Search

Aim. The purpose was to obtain the recombinant fusion protein based on the human interleukin-7 (rhIL7) and cellulose binding domain (CBD). Methods. The DNA sequences encoding rhIL-7 and CBD were subcloned into the pET24a(+). Vector containing the 6His-tag sequence for further chromatographic purification of the target protein. The cells of E. coli strain BL21(DE3) were transformed with pET24-rhIL7-CBD plasmid vector. Protein synthesis was induced in clones by IPTG and by autoinduction. Results. An expression cassette of rhIL7-CBD protein has been designed. Producers of rhIL7-CBD protein were obtained. It was shown that the autoinduction protocol provides protein synthesis in E. coli (but IPTG induction doesn’t). Protein was obtained in the cytoplasmic fraction in form of inclusion bodies. In vitro method of purification of rhIL7-CBD from inclusion bodies has been worked out. Conclusions. The obtained rhIL7-CBD protein can be used for the microcrystalline cellulose immunosorbent construction for the purification of the specific polyclonal IL-7 antibodies and also for qualitative and quantitative analysis of IL-7 receptors. Keywords: IL-7, CBD, inclusion bodies, renaturation.

Aim. The purpose was to obtain a functionally active form of the recombinant fusion protein based on the human interleukin-7 (rhIL7) and bacterial alkaline phosphatase (BAPmut). Methods. The DNA sequences encoding rhIL-7 and BAPmut were subcloned into the pET24a(+) plasmid vector containing the 6His-tag sequence for further chromatographic purification of the target protein. The cells of E. coli strain BL21(DE3) were transformed with pET24-rhIL7-BAPmut plasmid vector. Protein synthesis was induced by IPTG and by autoinduction. Bifunctional activity of rhIL7-BAPmut after refolding via dilution is confirmed immunochemically by binding to specific antibodies. Results. RhIL7-BAPmut protein has been designed. It was shown that autoinduction protocol provides a significantly higher level of protein synthesis in E. coli compared with IPTG induction. In vitro method of purification and renaturation of rhIL7-BAPmut from inclusion bodies has been worked out. It has been shown that rhIL7-BAPmut has a specific biological activity after renaturation. Conclusions. The obtained rhIL7-BAPmut protein can be used for screening of immune combinatorial cDNA libraries of immunoglobulins variable genes, that are the sources of specific single chain antibodies. The protein also can be used for qualitative and quantitative analysis of IL-7 receptors. Keywords: IL-7, BAPmut, inclusion bodies, renaturation.

Aim. Comparison of the IgG-binding activity of recombinant Staphylococcal protein A with introduced C-terminal cysteine residue (SPA-Cys) or goat anti-human IgG antibodies (anti-IgG) after their immobilization on a gold sensor surface of surface plasmon resonance (SPR) spectrometer. Methods. SPA-Cys or anti-IgG were immobilized on a gold sensor surface to form two variants of a bioselective element of the immunosensor. SPR spectrometry was used for the detection of IgG-binding activity of the immobilized proteins. Results.The SPR sensor response to the immobilization of anti-IgG was more than two times higher than that at the immobilization of SPA-Cys. However, there is almost the double advantage for SPA-Cys in the number of immobilized molecules. Moreover, the bioselective element of the immunosensor based on SPA-Cys showed a much better capability of binding Ig than bioselective element based on anti-IgG. Conclusions.The study on the immobilization of SPA-Cys or anti-IgG on the sensor surface of SPR spectrometer, and the interactions of immobilized proteins with human IgG demonstrated obvious advantages of SPA-Cys. Мета. Порівняння імуноглобулін-зв’язувальної активності козячих антитіл проти IgG людини (анти-IgG) або рекомбінантного білка A Staphylococcus aureus зі спеціально введеним С-кінцевим залишком цистеїну (SPA-Cys) після їх іммобілізації на золотій сенсорній поверхні спектрометра поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Методи. SPA-Cys або анти-IgG були іммобілізовані на золотій сенсорній поверхні для формування двох варіантів біоселективного елементу імуносенсора. Дослідження IgG-зв’язувальної активності іммобілізованих білків проводили за допомогою спектрометрії ППР. Результати. Сенсорний відгук при іммобілізації анти-IgG виявився більш ніж удвічі вищим за відгук, отриманий при іммобілізації SPA-Cys. Однак по кількості іммобілізованих молекул – майже двократна перевага за SPA-Cys. Крім того, біоселективний елемент імуносенсора на основі SPA-Cys значно краще зв’язує IgG, ніж біоселективний елемент на основі анти-IgG. Висновки. Дослідження процесів іммобілізації SPA-Cys або анти-IgG на сенсорній поверхні спектрометра ППР, а також взаємодії іммобілізованих білків з IgG продемонструвало очевидні переваги рекомбінантного білка А. Цель. Сравнение иммуноглобулин-связующей активности козьих антител против IgG человека (анти-IgG) или рекомбинантного белка A Staphylococcus aureus со специально введенным С-концевым остатком цистеина (SPA-Cys) после их иммобилизации на золотой сенсорной поверхности спектрометра поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Методы. SPA-Cys или анти-IgG были иммобилизованы на золотой сенсорной поверхности для формирования двух вариантов биоселективного элемента иммуносенсора. Исследование IgG-связующей активности иммобилизованных белков проводили с помощью спектрометрии ППР. Результаты. Сенсорный отклик при иммобилизации анти-IgG оказался более чем вдвое выше отклика, полученного при иммобилизации SPA-Cys. Однако по количеству иммобилизованных молекул – почти двукратное преимущество за SPA-Cys. Кроме того, биоселективный элемент иммуносенсора на основе SPA-Cys значительно лучше связывает IgG, чем биоселективный элемент на основе анти-IgG. Выводы. Исследование процессов иммобилизации SPA-Cys или анти-IgG на сенсорной поверхности спектрометра ППР, а также взаимодействия иммобилизованных белков с IgG продемонстрировало очевидные преимущества рекомбинантного белка А.

Aim. To investigate the formation of an intermediate layer of the immunosensor bioselective element based on the recombinant protein A from Staphylococcus aureus with cysteine residue (SPA-Cys) and its interactions with human IgG using the SPR spectrometer «Plasmon». Methods. The activity of the immune components applied was tested by ELISA. The spectrometry of surface plasmon resonance was used for studying protein immobilization on a gold sensor surface and interactions between the immobilized SPA-Cys and human immunoglobulin. Results. A direct dependence of the sensor response on the concentration of SPA-Cys in the range of 0.2 to 2 µM at its immobilization was demonstrated. The efficiency of blocking nonspecific adsorption sites on the sensor surface with milk proteins and the direct dependence of the sensor response on IgG concentration and surface density of immobilized SPA-Cys were shown. Fitting the experimental data to a Langmuir plot yields a Kd value for SPA-Cys/IgG binding 8.5 ± 0.7× 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1× 107 M–1). The determined equilibrium binding constant indicates a quite strong interaction and its value is consistent with the literature data. Conclusions. A successful immobilization of SPA-Cys on a gold surface of the SPR spectrometer while preserving its high immunoglobulin-binding activity, selectivity and stability of the sensor response confirms the efficiency of SPA-Cys as an intermediate component for the creation of the immunosensor bioselective elements. Мета. Дослідити формування проміжного шару біоселективного елемента імуносенсора на основі рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його взаємодії з імуноглобуліном людини за допомогою спектрометра ППР "Плазмон". Методи. Активність використаних імунокомпонентів була перевірена за допомогою імуноферментного аналізу. Для вивчення іммобілізації білків на золотій сенсорній поверхні і взаємодій між іммобілізованим SPA-Cys і імуноглобуліном людини застосували спектрометрію поверхневого плазмонного резонансу. Результати. Продемонстрована пряма залежність сенсорного відгуку від концентрації SPA-Cys в діапазоні від 0,2 до 2 мкМ під час його іммобілізації. За допомогою білків молока вдалося ефективно знизити рівень неспецифічної адсорбції на сенсорній поверхні. Була показана пряма залежність сенсорного відгуку від концентрації IgG і поверхневої густини іммобілізованого SPA-Cys. Апроксимація експериментальних даних графіком ізотерми Ленгмюра дає значення Kd для взаємодії іммобілізованого SPA-Cys із IgG 8,5 ± 0,7 × 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1 × 107 М-1). Отримана величина рівноважної константи зв'язування вказує на досить сильну взаємодію, і її значення узгоджується з літературними даними. Висновки. Успішна іммобілізації SPA-Cys на золотій поверхні спектрометра ППР при збереженні його високої IgG-зв'я­зувальної активності, селективності та стабільності сенсорного відгуку підтверджує ефективність SPA-Cys як проміжного компонента для створення біоселективного елемента імуносенсора. Цель. Исследовать формирование промежуточного слоя био­селективного элемента иммуносенсора на основе рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его взаимодействие с иммуноглобулином человека с помощью спектрометра ППР "Плазмон". Методы. Активность использованных иммунокомпонентов была проверена с помощью иммуноферментного анализа. Для изучения иммобилизации белков на золотой сенсорной поверхности и взаимодействий между иммобилизованным SPA-Cys и человеческим иммуноглобулином применили спектрометрию поверхностного плазмонного резонанса. Результаты. Продемонстрирована прямая зависимость сенсорного отклика от концентрации SPA-Cys в диапазоне от 0,2 до 2 мкМ при его иммобилизации. С помощью белков молока удалось эффективно снизить уровень неспецифической адсорбции на сенсорной поверхности. Была показана прямая зависимость сенсорного отклика от концентрации IgG и поверхностной плотности иммобилизованного SPA-Cys. Аппроксимация экспериментальных данных графиком изотермы Ленгмюра дает значение Kd для взаимодействия иммобилизованного SPA-Cys с IgG 8,5 ± 0,7 × 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1 × 107 М-1). Полученная величина равновесной константы связывания указывает на достаточно сильное взаимодействие, и ее значение согласуется с литературными данными. Выводы. Успешная иммобилизация SPA-Cys на золотой поверхности спектрометра ППР при сохранении его высокой IgG-связывающей активности, селективности и стабильности сенсорного отклика подтверждает эффективность SPA-Cys в качестве промежуточного компонента для создания биоселективного элемента иммуносенсора.

Aim. The development of a laboratory method for the production of immunoaffinity chromatography medium for the purification of the recombinant human IFN-β1b. Methods. A gene of the chimeric protein ScFvbINF-CBD was constructed using the DNA sequences encoding ScFv specific to hIFN-β1b and the cellulose-binding domain (CBD) of Clostridium thermocellum. The developed chimeric protein was expressed in Escherichia coli cells. The target protein was obtained in soluble, functionally active form by its renaturation from the bacterial inclusion bodies in vitro. The ScFvbINF-CBD was immobilized on a chitin carrier. Results. The introduction of CBD by gene engineering techniques enabled the oriented non-covalent immobilization of ScFvbINF-CBD on chromatographic matrix. The developed immunoaffinity medium allowed isolating the rhIFN-β1b from the complex mixture, after its renaturation from the inclusion bodies, with more than 89 % purity. Conclusion. The designed immunoaffinity medium provides isolating the rhIFN-β1b from the complex protein mixtures. Мета. Розробити лабораторний метод створення імуноафінного хроматографічного сорбенту для виділення та очищення рекомбінантного IFN-β1b людини. Методи. Викорис­то­ву­ючи послідовності ДНК, які кодують ScFv специфічні до hIFN-β1b, та целюлозозв’язувальний домен (CBD) Clostri­di­um thermocellum, створено ген химерного протеїну ScFvbINF-CBD. Проведено експресію створеного химерного протеїну в клітинах Escherichia coli. Цільовий білок одержували у розчинній, функціонально активній формі шляхом ренатурації з бактеріальних тілець включення in vitro. ScFvbINF-CBD іммобілізували на хітиновому носії. Результати. Вве­дення CBD до складу химерного білка забезпечує орієнтовану, не ковалентну іммобілізацію ScFvbINF-CBD на хроматографічній матриці. За допомогою створеного імуноафінного сорбенту було виділено rhIFN-β1b зі складної суміші білків, одержаної після його ренатурації з тілець включення, з чистотою більше ніж 89 %. Висновки. Створений імуноафінний хроматографічний сорбент дозволяє виділяти рекомбінантний IFN-β1b людини зі складних сумішей білків. Цель. Разработать лабораторный метод создания иммуноаффинного хроматографического сорбента для выделения и очистки рекомбинантного IFN-β1b человека. Методы. Ис­по­льзуя последовательности ДНК, кодирующие ScFv специ­фичные к hIFN-β1b, и целлюлозосвязывающий домен (CBD) Clostridium thermocellum, создан ген химерного белка ScFvbINF-CBD. Проведена экспрессия созданного химерного белка в клетках Escherichia coli. Целевой белок получали в растворимой, функционально активной форме путем ренатурации из бактериальных телец включения in vitro. ScFvbINF-CBD иммобилизовали на хитиновом носителе. Результаты. Вве­дение CBD в состав химерного белка обеспечивает ориентированную не ковалентную иммобилизацию ScFvbINF-CBD на хроматографической матрице. С помощью созданного иммуносорбента был выделен rhIFN-β1b из сложной смеси белков, полученной после его ренатурации из телец включения, с чистотой более 89 %. Вы­воды. Созданный иммуноаффинный хроматографический сорбент позволяет выделять рекомбинатный IFN-β1b человека из сложных белковых смесей.

Proteins A, G and L are native or recombinant proteins of microbial origin that bind to mammalian immunoglobulins. Preferably recombinant variants of proteins A, G, L are used in biotechnology for affinity sorbents production. Сomparative characteristics of proteins A, G, L and affinity sorbents on the basis of them, advantages and disadvantages of these proteins application as ligands in the affinity chromatography are done. Analysis of proteins A, G, L properties is presented. Binding specificities and affinities of these proteins differ between species and antibody subclass. Protein А has high affinity to human IgG1, IgG2, IgG4, mouse IgG2a, IgG2b, IgG3, goat and sheep IgG2, dog, cat, guinea pig, rabbit IgG. Protein G binds strongly to human, mouse, cow, goat, sheep and rabbit IgG. Protein L has ability of strong binding to immunoglobulin kappa-chains of human, mouse, rat and pig. Expediency of application of affinity chromatography with usage of sorbents on the basis of immobilized proteins A, G, L are shown for isolation and purification of antibodies different classes. Previously mentioned method is used as an alternative to conventional methods of protein purification, such as ion-exchange, hydrophobic interactions, metal affinity chromatography, ethanol precipitation due to simplicity in usage, possibility of one-step purification process, obtaining of proteins high level purity, multiuse at maintenance of proper storage and usage conditions. Affinity sorbents on the basis of immobilized proteins A, G, L are used not only for antibodies purification, but also for extraction of different antibodies fractions from blood serum.

The developed surface plasmon resonance (SPR) biosensor based on the recombinant Staphylococcal protein A with an additional cysteine residue (SPA-Cys) used as a biorecognition component showed a good selectivity and sensitivity for the immunoglobulin detection. The developed biosensor with SPA-Cys-based bioselective element can also be used as a first step of immunosensor creation. The successful immobilization of SPA-Cys on the nanolayer gold sensor surface of the SPR spectrometer was performed. The efficiency of blocking nonspecific sorption sites on the sensor surface with milk proteins, gelatin, BSA, and HSA was studied, and a rather high efficiency of using gelatin was confirmed. The SPR biosensor selectively interacted with IgG and did not interact with the control proteins. The linear dependence of the sensor response on the IgG concentration in the range from 2 to 10 μg/ml was shown. Using the calibration curve, the IgG concentration was measured in the model samples. The determined concentrations are in good agreement (r 2 = 0.97) with the given concentration of IgG.

A highly efficient and inexpensive laboratory method of production and purification of polyclonal antibodies against the human cell surface CD34 marker was developed. It was demonstrated that unglycosy-lated recombinant protein cloned in E. coli cells and containing the extracellular fragment of the human CD34 antigen maintained the necessary antigenic determinants during isolation from bacteria and during immunization, induced the production of specific polyclonal antibodies, which could recognize the native antigen on the cell surface. The obtained antibodies can be used for CD34+ cell phenotyping by the immunocytochemistry and flow cytometry methods.

Aim. Engineering of recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue (SPA-Cys) for preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of bioselective element of immunosensor. Methods. DNA sequences encoding IgG-binding region of SPA, His-tag and cysteine were genetically fused and expressed in E. coli. SPA-Cys was immobilized on maleimide-functionalized silica beads for affinity chromatography stationary phase preparation and on a gold sensor surface as a bioselective element of immunosensor. Results. SPA-Cys was expressed at a high-level in a soluble form. The target protein was purified and showed a high IgG-binding activity. The capacity of the obtained SPA-Cys-based affinity chromatography stationary phase was 10–12 mg of IgG /ml. The purity of eluted IgG was more than 95 % in one-step purification procedure. The developed SPA-Cys-based bioselective element of immunosensor selectively interacted with human IgG and did not interact with the control proteins. Conclusions. The recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue was successfully used for the preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of the bioselective element of immunosensor. Цель. Получение рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его применение для аффинной хроматографии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Методы. Генно-инженерными методами конструировали и экспрессировали в E. coli последовательность ДНК, которая кодирует пять IgG-связывающих доменов SPA, His-таг и цистеин. Полученный рекомбинантный белок SPA-Cys иммобилизовали на малеимид-активированных микрогранулах силикагеля для приготовления биоафинного сорбента и на золотой сенсорной поверхности для разработки иммуносенсора. Результаты. Cинтезом в E. coli был получен белок SPA-Cys в растворимой форме с высоким выходом. Очищенный рекомбинантный белок А имеет высокую IgG-связывающую активность. Емкость синтезированного с использованием SPA-Cys биоафинного сорбента составляла 10–12 мг IgG/мл. Одностадийная процедура аффинной хроматографии сыворотки крови позволяет получать IgG с чистотой более 95 %. Показано, что биоселек­тивный элемент иммуносенсора, сформированный на ос­нове SPA-Cys, избирательно взаимодействует с IgG человека и не взаимодействует с контрольными белками. Выво­ды. Рекомбинантный белок SPA-Cys был успешно использован для приготовления стационарной фазы аффинной хро­ма­то­графии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Мета. Отримання рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його застосування для афінної хроматографії та формування біоселективного елемента імуносенсора. Методи. Генно-інженерними методами конструювали та експресували в E. coli послідовність ДНК, яка кодує п’ять IgG-зв’язувальних доменів SPA, His-таг і цистеїн. Отриманий рекомбінантний білок SPA-Cys іммобілізували на малеїмід-активованих мікрогранулах силікагелю для приготування біоафінного сорбенту та на золотій сенсорній поверхні для розробки імуносенсора. Результати. Cин­те­зом у E. coli був отриманий білок SPA-Cys в розчинній формі з високим виходом. Очищений рекомбінантний білок А має високу IgG-зв’язувальну активність. Ємність біоафінного сор­бенту з іммобілізованим SPA-Cys складала 10–12 мг IgG/мл. Одностадійна процедура афінної хроматографії сироватки кро­ві дозволяє отримувати IgG з чистотою більш ніж 95 %. По­казано, що біоселективний елемент імуносенсора, сформований на основі SPA-Cys, вибірково взаємодіє з IgG людини і не взаємодіє з контрольними білками. Висновки. Рекомбінантний білок SPA-Cys був успішно використаний для приготування стаціонарної фази афінної хроматографії і формування біоселективного елемента імуносенсора.