymis (2.6%), prepuce (5.2%) and scrotum (5.2%) of the samples positive at immunohistochemistry examination. Conversely, similar structural changes were observed in all tissues negative at immunohistochemistry analysis. Moreover, L. infantum DNA was detected in all organs with the highest parasite load found in testicles, epididymis, and prostate gland. , Testicles had the highest parasite load but the lowest number of inflammatory lesions. These inflammatory lesions were observed in all organs of reproductive system of dogs; however, no correlation was observed between the parasite load and inflammatory lesions of dogs naturally infected with L. infantum.

This study was performed to evaluate the effects of autoclaving and storage in 85% glycerol on cortical bone from dogs infected with Leishmania sp. We used 42 cadavers with leishmaniasis. The dogs were evaluated for the presence of Leishmania sp. in culture of bone marrow and by culturing cortical bone. From the infected animals, we harvested 42 diaphysis of the right femur for culture of cortical bone before and after autoclaving or storage in glycerol. There was no significant difference in growth of the parasite in culture of bone marrow or cortical bone. There was no growth of Leishmania sp. in culture of samples after autoclaving or storage in glycerol. Both treatments were effective in preventing the growth of the parasite in vitro, so it was considered viable for grafting. RESUMO Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos da esterilização em autoclave e do armazenamento em glicerol a 85% no osso cortical de cães infectados por Leishmania sp. Foram utilizados 42 cadáveres de cães com leishmaniose. Os cães foram avaliados para a presença de Leishmania sp. em cultura de medula óssea e de osso cortical. Foram coletadas 42 diáfises do fêmur direito para cultura do osso cortical antes e após a esterilização e o armazenamento em glicerol. Não houve diferença significativa no crescimento do parasito em cultura utilizando-se medula óssea ou osso cortical. Não houve crescimento de Leishmania sp. em cultura de amostras de osso cortical após a autoclavagem ou o armazenamento em glicerol. Ambos os tratamentos foram eficazes na prevenção do crescimento do parasita in vitro, de modo que foram considerados viáveis para enxerto.

Cães são os reservatórios primários dos parasitos do gênero Leishmania. Receptores da imunidade inata fazem a detecção precoce do parasito e conduzem a imunidade adaptativa específica na tentativa de controlar a infecção. Entretanto, poucos estudos tem investigado a correlação entre a expressão de receptores da imunidade inata e a resistência ou susceptibilidade em cães infectados por Leishmania infantum. O objetivo deste estudo foi correlacionar os achados clínicos em cães naturalmente infectados por L. infantum à expressão de receptores da imunidade inata (Toll Like Receptors-TLRs e Nod Like Receptors-NLRs). Inicialmente, o soro de 76 cães foi coletado no Centro de Controle de Zoonoses de Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. A positividade dos cães para L. infantum foi confirmada pela reatividade nos testes de ELISA e DPP®. Os cães foram clinicamente avaliados e classificados como sintomáticos (n=19), oligossintomáticos (n=19), assintomáticos (n=19) e não infectados (n=19). Os cães naturalmente infectados por L. infantum e controles não infectados foram eutanasiados e fragmentos de fígado foram coletados para quantificação da expressão de RNAm de TLRs (TLR1-9), NLRs (NOD1, NOD2, NLRP1 e NLRP3) citocinas (IL1β, IL-6, IL-12, IL-10, TNFα, IFN-γ) e iNOS com auxilio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados demonstram o aumento na expressão da maioria dos receptores do tipo Toll e do tipo Nod nos cães naturalmente infectados por L. infantum, comparado a animais não infectados. Entretanto, cães sintomáticos apresentaram maior expressão de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, NLRP1, NLRP3, NOD1 e IL-1β quando comparado a animais assintomáticos, mostrando significante aumento na transcrição destas moléculas com a progressão da doença. Por outro lado, cães assintomáticos apresentaram maior expressão de RNAm de citocinas (IFN-γ, IL-12) e iNOS quando comparado a animais oligossintomáticos e sintomáticos. Este estudo gerou novos conhecimentos envolvendo receptores da imunidade inata (TLRs, NLRs) na leishmaniose visceral canina (LVC), podendo servir de base para o melhor entendimento dos mecanismos de resistência ou susceptibilidade à infecção por L. infantum em cães, bem como dar subsídio a estratégias profiláticas para o controle da LVC. Dogs are the primary reservoirs of parasites of the Leishmania genus. Innate immune receptors perform early detection of the parasite and lead to specific adaptive immune response in attempt to infection control. However, few studies have investigated a correlation between the expression of innate immunity receptors and the resistance or susceptibility pattern in dogs naturally infected with Leishmania infantum. The aim of this study was to correlate the clinical status of dogs naturally infected with L. infantum with the mRNA expression levels of innate imune receptors (Toll like receptors-TLRs and Nod Like Receptors-NLRs). Initially, serum of 76 dogs was collected at the Zoonoses Control Center in Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. The L. infantum infection in dogs was confirmed by ELISA and DPP® tests. Subsequently, animals were clinially evaluated and classified as asymptomatic (n=19), oligosymptomatic (n=19), symptomatic (n=19) and uninfected (n=19). Dogs naturally infected by L. infantum and uninfected controls were euthanasied and liver samples were collected to quantify mRNA expression of TLRs (TLR1-9), Nod Like receptors-NLRs (NOD1, NOD2, NLRP1, NLRP3), cytokines (IL1β, IL-6, IL-12, IL-10, TNFα, IFN-γ) and iNOS using real-time PCR. The results demonstrate the increased expression of almost all TLRs and NLRs in dogs naturally infected by L. infantum compared with uninfected animals. However, symptomatic dogs showed higher expression of TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 NLRP1, NLRP3, NOD1 and IL-1β than asymptomatic animals, revealing significant up regulation of transcription with disease progression. On the other hand, asymptomatic dogs presented greater cytokine mRNA expression (IFN-γ, IL-12) and iNOS when compared to oligosymptomatic and asymptomatic animals. This study unveil new knowledge involving innate immunity receptors (TLRs, NLRs) and cytokines in canine visceral leishmaniasis and may be used as a basis for better understanding of resistance or susceptibility mechanisms in dogs infected with L. infantum, as well as prophylactic strategies to control canine visceral leishmaniasis.

This study was about a semi-quantitative analysis of T lymphocytes (CD4+ and CD8+, FoxP3+ regulatory T cells), and macrophages in the gut wall of dogs naturally infected with Leishmania infantum. Thirteen dogs were divided into three groups: group 1 (G1, n=5), dogs with canine visceral leishmaniasis (CVL) and infected with L. infantum amastigotes in the intestine; group 2 (G2, n=5), dogs with CVL but without intestinal amastigotes; and group 3 (G3, n=3), uninfected dogs (control group). There was no significant difference (p ≥ 0.05) on CD4+ and Treg cell numbers among the groups, whereas the levels of CD8+ T cells and macrophages were significantly higher in dogs from G1 group than in G2 and G3 (p ≤ 0.05), especially in intestinal segments with high parasite burden. Parasite burden correlated positively with levels of CD8+ T cells and macrophages (p ≤ 0.05), but was inversely correlated to levels of CD4+ T lymphocytes and FoxP3+ Treg cells. In conclusion, in the intestine of dogs with CVL, the increase of CD8+ T cells and macrophages population associated with high parasite burdens, but no changes of CD4+ T cells and FoxP3+ Treg cells suggest a possible immunoregulation by the parasite not dependent on Treg cells. Resumo Este estudo foi uma análise semi-quantitativa de linfócitos T (CD4+, CD8+ e regulatórios - Treg FoxP3+) e macrófagos na parede intestinal de cães naturalmente infectados com Leishmania infantum. Treze cães foram divididos em três grupos: grupo 1 (G1, n=5) continha cães com leishmaniose visceral canina (LVC) e com amastigotas intestinais; grupo 2 (G2, n=5) continha cães com LVC, mas sem amastigotas intestinais e o grupo 3 (G3, n=3) continha cães não infectados (grupo controle). Verificou-se que não houve diferença significativa (p ≤ 0.05) no número de células CD4+ e de Treg entre os grupos, mas o número de células T CD8+ e macrófagos foi significativamente superior nos cães do grupo G1 em relação ao G2 e ao G3 (p ≤ 0,05), especialmente nos segmentos intestinais com altas cargas parasitárias. As altas cargas parasitarias correlacionaram positivamente com os números de CD8+ e macrófagos (p ≤ 0,05), mas negativamente com as células CD4+ e Treg. Em conclusão, no intestino dos cães com LVC, o aumento das populações de células T CD8+ e de macrófagos associado a altas cargas parasitárias, mas nenhuma alteração de células T CD4+ e células Treg FoxP3+ sugerem uma possível imunorregulação pelo parasita não dependente de células Treg.

This study describes the occurrence of dogs naturally co-infected with Hepatozoon canis and two Leishmania species: L. infantum or L. braziliensis. Four dogs serologically diagnosed with Visceral Leishmaniasis were euthanized. Liver and spleen samples were collected for histopathological analysis and DNA isolation. H. canis meronts were observed in tissues from all four dogs. H. canis infection was confirmed by PCR followed by sequencing of a fragment of 18S rRNA gene. Leishmania detection and typing was confirmed by ITS1' PCR-RFLP and parasite burden was calculated using ssrRNA quantitative qPCR. A DPP - Dual Path platform test was performed. One out (Dog #2) of four animals was asymptomatic. Dogs #1 and #4 were infected by L. infantum and were DPP test positive. Dogs #2 and #3 were infected by L. braziliensis and were DPP test negative. Furthermore, visceral dissemination was observed in Dogs #2 and #3, since L. braziliensis was detected in liver and spleen samples. The visceral dissemination of L. braziliensis associated with systemic signs suggested that this co-infection could influence the parasite burden and disease progression. Resumo O presente estudo descreve a ocorrência de coinfecção com Hepatozoon canis e duas espécies de Leishmania (L. infantum ou L. braziliensis) em cães. Quatro cães sorologicamente diagnosticados com leishmaniose visceral foram eutanasiados. Amostras do baço e fígado foram submetidas à histopatologia e extração de DNA. Merontes de H. canis foram observados nos quatro cães. A infecção por H. canis foi confirmada por PCR e sequenciamento de um fragmento do gene 18S rRNA. A infecção por Leishmania e tipagem foram realizadas por PCR-RFLP do região intergênica ITS1. A carga parasitária foi calculada pela qPCR quantitativa baseada no gene ssrRNA. O teste DPP - Dual Path platform foi realizado. Apenas o Cão #2 era assintomático. Os cães #1 e #4 estavam infectados com L. infantum e foram positivos no DPP. Os cães #2 e #3 estavam infectados com L. braziliensis e foram negativos no DPP. Além disso, visceralização foi observada nos cães #2 e #3, nos quais L. braziliensis foi detectada em amostras de baço e fígado. A visceralização da L. braziliensis associada a sinais clínicos sistêmicos sugerem que esta coinfecção pode ter influenciado na carga parasitária e progressão da doença.

Resumo: No Brasil, a leishmaniose visceral é causada pela Leishmania infantum. É uma zoonose crônica e, frequentemente, fatal, sendo considerada um grave problema de saúde pública no mundo e reconhecida pela Organização Mundial de Saúde como uma das dezessete "Doenças Tropicais Negligenciadas". O presente estudo foi realizado em 2012, na zona rural do município de Patos, semiárido paraibano, com o objetivo de estimar a prevalência, os fatores de risco da leishmaniose visceral canina (LVC) na região e avaliar os testes de diagnóstico sorológico. Foram coletadas 362 amostras de sangue e a prevalência da infecção foi determinada através de três técnicas sorológicas (ELISA, RIFI e Teste Imunocromatográfico DPP - Dual Path Plataform), sendo consideradas positivas as amostras que apresentaram pelo menos dois testes reagentes. As amostras positivas na sorologia foram testadas na PCR e qPCR. Aplicou-se um questionário epidemiológico aos proprietários para identificação dos possíveis fatores de risco. A taxa de prevalência foi de 11,33% (41/362). Considerou-se o ELISA como padrão ouro, já que é o teste confirmatório para a LVC pelo Ministério da Saúde. O DPP (Dual Path Plataform) apresentou sensibilidade de 58% (95% CI: 0,43-0,72) e especificidade de 96% (95% CI: 0,93-0,98), com índice Kappa de 0,57. A RIFI apresentou sensibilidade de 85% (95% CI: 0,72-0,94), especificidade de 99% (95% CI: 0,98-1) e valor Kappa de 0,88. O fator de risco identificado na análise multivariada por regressão logística múltipla foi o sexo (OR=2,15 [1,09-4,21]) e os cães machos apresentaram 2,15 vezes mais chances de serem infectados, que pode ser justificado por serem mais utilizados para a caça e como cão de guarda, dois fatores que aumentam a exposição do animal ao flebótomo. Em função da taxa de prevalência encontrada, indica-se a aplicação de medidas de controle no município. Os resultados da comparação dos ensaios sorológicos demonstraram que o DPP (Dual Path Plataform) não é a melhor técnica para triagem dos animais positivos em função da baixa sensibilidade do método, sugerindo que o mesmo seja substituído pelo ELISA. Abstract: Visceral leishmaniasis is caused by Leishmania infantum in Brazil. It is a chronic disease and often a fatal zoonosis and considered as a serious worldwide public health problem and recognized by the World Health Organization as one of seventeen "Neglected Tropical Diseases". This study was conducted in 2012 in the county of Patos, in Paraíba State semiarid region. The main purposes were to estimate the prevalence and the risk factors of canine visceral leishmaniasis (CVL), and to evaluate the performance of serological tests. Serological prevalence was determined using three techniques (ELISA, IFA and DPP chromatographic immunoassay - Dual Path Platform). ELISA was the golden standard, since it is the confirmatory test for CVL as established by the Brazilian Ministry of Health. In total, 362 blood samples were collected and were considered positive if positive by two serological assays. Positive samples were tested by PCR and qPCR. An epidemiological questionnaire was applied to the dog owner to identify risk factors associated with CVL. The seroprevalence was 11.33% (41/362). Chromatographic immunoassay - DPP showed a sensitivity of 58% (95%, CI: 0.43 to 0.72) and specificity of 96% (95%, CI: 0.93-0.98) , with a Kappa index of 0.5. The IFA had a sensitivity of 85% (95%, CI: 0.72 to 0.94), specificity of 99% (95%, CI: 0.98 to 1) and Kappa value of 0.8. The risk factor identified in the multivariate analysis was gender (OR=2.15 [1.09 to 4.21]), male dogs having 2.15 times more chance of being infected. The increased likelihood can possibly be explained by the use of male dogs for hunting and as guard dogs, two factors that increase dog contact to infected sandflies. Due to the prevalence rates, it should be recommended control measures against canine visceral leishmaniasis. The results demonstrated that the Chromatographic immunoassay (DPP-Dual Path Platform) is not the best technique for screening positive animals due to its low sensitivity, suggesting its replacement by ELISA.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The immunochromatographic rapid test based on dual-path platform (Dual Path Platform DPP®) is the official screening serological test for canine visceral leishmaniasis (CVL) used by the Ministry of Health as part of the Brazilian visceral leishmaniasis control program. In this study the performance of DPP® test was assessed for the diagnosis of CVL and compared with an immunoenzymatic assay (ELISA) and an indirect immunofluorescence assay (IFA) which used L. infantum crude antigens. The specificity of DPP® was evaluated using serum samples collected from unexposed dogs from non-endemic area (n=74) and from dogs infected with hemoparasites (Babesia canis, Ehrlichia canis, Hepatozoon canis, Mycoplasma haemocanis and Anaplasma platys) (n=46). Sixty serum samples from Leishmania infantum naturally infected dogs with parasitological diagnosis confirmed (cytological examinations and specific PCR of bone marrow aspirates) were used to evaluate the sensitivity. The DPP® showed higher specificity [DPP®: 98.33%; ELISA: 90.0%; IFA: 96.67%] and lower sensitivity [(DPP®: 93.33%; ELISA: 100%; IFA: 98.33%] than the traditional serological assays. When compared to IFA and ELISA, DPP® showed good diagnostic performance which qualifies it as a reliable serological test for CVL diagnosis. Despite of its feasibility, the higher specificity of DPP® suggests that this test should be used as a confirmatory instead a screening tool in VL control programs. Furthermore, when used as confirmatory test DPP® could diminishes the rates of culling false-positives dogs. No Brasil, a leishmaniose visceral é uma zoonose causada por L. infantum, transmitida por Lutzomyia longipalpis, e o cão doméstico é o principal reservatório do parasito. A doença no cão, leishmaniose visceral canina, apresenta altas taxas de prevalência, principalmente em áreas endêmicas e precede a doença em humanos. Umas das formas de controle da doença adotadas pelo governo brasileiro como parte do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral é a eliminação dos animais soropositivos para Leishmania. O diagnóstico realizado pelo programa de controle é o teste imunocromatográfico rápido DPP® Dual Path Platform como triagem e o ensaio imunoenzimático (ELISA) como confirmatório. Neste estudo, o desempenho do DPP® foi avaliado para o diagnóstico da LVC e comparado com ELISA e ensaio de imunofluorescência indireta (RIFI), os dois últimos realizados com antígenos brutos de L. infantum. A especificidade do DPP® foi avaliada com 74 amostras de soros de cães não infectados de área não-endêmica para LVC. Amostras de soros de 60 cães naturalmente infectados por Leishmania infantum com diagnóstico parasitológico positivo (exame direto e PCR específico em aspirado de medula óssea) foram utilizados para avaliar a sensibilidade. O DPP® apresentou melhor especificidade (98,33%) quando comparado ao ELISA (90,0%) e RIFI (96,67%). A sensibilidade do DPP® foi menor (93,33%) em relação ao encontrado no ELISA (100%) e na RIFI (98,33%). O DPP® apresentou resultados de VPP (98,24%), VPN (96,72%) e acurácia (96,66%). Neste estudo, também foi avaliado o desempenho dos testes sorológicos, DPP®, ELISA e RIFI, em amostras de soros de cães infectados com hemoparasitos para identificar se os testes apresentariam reação cruzada. Foram utilizados, 46 soros de cães naturalmente infectados por Ehrlichia canis, Babesia canis, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemocanis. Apenas uma amostra de soro de cão co-infectado com Ehrlichia canis e Babesia canis foi positivo no DPP®. No ELISA, oito amostras de soros foram positivas; seis com Ehrlichia canis e duas com Hepatozoon canis. Quando comparado com RIFI e ELISA, DPP® demonstrou bom desempenho no diagnóstico, o que o qualifica como um teste aplicável para o diagnóstico sorológico da LVC. Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis presents urban behavior in some Brazilian cities, with domestic dogs as the main infection source. In Cuiabá, MT, canine visceral leishmaniasis was diagnosed and characterized as recommended by the Ministry of Health. METHODS: Biological samples from suspected canine carriers were analyzed by the isoenzyme electrophoresis technique. The 6PGDH enzyme and reference strain IOC/L0566 (MHOM/BR/1975/M2903) of Leishmania (Leishmania) infantum was used as one of the controls. RESULTS: Electrophoresis analysis revealed that the canine isolates belonged to the species L. (L.) infantum. CONCLUSIONS: The authors emphasize the importance of species characterization, particularly in areas of mixed infection like Cuiabá.

O envolvimento do trato gastrointestinal (TGI) na leishmaniose visceral canina (LVC) se destaca fato pelo considerável número de parasitos nas porções finais: ceco e cólon, porém sem lesões acentuadas, isso é, a arquitetura intestinal não se altera. Assim, com o intuito de caracterizar a patologia intestinal na LVC foram realizados estudos morfológicos, parasitológicos e imunológicos e associação ao quadro clínico da doença. Quarenta e quatro cães positivos e seis com exames negativos para Leishmania foram usados nesse trabalho. O exame macroscópico do TGI revelou não haver alterações evidentes com exceção da reatividade das placas de Peyer nos animais infectados, principalmente no íleo, que se apresentava com nódulos de coloração brancacenta fazendo saliência na superfície do órgão. De modo geral, apresentaram aumento da celularidade na lâmina própria (LP) com exceção do esôfago, em comparação com animais não infectados. Havia predominância de plasmócitos, macrófagos e linfócitos, com alguns neutrófilos e eosinófilos. Não raro, os macrófagos apresentavam-se com morfologia peculiar de células epiteliódes, com núcleos de aspecto vesiculoso, cromatina frouxa e citoplasma amplo. Formas amastigotas de Leishmania imunomarcadas por imuno-histoquímia foram observadas dentro de macrófagos na LP independente da forma clínica dos cães infectados. No intestino grosso, a maioria dos parasitos foi visualizada subjacente à muscular da mucosa, na base da LP. Ao passo que no intestino delgado as amastigotas foram encontradas, em maior proporção, próximas ao lúmen, logo abaixo do epitélio, mas de forma difusa. Os segmentos mais parasitados foram ceco e cólon. De acordo com o padrão de infecção observado ao longo do TGI, seja por nosso grupo de pesquisa ou por outros pesquisadores, investigou-se alguns marcadores leucocitários: integrinas CD11b, CD11c/CD18; receptor de monócitos circulantes e macrófagos: CD14; receptores de macrófagos e linfócitos: Toll do tipo 2 (TRL2), do tipo 9 (TLR9) e manose; antígenos linfocitários: CD4, CD8 e Foxp3. Observamos que a expressão de CD11c+ e TLR2+ como também CD14+ e Manose+ foi mais frequente no cólon em relação ao jejuno. Ao contrário, TLR9+ foi mais frequente no jejuno em relação ao cólon como também observado para CD11b+ e CD11b+ expressando CD14+, TLR9+ e Manose+. Esses receptores se apresentaram aumentados nos animais infectados. Linfócitos T CD4+ e T CD4+/Foxp3+ apresentaram-se mais frequentes no jejuno em relação ao cólon. A frequência de CD8+ não se diferenciou entre jejuno e cólon. Foi observado também que o animal infectado apresenta aumento de CD4+ e Foxp3+ e redução de CD8+. Na LP foi feita também a avaliação da intensidade média de fluorescência (IMF) e a consequente comparação entre jejuno e cólon 25 dos receptores aqui avaliados. Houve diferença quanto à expressão de TLR9+, CD4+; CD8+; CD4+/FOXP3+ e CD11b+ com IMF mais intensa no jejuno. Ao contrário, a expressão de CD14+ e TLR2+ foi mais intensa no cólon. O animal infectado tem IMF superior aos animais não infectados. Foram avaliadas também a frequência e a IMF das populações de linfócitos T CD4+, CD8+ e Foxp3+ nos linfonodos cervicais e mesentéricos. A porcentagem de positividade desses receptores se diferenciou somente em relação aos controles, o que levou observar que cães infectados expressam mais CD4+ e Foxp3+ e menos CD8+ que cães não infectados. Apesar da não detecção das citocinas interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-) no soro de todos os cães, no jejuno observou-se presença de IL-10 e TNF- sendo essas mais expressadas quando comparadas ao cólon. Já a citocina IL-4 foi mais encontrada no cólon. O segmento do TGI que apresentou menor carga parasitária, apresentou simultaneamente maior frequência e expressão de receptores como CD4, Foxp3, CD11b, TLR9, além de IL-10 e TNF-, ao passo que o segmento que apresentou maior carga parasitária apresentou concomitantemente maior expressão de CD14, TLR2, CD11c e IL-4. Portanto, a infecção por Leishmania influenciou, no jejuno, aumento da expressão de CD14, Manose, TLR9, CD11b, CD4, Foxp3 e redução da expressão de CD8; influenciou, no cólon, aumento da expressão de CD11c, CD14, Manose, TLR9, CD11b, CD4, Foxp3 e TLR2 e redução da expressão de CD8. E nos linfonodos, estimulou o aumento da expressão de CD4 e Foxp3 e redução da expressão de CD8. A mucosa intestinal do jejuno e do cólon estava intacta apesar da presença de parasitos sugerindo que esses processos constitutivos de regulação ocorrem na mucosa intestinal para controlar os danos que poderiam resultar das respostas celulares contra os patógenos. É indispensável identificar os fatores que contribuem para a ativação e/ou regulação de TLR contra o parasito em cada um dos segmentos do TGI e avaliar o quanto a ativação de TLR, em cada uma dessas células, contribui para a patologia na leishmaniose visceral. Gastrointestinal tract (GIT) disorders occur in dogs since 1980. Interestingly, we found a high parasite burden evident throughout the GIT mucosa, mainly in gross intestines in caecum and colon, but without severe lesions. It is known that in the vertebrate host GIT exerts local and systemic immunoregulatory response and it led us to consider whether Leishmania gains an advantage from this fact. The aim of this work was to better characterize the canine GIT pathology using histological, parasitological and immunological studies associated to the clinical status of the animals. Forty-four mongrel dogs naturally infected with Leishmania (Leishmania) infantum chagasi and obtained from the Control Zoonosis Center of the Municipality of Ribeirão das Neves, Belo Horizonte Metropolitan area, Minas Gerais (MG) state, Brazil, were analyzed. Other six uninfected dogs were used as controls. After necropsy, gross analysis were done without noticing any alterations, except the Peyers patches reactivity, localized mainly in ileum as white protuberant nodules in the wall (serosa). Under histological analysis, all infected dogs showed an increased number of cells in lamina propria (LP) expect in esophagus in comparison to controls. Macrophages, plasma cells and lymphocytes were the main cells with rare presence of neutrophils and eosinophils. Many of the macrophages showed a pale and abundant cytoplasm and less dense nucleus typical of epithelioid cells. Parasite distribution in the GIT was evident in all intestinal segments and layers of the intestinal wall (mucosal, muscular and submucosal) irrespective of the clinical status of the dogs. Interestingly, parasite distribution in the small intestine was diffuse through the LP, whereas in the large intestine it was concentrated near the muscularis and distant from the intestinal lumen. However, the parasite load was statistically higher in the caecum and colon than in other segments of the GIT. Some cellular antigens were analyses from cells obtained from LP of jejune and colon as: integrin CD11b and CD11c/CD18; the receptor of monocyte-macrophages CD14; receptors of macrophages and lymphocytes Toll type 2 (TLR2) and Type 9 (TLR9); receptors of macrophages mannose; CD4, CD8 and Foxp3 receptors of lymphocytes. In general, all studied receptors are high expressed in infected animals. We observed that expression of TLR2+ and CD11c+ as well as CD14+ Mannose+ was more frequent in the colon compared to the jejunum. Rather, TLR9+ was more frequent in the jejunum compared to the colon was also observed for CD11b+ and CD11b+ expressing CD14+, Mannose+, and TLR9+. T CD4+ e T CD4+/FOXP3+ was more frequent in jejune than colon. The CD8+ frequency was not different between jejune and colon, but different between jejune/colon in controls where in controls it was higher. However, infected animals revealed 27 increase CD4+ and Foxp3+ and decrease CD8+ frequencies. MFI (mean fluorescence intensity) was also carried out in cells of LP. There was difference between TLR9+, CD4+, CD8+, CD4+, FOXP3+ and CD11b+ whereas MFI was more intense in jejune. In contrast CD14+ and TLR2+ expression were more intense in colon. CD11c+ and Mannose+ did not present any MFI difference between jejune and colon. Frequency and IMF of T CD4+, CD8+ and Foxp3+ lymphocytes were analyzed in cervical and mesenteric lymph nodes. The positivity percentage of these receptors was different only related to controls. MFI was not different between lymph nodes. These results show that infected dogs have more CD4+ and Foxp3+, and less CD8+ antigen expression than uninfected dogs. Despite of the negative ELISA serum results for interleukin 4 (IL-4), interleukin 10 (IL-10) and tumoral necrotic factor-alpha (TNF-), in jejune we found IL-10 and TNF- where they are more intense than colon. Moreover, the cytokine IL-4 were mainly found in colon. Thus, the TGI segment with lower parasite load showed high frequency and expression of receptors CD4+, Foxp3+, CD11b+, TLR9+, besides the presence of IL-10 and TNF-. In contrast, the TGI segment with higher parasite load showed also concomitant high frequency of CD14, TLR2, CD11c and IL-4. We have concluded that in CVL there is a high Foxp3+ in the LP of the jejune. Probably the normal intestinal mucosa has an IL-10 dependent immunological mechanism where Foxp3+ cells are able to produce this IL-10. As Foxp3+ was also found in colon in normal conditions it suggests a local role of these cells in the intestinal homeostasis. Otherwise we must think that the integrity of the mucosa, both jejune and colon was preserve despite of the presence of parasites. Thus, this may led us to consider whether Leishmania gains an advantage from the intestinal immunoregulatory response (immunological tolerance). Such question will require further profound research and will help to elucidate the mechanisms underlying Leishmania infection.

O uso de procedimentos simples para coleta de amostras e a realização de um diagnóstico eficiente da leishmaniose visceral canina (LVC) são de grande relevância para auxiliar o controle desta grave doença. Com base nisso, avaliou-se o potencial de amostras clínicas de coleta não invasiva como os swabs conjuntival, nasal, oral e swab de pele orelha para o diagnóstico molecular da LVC, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase convencional (PCR). Além disso, foram avaliadas as cargas parasitárias obtidas destas amostras e suas possíveis implicações, utilizando a PCR em tempo real (qPCR). Para isso, foram utilizados cães naturalmente infectados obtidos no Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte-MG. Dez cães saudáveis e livres de infecção foram adotados como grupo controle. As amostras destes animais foram coletadas em três momentos diferentes. Na primeira coleta, foram obtidos 80 cães que foram divididos em dois grupos de 40 indivíduos de acordo com a ausência (grupo 1) ou presença de sinais clínicos compatíveis com a LVC (grupo 2). Destes animais, foram coletados o swab conjuntival separadamente de cada ocular, aspirados de medula óssea, biópsia de pele de orelha e sangue periférico. Estas amostras foram submetidas à PCR-hibridização e à qPCR. Os resultados da PCR-hibridização para os grupos 1 e 2 foram respectivamente: conjuntiva direita, 77,5% e 95%; conjuntiva esquerda, 75% e 87,5%; pele de orelha, 45% e 75%; medula óssea, 50% e 77,5%; sangue periférico, 27,5% e 22,5%. As positividades da PCR-hibridização para o swab conjuntival foram equivalentes (p>0,05) ou superiores àquelas referentes às amostras de coleta invasiva (p0,05) e mais altas em relação às demais amostras dentro de cada grupo (p0,05). A carga parasitária estimada para o swab nasal foi equivalente àquela obtida com o swab conjuntival (p> 0,05) e inferior ao parasitismo na medula óssea e pele de orelha (p0,05) e superou apenas o dado referente ao swab de pele de orelha (p = 0,013). A carga parasitária no swab oral foi equivalente àquelas estimadas nos swabs conjuntival e nasal (p>0,05) e inferior em relação às outras amostras clínicas (p0.05) or higher than those for other samples (p0.05). The antiLeishmania IgG titers from dogs with clinical manifestations were higher than those from dogs without clinical signs (p = 0.025). Positive and significant correlations were detected between parasitism and IgG titers only in the bone marrow and skin from dogs without clinical signs (p0.05). Its parasite load was statistically equivalent to the parasitism in the conjunctival swab (p>0.05) and lower than the parasite burden in the bone marrow and skin (p0.05). The parasite burden in the oral swab was equivalent to the parasitism in the conjunctival and nasal swabs (p>0.05) and lower than those estimated in the other samples (p

INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis presents urban behavior in some Brazilian cities, with domestic dogs as the main infection source. In Cuiabá, MT, canine visceral leishmaniasis was diagnosed and characterized as recommended by the Ministry of Health. METHODS: Biological samples from suspected canine carriers were analyzed by the isoenzyme electrophoresis technique. The 6PGDH enzyme and reference strain IOC/L0566 (MHOM/BR/1975/M2903) of Leishmania (Leishmania) infantum was used as one of the controls. RESULTS: Electrophoresis analysis revealed that the canine isolates belonged to the species L. (L.) infantum. CONCLUSIONS: The authors emphasize the importance of species characterization, particularly in areas of mixed infection like Cuiabá. INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral apresenta comportamento urbano em algumas cidades brasileiras, sendo os cães domésticos as principais fontes de infecção. Em Cuiabá-MT, a leishmaniose visceral canina foi diagnosticada e caracterizada, como recomendação do Ministério da Saúde. MÉTODOS: Amostras biológicas de cães suspeitos foram analisadas por eletroforese de isoenzimas. Foram utilizadas a enzima 6PGDH e a cepa de referência IOC/L0566 (MHOM/BR/1975/M2903) de Leishmania (Leishmania) infantum, como um dos controles. RESULTADOS: A análise eletroforética revelou que os isolados pertenciam à espécie L. (L.) infantum. CONCLUSÕES: Os autores ressaltam a importância da caracterização da espécie, principalmente em cidades com infecção mista, como Cuiabá.

INTRODUCAO: Diversos estudos avaliaram fatores de risco para leishmaniose visceral humana, mas poucos focalizaram a infeccao canina. O objetivo deste estudo e avaliar a associacao entre condicoes socio-ambientais peridomiciliares e a presenca de caes sorologicamente positivos para Leishmania chagasi em Teresina, Brasil. METODOS: Estudo caso-controle baseado nos resultados de inquerito soroepidemiologico de rotina entre caes domesticos no ano de 2007. O exame sorologico foi realizado por meio de reacao de imunofluorescencia indireta. Foram consideradas como casos todas as residencias que albergassem pelo menos um cao soropositivo, enquanto o grupo controle correspondeu a uma amostra aleatoria das residencias onde somente caes soronegativos foram registrados. Associacoes entre as variaveis foram expressas por meio da razao de chance ou odds ratio (OR) e respectivos intervalos de 95% de confianca (IC95%) estimados mediante regressao logistica multivariada. RESULTADOS: Residencias com historia de pelo menos um cao recolhido pelo programa de controle da leishmaniose visceral nos ultimos 12 meses apresentaram chance cerca de 5 vezes mais alta de terem caes infectados em comparacao com residencias sem historia de caes removidos no periodo (OR = 5,19; IC95% = 3,20-8,42). Residencias com presenca de gatos apresentaram chance 58% mais alta de terem caes infectados em comparacao com aquelas sem gatos (OR = 1,58; IC95% = 1,01-2,47). CONCLUSOES: A identificacao de fatores associados a leishmaniose visceral canina pode ser util para a delimitacao de areas sob maior risco para leishmaniose visceral humana, na medida em que a infeccao canina geralmente precede a ocorrencia de casos humanos.

No Brasil, a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é causada por Leishmania infantum e os cães tem sido considerados como os principais responsáveis pela dispersão da doença. A LVC pode se manifestar com diferentes formas clínicas, variando desde uma infecção de caráter assintomático até uma forma sintomática grave, a qual na maioria das vezes culmina com a morte dos animais. O presente estudo empregou ferramentas biotecnológicas para avaliar características biológicas, bioquímicas e genéticas em dez cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas (assintomática ou sintomática) da LVC, buscando identificar fenótipos de virulência e patogenicidade. Todos os isolados obtidos foram submetidos às seguintes avaliações: (i) comportamento em meio de cultivo (LIT); (ii) infectividade e patogenicidade mediante infecção experimental no modelo hamster (Mesocricetus auratus); (iii) análise bioquímica por meio de perfil de isoenzimas; (iv) identificação da espécie de Leishmania por PCR-RFLP; (v) RAPD-PCR para identificação de possíveis polimorfismos genéticos. Os resultados demonstram que os isolados de Leishmania obtidos de cães com ambas formas clínicas, apresentam fenótipos de crescimento diferenciados. Apesar da baixa taxa de infectividade obtida pela infecção experimental em hamster, foi possível selecionar dois isolados (I-3 e I-8), com diferentes potencias de infectividade quando comparados aos demais isolados e a cepa de referência L. infantum (MHOM/BR/74/PP75). As análises dos perfis enzimáticos (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME e 6PGD), demonstraram que os isolados obtidos tanto de cães sintomáticos como assintomáticos apresentam padrões similares em relação ao número e migração das bandas eletroforética quando comparados com a cepa de referência de L. infantum. A PCR-RFLP demonstrou que nove isolados apresentaram perfil idêntico ao observado para cepa de referência de L. infantum, enquanto um isolado apresentou perfil semelhante ao da espécie L. amazonensis. Com o intuito de identificar características genéticas entre os isolados, que pudessem ser associadas com as formas clínicas da LVC foi empregada a técnica de PCR-RAPD. Os resultados obtidos permitiram a construção de um fenograma consenso gerado pelos iniciadores (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1), demonstraram que maioria dos isolados apresentavam perfil genético semelhante ao da cepa de referência de L. infantum, sem diferenças significativas entre isolados obtidos de cães sintomáticos e assintomáticos. O conjunto de resultados obtidos no presente estudo vem contribuindo para um melhor entendimento das características biológicas, bioquímicas e genéticas de cepas de L. infantum oriundas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC. In Brazil, Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is caused by Leishmania infantum parasites and infected dogs have been the ones responsible for the spread of the disease in large Brazilian cities. CVL manifests itself as a broad clinical spectrum ranging from asymptomatic infection to patent severe disease, which mostly culminates on death. The main goal of this work was the employment of biotechnological tools to evaluate biochemical and genetic profiles of ten Leishmania spp. strains, isolated from naturally-infected dogs presenting the asymptomatic and symptomatic clinical forms of the disease. Our major focus was the identification of phenotypes associated to virulence and pathogenicity. To accomplish this goal all isolates underwent the following assessments: (i) evaluation of parasite growth in culture medium (LIT); (ii) measurement of parasite infectivity and pathogenicity in the hamster model; (iii) determination of the iso-enzymatic profile; (iv) PCR-RFLP for species identification, and (v) RAPD-PCR for identification of possible genetic polymorphisms. Our results revealed that all isolates from both asymptomatic and symptomatic groups exhibited different in vitro growth curves. Despite the low rate of infectivity in the experimental hamster model of infection, we have selected two strains (I-3 and I-8) with differing potential for infection when compared to the reference L. infantum (MHOM/BR/74/PP75) and to other isolates. Analyses of the enzymatic systems (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME and 6PGD) employed herein demonstrated that the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs presented similar patterns in respect to the number of bands and electrophoretic profile when compared to the L. infantum reference strain. The PCR- RFLP technique revealed that nine out of ten isolates presented a RFLP profile identical to the L. infantum reference strain. For the remaining isolate, a RFLP profile similar to the L. amazonensis species was obtained. At last, RAPD-PCR analyses of the isolates enabled the construction of a consensus phenetic tree generated using five primers (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1). In this experiment we demonstrated that most isolates displayed genetic profiles similar to the L. infantum reference strain, with no meaningful distinction between the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs. The data obtained in this study have contributed to a better understanding of the biological, biochemical and genetic profiles of L. infantum strains isolated from naturally-infected dogs with different clinical forms of CVL.

Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. Secretaria de Sa?de do Munic?pio de Barcarena. Departamento de Sa?de P?blica. Barcarena, PA, Brasil. Universidade de S?o Paulo. Faculdade de Medicina. Departamento de Patologia. S?o Paulo, SP, Brasil. Universidade de S?o Paulo. Faculdade de Medicina. Departamento de Patologia. S?o Paulo, SP, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasil. Minist?rio da Sa?de. Secretaria de Vigil?ncia em Sa?de. Instituto Evandro Chagas. Ananindeua, PA, Brasill / Universidade Federal do Par?. N?cleo de Medicina Tropical. Bel?m, PA, Brasil. A leishmaniose visceral canina (LVC) ? reconhecida pelas caracter?sticas cl?nicas da doen?a e ? altamente letal. A infec??o, entretanto, pode ser totalmente assintom?tica em alguns c?es soropositivos, o que tem levantado quest?o pol?mica sobre a possibilidade desses animais, serem ou n?o uma fonte importante da infec??o para o flebotom?neo, Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da leishmaniose visceral americana (LVA). Neste estudo foram examinados 51 c?es com LVC aguda, provenientes de ?rea end?mica de LVA no Estado do Par?, Brasil, e a carga parasit?ria, formas amastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi, na pele, linfonodo popl?teo e v?sceras (f?gado e ba?o) foi comparada com a de nove c?es assintom?ticos soropositivos (IFAT-IgG). Fragmentos de bi?psia desses tecidos obtidos post-mortem foram processados para an?lise atrav?s de imunohistoqu?mica, usando um anticorpo policlonal contra Leishmania sp. Os testes do Qui-quadrado (X2 ) e Mann Whitney foram usados para avaliar as m?dias da densidade de macr?fagos infectados (p < 0,05). Os resultados mostraram que n?o houve diferen?a (p > 0,05) na densidade de macr?fagos infectados da pele (10,7/mm2 x 15,5/mm2 ) e do linfonodo (6,3/mm2 x 8,3/mm2 ) entre c?es assintom?ticos e sintom?ticos. Entretanto, a densidade de macr?fagos infectados da v?scera de c?es sintom?ticos (5,3/mm2 ) foi maior (p < 0,05) que a de c?es assintom?ticos (1,4/mm2 ). Estes resultados sugerem, fortemente, que c?es naturalmente infectados por L. (L.) i. chagasi, assintom?ticos ou sintom?ticos, podem servir como fonte de infec??o, principalmente, considerando-se que a densidade de macr?fagos infectados da pele (10,7/mm2 x 15,5/mm2 ), local onde o flebotom?neo vetor Lu. longipalpis realiza a hematofagia, foi maior (p < 0,05) que as do linfonodo (6,3/mm2 x 8.3/mm2 ) e v?sceras (1,4/mm2 x 5,3/mm2) Canine visceral leishmaniasis (CVL) is recognizable by characteristic signs of disease and is highly lethal. The infection, however, may be quite inapparent in some seropositive dogs, and this has raised the polemic question as to whether or not such animals can be a source of infection for Lutzomyia longipalpis, the vector of American visceral leishmaniasis (AVL). In this study we have examined 51 dogs with acute CVL from an AVL area in Par? State, northern Brazil, and compared the parasite density, amastigotes of Leishmania (L.) infantum chagasi, in the skin, lymph node and viscera of symptomatic with that of nine asymptomatic but seropositive dogs (IFAT-IgG). Post-mortem biopsy fragments of these tissues were processed by immunohistochemistry, using a polyclonal antibody against Leishmania sp. The X2 and Mann Whitney tests were used to evaluate the means of infected macrophage density (p > 0.05). There was no difference (p %> 0.05) in the skin (10.7/mm2 x 15.5/mm2) and lymph node (6.3/mm2 x 8.3/mm2), between asymptomatic and symptomatic dogs, respectively. It was higher (p > 0.05), however, in the viscera of symptomatic (5.3/mm2) than it was in asymptomatic (1.4/mm2) dogs. These results strongly suggest that asymptomatic or symptomatic L. (L.) i. chagasi-infected dogs can serve as a source of infection, principally considering the highest (p > 0.05) parasite density from skin (10.7/mm2 x 15.5/mm2), the place where the vetor L. longipalpis takes its blood meal, compared with those from lymph node (6.3/mm2 x 8.3/mm2) and viscera (1.4/mm2 x 5.3/mm2).

Descreve-se a padronização de nova metodologia para detecção de anticorpos antiformas promastigotas fixadas de L. (L.) chagasi, por citometria de fluxo (AAPF-IgG), sua aplicabilidade e desempenho na identificação de casos de leishmaniose visceral canina (LVC). Foram avaliados dois grupos de cães classificados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), como: não reatores (NR, n=10) e reatores (R, n=50) dos quais foram coletadas amostras de sangue (soro) para realização dos testes laboratoriais. Os resultados relacionados ao estabelecimento, aplicabilidade e desempenho da metodologia AAPF-IgG demonstraram que essa metodologia possibilita a identificação de uma região de reatividade diferencial entre cães NR e R, no soro diluído a 1:2048 e o valor de 20% de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) como ponto de corte entre resultados positivos e negativos, mostrando que a AAPF-IgG aplica-se na identificação de casos de LVC, possibilitando distinguir 96% de cães R como positivos e 100% de cães NR como negativos. Esses resultados em conjunto sugerem que a utilização da AAPF-IgG pode ser um novo instrumento para ensaios clínicos de diagnóstico sorológico da LVC. The current study evaluated the standardization of a new methodology for detection of anti-fixed L. (L.) chagasi promastigote antibodies by flow cytometry (AAPF-IgG), as well its applicability and performance in the identification of cases of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL). Two groups of dogs were classified by RIFI (gold standard) as no reactors (NR, n=10) and reactors (R, n=50). Blood samples were collected and used for the laboratorial tests (RIFI and AAPF-IgG). The results showed that the new AAPF-IgG assay makes possible the identification of an area of differential reactivity between dogs NR and R at the dilution of 1:2048 and 20% of percentage of positive fluorescent parasite as the cut point among positive and negative results. The AAPF-IgG assay was able to distinguish 96% of R dogs as positive and 100% of NR dogs as negative. Hence, those data support the applicability of flow cytometry AAPF-IgG method as a new instrument for serological diagnosis of CVL.

Descreve-se a padronização de nova metodologia para detecção de anticorpos antiformas promastigotas fixadas de L. (L.) chagasi, por citometria de fluxo (AAPF-IgG), sua aplicabilidade e desempenho na identificação de casos de leishmaniose visceral canina (LVC). Foram avaliados dois grupos de cães classificados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), como: não reatores (NR, n=10) e reatores (R, n=50) dos quais foram coletadas amostras de sangue (soro) para realização dos testes laboratoriais. Os resultados relacionados ao estabelecimento, aplicabilidade e desempenho da metodologia AAPF-IgG demonstraram que essa metodologia possibilita a identificação de uma região de reatividade diferencial entre cães NR e R, no soro diluído a 1:2048 e o valor de 20% de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) como ponto de corte entre resultados positivos e negativos, mostrando que a AAPF-IgG aplica-se na identificação de casos de LVC, possibilitando distinguir 96% de cães R como positivos e 100% de cães NR como negativos. Esses resultados em conjunto sugerem que a utilização da AAPF-IgG pode ser um novo instrumento para ensaios clínicos de diagnóstico sorológico da LVC.

Descreve-se a padronização de nova metodologia para detecção de anticorpos antiformas promastigotas fixadas de L. (L.) chagasi, por citometria de fluxo (AAPF-IgG), sua aplicabilidade e desempenho na identificação de casos de leishmaniose visceral canina (LVC). Foram avaliados dois grupos de cães classificados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), como: não reatores (NR, n=10) e reatores (R, n=50) dos quais foram coletadas amostras de sangue (soro) para realização dos testes laboratoriais. Os resultados relacionados ao estabelecimento, aplicabilidade e desempenho da metodologia AAPF-IgG demonstraram que essa metodologia possibilita a identificação de uma região de reatividade diferencial entre cães NR e R, no soro diluído a 1:2048 e o valor de 20% de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) como ponto de corte entre resultados positivos e negativos, mostrando que a AAPF-IgG aplica-se na identificação de casos de LVC, possibilitando distinguir 96% de cães R como positivos e 100% de cães NR como negativos. Esses resultados em conjunto sugerem que a utilização da AAPF-IgG pode ser um novo instrumento para ensaios clínicos de diagnóstico sorológico da LVC. The current study evaluated the standardization of a new methodology for detection of anti-fixed L. (L.) chagasi promastigote antibodies by flow cytometry (AAPF-IgG), as well its applicability and performance in the identification of cases of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL). Two groups of dogs were classified by RIFI (gold standard) as no reactors (NR, n=10) and reactors (R, n=50). Blood samples were collected and used for the laboratorial tests (RIFI and AAPF-IgG). The results showed that the new AAPF-IgG assay makes possible the identification of an area of differential reactivity between dogs NR and R at the dilution of 1:2048 and 20% of percentage of positive fluorescent parasite as the cut point among positive and negative results. The AAPF-IgG assay was able to distinguish 96% of R dogs as positive and 100% of NR dogs as negative. Hence, those data support the applicability of flow cytometry AAPF-IgG method as a new instrument for serological diagnosis of CVL.

Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonotic disease that presents variable clinical and laboratory aspects. The aims of this study were to identify the main biochemical/hematological status of dogs naturally infected with Leishmania (Leishmania) infantum and to associate theses parameters with clinical forms of CVL. Blood samples were analyzed from 51 dogs, 15 uninfected (control group) and 36 infected, which were classified clinically in three groups: asymptomatic (n=12), oligosymptomatic (n=12) and symptomatic (n=12). All the infected dogs showed lower albumin/globulin ratios (A-G ratio) than the limit of reference. The mean values of total protein, urea, α-globulin 2, globulin and A-G ratio of infected dogs were outside the reference interval and differed significantly from those of the controls. Anemia was detected only in groups that showed clinical signs of the disease, and a statistical analysis indicated a significantly higher frequency of lower eritrogram in these groups than in the asymptomatic group. In addition, a significant association was observed between anemia and the presence of the symptoms, with dogs displaying higher erythrogram values showing better clinical conditions. These results provide additional evidence that the clinical forms of CVL may reflect on the erythrogram status. A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma zoonose com aspectos clínicos e laboratoriais variáveis. O objetivo deste trabalho foi identificar os principais achados hematológicos e bioquímicos em cães naturalmente infectados com Leishmania (Leishmania)infantum e associar esses parâmetros com as formas clínicas da LVC. Foram analizadas amostras sanguíneas provenientes de 51 cães, sendo 15 cães não infectados (grupo controle) e 36 infectados, os quais foram classificados clinicamente em três grupos: assintomáticos (n=12), oligossintomáticos (n=12) e sintomáticos (n=12). Todos os cães infectados apresentaram valores na relação albumina/globulina (A/G) abaixo do limite inferior de referência. Os valores médios de proteína total, uréia, α-2 globulina, globulina e A/G dos grupos de cães infectados permaneceram fora dos intervalos de referências e significativamente diferente quando comparados aos do grupo controle. Anemia foi registrada somente nos grupos de animais que manifestavam sinais clínicos da enfermidade, sendo que nas análises estatísticas constatou-se frequencia significativamente maior de alterações no eritrograma quando comparados ao grupo assintomático. Associação significativa foi observada entre anemia e a presença de sinais clínicos, onde os cães com os maiores valores de eritrograma apresentavam a melhor condição clínica. Os resultados fornecem evidência adicional que as formas clínicas da LVC podem refletir no eritrograma.

Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the protozoa Leishmania infantum and can cause an inflammatory reaction in the gastrointestinal tract, however the role of granulocytic cells (neutrophils, eosinophils, and mast cells) in the intestine of dogs infected is not fully understood. We performed a quantitative analysis these cells in the intestinal wall of dogs with canine visceral leishmaniasis (CVL). Twenty dogs were assigned to one of three groups: group 1 (G1, n=8), dogs with CVL and L. infantum amastigotes in the intestine; group 2 (G2, n=9), dogs with CVL but without intestinal amastigotes; and group 3 (G3, n=3), uninfected dogs (control group). Granulocytic cells were counted in the crypt-villus unit (mucosa), submucosa, and muscle layer of the intestinal mucosa. Cell counts were higher in the intestinal wall of dogs from G2 followed by G1 and G3 (p≤0.05). In G1, there was a low inverse correlation between parasite burden of the small intestine and granulocyte counts (r= -0.1, p≤0.01). However, in G2 dogs, mast cell and eosinophil numbers showed positive correlation (r=0.85, p≤0.01). The granulocytic cell hyperplasia observed in the intestine of L. infantum-infected dogs suggests that these cells may be involved in the cell-mediated immune response for parasite elimination. Resumo A leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada pelo protozoário Leishmania infantum e pode causar uma reação inflamatória no trato gastrointestinal, entretanto o papel das células granulocíticas (neutrófilos, eosinófilos e mastócitos) no intestino de cães infectados não é totalmente compreendido. Neste estudo realizamos uma análise quantitativa dessas células na parede intestinal de cães com LV. Vinte cães foram distribuídos em três grupos: grupo 1 (G1, n=8), cães com LV e amastigotas de L. infantum no intestino; grupo 2 (G2, n=9), cães com LV, mas sem amastigotas intestinais; e grupo 3 (G3, n=3), não infectados (grupo controle). Células granulocíticas foram contadas na unidade cripta-vilo (mucosa), submucosa e camada muscular da mucosa intestinal. Observamos hiperplasia dessas células na parede intestinal de cães do G2, seguidas das G1 em relação ao G3 (p≤0,05). No G1, houve uma correlação inversa baixa entre a carga parasitária do intestino delgado e a contagem de granulócitos (r= -0,1; p≤0,01). No entanto, nos cães do G2, os números de mastócitos e eosinófilos apresentaram correlação positiva (r=0,85; p≤0,01). A hiperplasia de células granulocíticas observada no intestino de cães infectados por L. infantum sugere que essas células podem estar envolvidas na resposta imune mediada por células para a eliminação do parasita.