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[ES] En los últimos años, la aparición de bacterias resistentes a los antibióticos se ha convertido en una amenaza mundial debido al mal uso y abuso de estas sustancias en el tratamiento de enfermedades animales y humanas. Por este motivo, tratamientos convencionales para ciertas patologías han perdido total o parcialmente su efectividad. Además, la presencia de antibióticos en el medio ambiente tiene un impacto de larga duración que incrementa la incidencia de resistencias. Con el objetivo de controlar esta crisis emergente, las bacteriocinas se consideran una alternativa plausible ya que son capaces de matar a las bacterias resistentes mediante un mecanismo de acción que difiere del que presentan los antibióticos convencionales. Las bacteriocinas son proteínas biológicamente activas sintetizadas por las bacterias y secretadas al medio extracelular, donde presentan actividad antimicrobiana contra otras bacterias. Concretamente, las bacteriocinas producidas por bacterias ácido-lácticas son especialmente interesantes ya que son reconocidas como seguras (GRAS), y no presentan toxicidad en humanos debido a que son degradadas por proteasas en el tracto intestinal. El objetivo de nuestro estudio es aislar, caracterizar y purificar bacteriocinas ácido-lácticas que puedan inhibir al patógeno Gram negativo de origen alimentario Escherichia coli., [EN] In recent years, bacterial antibiotic resistance has become a worldwide hazard due to the misuse and abuse of antibiotics in the treatment of animal and human disorders. The emergence of resistant bacteria leads some conventional treatments to lose partial or total effectiveness. Moreover, the leaking of antibiotics into the environment has a long-lasting impact which increases the incidence of resistances. To control the resistance crisis, bacteriocins are considered one plausible alternative because may kill antibiotic-resistant bacteria using a different killing mechanism than antibiotics. Bacteriocins are proteins biologically active from bacteria, which are secreted to the extracellular medium, and have an antimicrobial action against other bacteria. Concretely, bacteriocins produced by lactic acid bacteria are specially interesting because they are generally recognized as safe (GRAS), and have no toxicity in humans since they are degraded by proteases in the intestinal tract. The purpose of our study is to isolate, characterize, and purify lactic acid bacteriocins which may inhibit the Gram-negative foodborne pathogen Escherichia coli.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2020-10-13T17:17:37Z No. of bitstreams: 2 Aruani_Tomoto2020.pdf: 2782501 bytes, checksum: 1fdb55f0b70a5ec202223d86c0987d63 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2020-10-13T17:17:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Aruani_Tomoto2020.pdf: 2782501 bytes, checksum: 1fdb55f0b70a5ec202223d86c0987d63 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2020-02-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Bacteriocins are antimicrobial peptides produced from lactic acid bacteria, which act against pathogenic bacteria and can be used as biopreservatives in food. Residues from cassava processing are usually associated with the presence of lactic acid bacteria, and can be used as a substrate for the isolation of lactic acid bacteria and as a culture medium for the production of bacteriocins. In this sense, the objective of this work was to optimize the production of bacteriocins in wastewater from the cassava starch industry, by lactic acid bacteria isolated from the residue of the cassava processing. Initially, a lactic acid bacteria was isolated from the liquid residue of the cassava flour industry, and then its potential for the production of bacteriocins was evaluated. Along with the strain of lactic bacteria isolated in the present work, a strain of Leuconostoc mesenteroides was also used, already isolated from the same residue and with proven bacteriocin production capacity. The isolated strain was identified by morphological and biochemical tests and by 16S genetic sequencing (V3-V4), being identified as Lactobacillus fermentum, with 99.48% homology. To select the factors that influenced the production of bacteriocins by L. mesenteroides and L. fermentum,experimental designs of the Plackett-Burman (PB) were carried out, with 5 factors (sucrose, yeast extract, potassium phosphate, magnesium sulfate, and Tween 80), with an incubation time of 36 hours, at 30 °C, and agitation of 100 rpm. The factors defined in the PB in 90%, for both strains, were: sucrose, yeast extract, and Tween 80. Then, kinetic tests were performed for both strains, in the total time of 35 h, with samples taken every 5 h, to identify the best fermentation time for the production of bacteriocins. Both strains showed the highest production in 20 hours of cultivation. Having defined the significant factors of PB for the production of bacteriocins and the best fermentation time, the Central Rotational Composite Design (CRCD) was performed for the strains of L. fermentum and L. mesenteroides, in order to optimize the production of bacteriocins. The factors for DCCR were: sucrose, yeast extract, and Tween 80, fermentation time of 20 hours, temperature of 30 °C, and agitation of 100 rpm. In the DCCR tests, the response surfaces and the significant effects of the independent variables on the dependent variable (production of bacteriocins) were evaluated to establish a statistical model to optimize the process. The results indicated that the best bacteriocin production for L. fermentum and L. mesenteroides was 11,751.03 and 3693.34 AU/mL, respectively. Finally, the co-culture of the two strains was evaluated; however, the production of bacteriocins decreased, demonstrating that the L. fermentum and L. mesenteroides strains showed incompatibility. Bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos a partir de bactérias láticas, que agem contra bactérias patogênicas, podendo ser utilizadas como biopreservantes nos alimentos. Os resíduos do processamento da mandioca normalmente estão associados com a presença de bactérias láticas, podendo assim ser utilizados como substratos para o isolamento de bactérias láticas e como meio de cultivo para a produção de bacteriocinas. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de bacteriocinas em água residuária de indústria de fécula de mandioca, por bactérias láticas isoladas do próprio resíduo do processamento da mandioca. Inicialmente, foi feito o isolamento de uma bactéria lática a partir do resíduo líquido da indústria de farinha de mandioca, e então avaliado seu potencial para a produção de bacteriocinas. Juntamente com a cepa de bactéria lática isolada no presente trabalho, utilizou-se também uma cepa de Leuconostoc mesenteroides, já isolada do mesmo resíduo e que apresentava capacidade comprovada de produção de bacteriocinas. A identificação da cepa isolada foi realizada por testes morfológicos, bioquímicos e por sequenciamento genético 16S (V3-V4), sendo identificada como Lactobacillus fermentum, com homologia de 99,48%. Para selecionar os fatores que influenciavam nas produções de bacteriocinas por L. mesenteroides e L. fermentum foram realizados delineamentos experimentais do tipo Plackett-Burman (PB), com 5 fatores (sacarose, extrato de levedura, fosfato de potássio, sulfato de magnésio e Tween 80), com tempo de incubação de 36 horas, a 30 °C e agitação de 100 rpm. Os fatores significativos no PB a 90%, para ambas as cepas, foram: sacarose, extrato de levedura e Tween 80. Na sequência, foram realizados ensaios cinéticos para ambas as cepas, no tempo total de 35 h, com amostras retiradas a cada 5 h, para identificar o melhor tempo de fermentação para a produção de bacteriocinas. As duas cepas apresentaram a maior produção em 20 h de cultivo. Definidos os fatores significativos do PB para a produção de bacteriocinas e o melhor tempo de fermentação, foi realizado o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) para as cepas de L. fermentum e L. mesenteroides, a fim de otimizar a produção de bacteriocinas. Os fatores para o DCCR foram: sacarose, extrato de levedura e Tween 80, tempo de fermentação de 20 horas, temperatura de 30 °C e agitação de 100 rpm. Nos ensaios do DCCR foram avaliadas as superfícies de respostas e os efeitos significativos das variáveis independentes sobre a variável dependente (produção de bacteriocinas), para estabelecer um modelo estatístico para otimizar o processo. Os resultados indicaram que as melhores produções de bacteriocinas para L. fermentum e L. mesenteroides foram de 11751,03 e 3693,34 AU/mL, respectivamente. Por último foi avaliada a cocultura das duas cepas; no entanto, a produção de bacteriocinas diminuiu, demonstrando que as cepas de L. fermentum e L. mesenteroides apresentaram incompatibilidade.

El objetivo de este trabajo fue obtener información sobre la microbiota del queso Paipa, determinar la calidad del queso Paipa producido por empresas formales e informales, caracterizar las bacterias potencialmente patógenas, determinar su susceptibilidad a los antimicrobianos y su tolerancia a los biocidas. También pretendió caracterizar y purificar los compuestos antimicrobianos producidos por bacterias ácido lácticas seleccionadas del queso Paipa. Los resultados indicaron que Firmicutes y Lactococcus fueron el principal phylum y género encontrado en los quesos. El 100% de las muestras de productores formales e informales presentaron poblaciones de coliformes y estafilococos por encima de los límites establecidos por la normativa colombiana. L. monocytogenes fue positivo en el 38% de las muestras. Los coliformes que prevalecieron fueron Escherichia coli (22%) y Citrobacter freundii (22%). Los coliformes (30%), fueron multirresistentes a los antibióticos, pero susceptibles a los biocidas. Se seleccionaron dos bacterias acidolácticas con actividad bacteriocinogénica (Leuconostoc mesenteroides y Lactococcus lactis). Las sustancias antimicrobianas producidas por estas bacterias coinciden con las características de leucocina y lacticina respectivamente. The objective of this work was to obtain information on the microbiota of Paipa cheese, determine the quality of Paipa cheese produced by formal and informal companies, characterize potentially pathogenic bacteria, determine its susceptibility to antimicrobials and its tolerance to biocides. It also aimed to characterize and purify the antimicrobial compounds produced by selected lactic acid bacteria from Paipa cheese. The results indicated that Firmicutes and Lactococcus were the main phylum and genus found in the cheeses. 100% of the samples from formal and informal producers present a regulation on coliform and staphylococcal populations above the limits established by the Colombian. L. monocytogenes was positive in 38% of the samples. The coliforms that prevailed were Escherichia coli (22%) and Citrobacter freundii (22%). The coliforms (30%) were multi-resistant to antibiotics, but susceptible to biocides. Two lactic acid bacteria with bacteriocinogenic activity (Leuconostoc mesenteroides and Lactococcus lactis) were identified. The antimicrobial substances produced by these bacteria match the characteristics of leukocin and lacticin respectively. Tesis Univ. Jaén. Departamento de Ciencias de la Salud. Leída el 13 de noviembre de 2020.

Submitted by DANIELLE OLIVEIRA BORGES (danielle.enal@hotmail.com) on 2017-12-04T01:07:06Z No. of bitstreams: 1 DANIELLE O BORGES.pdf: 1863830 bytes, checksum: 87509ab7dd71a5d42244c753c2fa7ee6 (MD5) Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2017-12-04T13:39:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 borges_do_me_sjrp_par.pdf: 451320 bytes, checksum: 7e23a8a6fe60baac69f62fff7992650a (MD5) Made available in DSpace on 2017-12-04T13:39:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 borges_do_me_sjrp_par.pdf: 451320 bytes, checksum: 7e23a8a6fe60baac69f62fff7992650a (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 As bactérias acidoláticas (BAL) são bastante utilizadas em processos fermentativos na indústria de laticínios, porém algumas delas agem não somente como fermentadoras, com a produção de ácidos orgânicos a partir dos carboidratos presentes, mas também podem produzir substâncias que colaboram para a segurança microbiológica do produto fermentado ou compostos benéficos à saude. Em estudos in vitro anteriores, foi constatado que Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 apresenta potencial probiótico e ação bacteriostática sobre bactérias patogênicas, como Listeria monocytogenes e Escherichia coli. Neste trabalho foi avaliado o efeito de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 em creme fermentado, em co-cultura com outras BAL, e estudar as características físico-químicas e microbiológicas do creme, além de avaliar a capacidade de bioconservação pela produção de bacteriocinas, ácidos orgânicos e propriedade funcional pela produção de ácido linoleico conjugado (CLA) e pela atividade antioxidante por inibição de radicais livres. Foi utilizado creme de leite UHT homogeneizado padronizado em 20% de gordura e fermentado conforme quatro tratamentos: T1 - cultura mista de Lactococcus lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris; T2 - cultura mista de Lc. lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris + Listeria monocytogenes ATCC 15313; T3 - Cultura mista de Lc. lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55; e T4 - Cultura mista de Lc. lactis subsp. lactis e Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 + Listeria monocytogenes ATCC 15313. As BAL foram inoculadas (7 log UFC/mL) no creme e a viabilidade dos microorganismos foi avaliada semanalmente durante um período de 28 dias. O creme fermentado apresentou características físico-químicas típicas para o produto, e o tempo de fermentação foi maior nos tratamentos T3 e T4. Foi observada ação de bacteriocinas sobre Listeria monocytogenes quando presente em baixa concentração (≤ 102 UFC/mL). A atividade antioxidante das amostras contendo Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 foi significativamente maior que dos demais tratamentos, assim como a quantidade de ácidos lático e acético. Houve efeito de Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 na conversão de CLA. Tais resultados demonstram o potencial promissor de Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 para o desenvolvimento de alimentos funcionais. Lactic acid bacteria (LAB) are widely used in fermentation processes in the dairy industry, however some of them act not only as starters, with the production of organic acids from the carbohydrates, but they can also produce substances that contribute to the microbiological safety of the fermented product or produce health benefic compounds. In previous in vitro studies, it was found that Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 presents probiotic potential and bacteriostatic action on pathogenic bacteria, such as Listeria monocytogenes and Escherichia coli. In this study it was evaluated the effect of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 in fermented cream, in co-cultivation with other BAL, and to study the physicochemical and microbiological characteristics of the cream, besides evaluating the capacity of bioconservation by the production of bacteriocins, organic acids and functional property by the production of conjugated linoleic acid (CLA) and antioxidant activity through the inhibition of free radicals. UHT milk cream standardized at 20% fat was fermented according to four treatments: T1 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris, T2 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris + Listeria monocytogenes ATCC 15313, T3 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55, and T4 - Mixed culture of Lactococcus lactis subsp. lactis and Lc. lactis subsp. cremoris + Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 + Listeria monocytogenes ATCC 15313. LAB (7 log CFU/mL) were inoculated into the cream and the viability of the microorganisms was evaluated weekly for a period of 28 days. The fermented cream presented typical physicochemical characteristics for the product, and the fermentation time was higher in T3 and T4 treatments. There was a bacteriocin action against Listeria monocytogenes when in low population (≤ 102 CFU/mL). The antioxidant activity of samples containing Ln. mesenteroides was significantly higher than the other treatments, as well as the lactic and acetic acid contents. There was an effect of Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 on the CLA conversion. These results demonstrate promising potential of Ln. mesenteroides subsp. mesenteroides SJRP55 for the development of functional food.

The globalization of trade and lifestyle ensure that the factors responsible for the emergence of diseases are more present than ever. Despite biotechnology advancements, meat-based foods are still under scrutiny because of the presence of pathogens, which causes a loss of consumer confidence and consequently a fall in demand. In this context, Lactic Acid Bacteria (LAB) as GRAS organisms offer an alternative for developing pathogen-free foods, particularly avoiding Listeria monocytogenes, with minimal processing and fewer additives while maintaining the foods? sensorial characteristics. The use of LAB strains, enabling us to produce antimicrobial peptides (bacteriocins) in addition to lactic acid, with an impact on quality and safety during fermentation, processing, and/or storage of meat and ready-to-eat (RTE) meat products, constitutes a promising tool. A number of bacteriocin-based strategies including the use of bioprotective cultures, purified and/or semi-purified bacteriocins as well as their inclusion in varied packaging materials under different storage conditions, have been investigated. The application of bacteriocins as part of hurdle technology using non-thermal technologies was explored for the preservation of RTE meat products. Likewise, considering that food contamination with L. monocytogenes is a consequence of the post-processing manipulation of RTE foods, the role of bacteriocinogenic LAB in the control of biofilms formed on industrial surfaces is also discussed. Fil: Castellano, Patricia Haydee. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; Argentina Fil: Pérez Ibarreche, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; Argentina Fil: Blanco Massani, Mariana Raquel. Instituto Nacional de Tecnología Industrial; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Fontana, Cecilia Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Vignolo, Graciela Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Centro de Referencia para Lactobacilos; Argentina

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen which may survive in biofilms and persist in food processing plants. In this study, the ability of Leuconostoc mesenteroides (bac+ and bac-) to inhibit biofilm formation by L. monocytogenes ATCC 19115 was studied with stainless steel coupons immersed in BHI broth and BHI broth plus sucrose in combination with the Lactic Acid Bacteria (LAB). Adhered cells were collected with swabs and enumerated on selective agars (Oxford for listeria and MRS for leuconostoc). Leuconostoc mesenteroides bac+ in co-culture with L. monocytogenes was effective to inhibit biofilm formation by listeria for up to 3 hours of incubation, but at 24 hours, biofilm was present in all conditions tested, as confirmed by observations of stainless steel coupons under Scanning Electron Microscopy (SEM). It was also observed that in the presence of L. mesenteroides bac+ in BHI plus sucrose, a high number of elongated cells of L. monocytogenes was present, which may indicate an adaptation response of the pathogen to stress conditions with important implications for food safety.

A total of 285 samples of meat and meat products were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by the "sandwich" test. From 174 of these samples, 813 strains of lactic acid bacteria were isolated. They were able to inhibit the growth of Staphylococcus aureus CTC 33 and/or Listeria innocua Lin 11. When evaluated by the well-diffusion assay, 128 of these strains inhibited the growth of the indicator strains. The inhibitory spectra of activity of the isolates were evaluated against a range of Gram-positive and Gram-negative test organisms. S. aureus was the most sensitive indicator tested, whereas Enterococcus faecalis and Lactobacillus plantarum were the most resistant ones. All the compounds produced by the lactic acid bacteria were fully or partially inactivated by some of the proteolytic enzymes, which indicates their proteinaceous nature. The antimicrobial activity of the bacteriocins produced by the lactic acid bacteria isolated in this work could act as a potential barrier to inhibit the growth of spoilage bacteria and foodborne pathogens.Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do "sanduíche". A partir de 174 destas amostras, 813 linhagens de bactérias lácticas com atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus CTC 033 e/ou Listeria innocua Lin 11 foram isoladas. Quando examinadas pelo método de antagonismo simultâneo em poços, 128 destas linhagens inibiram o crescimento dos microrganismos indicadores. O espectro de atividade das linhagens isoladas foi avaliado com diversos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. De um modo geral, S. aureus foi o microrganismo indicador mais sensível, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácticas testadas foram completa ou parcialmente inativados por enzimas proteolíticas, o que indica sua natureza protéica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas linhagens de bactérias lácticas isoladas neste trabalho pode atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias deterioradoras e patogênicas de origem alimentar.

No presente trabalho, foram estudadas as bacteriocinas produzidas por seis linhagens bacterianas: duas culturas Lactobacillus sake, duas de Lactobacillus curvatus, uma de Leuconostoc mesenteroides, uma de Leuconostoc sp 12. As atividades inibitórias foram quantificadas pelo método da diluição crítica, utilizando-se os indicadores Lactobacillus sake ATCC 15521 e Listeria monocytogenes. As bacteriocinas produzidas foram caracterizadas também quanto à sensibilidade a enzimas, faixa de temperatura na produção, termoestabilidade, estabilidade em diferentes pHs e modo de ação (bactericida ou bacteriostático) frente a Listeria monocytogenes. Nenhuma bacteriocina foi destruída pela pepsina, mas todas foram sensíveis à proteinase K, tripsina e alfa-amilase (exceto a bacteriocina produzida por Leuconostoc sp 12, que foi insensível a alfa-amilase). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e Lactobacillus sake 16 apresentaram atividade antilisterial, sendo a maior inibição observada para Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800UA/mL). Lactobacillus sake 1 e Lactobacillus curvatus 5 produziram as bacteriocinas mais termoestáveis. Lactobacillus sake 1 produziu a bacteriocina com maior estabilidade a variações de pH. Todas as bactérias láticas produziram bacteriocina entre 4ºC e 30ºC, sendo esta propriedade muito interessante para futuras aplicações em produtos cárneos refrigerados.In this work, the bacteriocins produced by six bacterial strains were studied (Lactobacillus sake 1, Lactobacillus curvatus 5, Leuconostoc mesenteroides 11, Leuconostoc sp 12, Lactobacillus curvatus 14 and Lactobacillus sake 16). Title of inhibitory activity was determined by critical dilution assay, using Lactobacillus sake ATCC 15521 and Listeria monocytogenes as indicator microorganisms. The inhibitory compounds were also characterized with respect to stability to the action of enzymes, thermostability, stability in several pHs and mode of action (bactericide or bacteriostatic) towards Listeria monocytogenes. No bacteriocin was destroyed by pepsin, but all of them were destroyed by proteinase K, trypsin and alpha-amylase (except that alpha-amylase did not inactivate the bacteriocin produced by Leuconostoc sp 12). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 and Lactobacillus sake 16 exerted antilisterial activity. The more active strains against Listeria monocytogenes were Lactobacillus sake 1 and Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800 AU/ml). Bacteriocins produced by Lactobacillus sake 1 and Lactobacillus curvatus 5 presented the highest thermal stability. The bacteriocin of Lactobacillus sake 1 was the most stable to pH variations. All LAB produced bacteriocin in the range of temperature from 4ºC to 30ºC and this property is of great interest for future applications in refrigerated meat products.

Las bacterias ácido lácticas producen sustancias antimicrobianas que pueden perder su actividad debido a factores extrínsecos. En este estudio se determinaron los efectos de temperatura, pH, tiempo de exposición y enzimas sobre la actividad antimicrobiana del metabolito W10b producido por la bacteria ácido láctica Weissella confusa. W10b es activo contra Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. W. confusa se produjo mediante fermentación a 32°C por 4 horas y el metabolito W10b se obtuvo a partir del sobrenadante libre de células mediante centrifugación, filtración y liofilización. W10b se sometió a pH ácido, neutro y básico, para dos tiempos de exposición (10 y 30 minutos) y diferentes temperaturas (27, 40, 60 y 100°C). Además se midió el efecto de las enzimas pepsina y amiloglucosidasa sobre W10b. Se encontró diferencias significativas (p

Lactic acid bacteria can produce bacteriocins and have been explored for applications as natural preservatives in foods. Bacteriocins are peptides and proteins with antimicrobial activity and can inhibit the growth of pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes and other spoilage microorganisms. L. monocytogenes can be present in many types of food due to its ability to survive in a wide temperature range, and causes listeriosis by ingestion of contaminated food. This study aimed at the isolation and identification of lactic acid bacteria (LAB) with bacteriocinogenic potential, the characterization of the cell-free supernatants (CFS) regarding: the antimicrobial activity; the spectrum of action; thermal stability and at different pHs; resistance to chemicals and NaCl concentrations; the mode of action of the bacteriocins produced; the adsorption capacity to the target cells in different temperatures, pH and concentrations of chemicals and NaCl; perform the molecular identification of the LAB. Three strains (LS1, LS2 and LS3) bacteriocinogenic of raw goat's milk with anti-listeria activity were isolated. In particular Lactococcus lactis (LS2), which produced bacteriostatic, active bacteriocin at low pH and 4 ° C to 80 ° C, which can be an alternative for the control of Listeria in fermented dairy products. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Bactérias láticas podem produzir bacteriocinas e têm sido exploradas em aplicações como conservadores naturais nos alimentos. Bacteriocinas são peptídeos e proteínas com atividade antimicrobiana e podem inibir a multiplicação de bactérias patogênicas como Listeria monocytogenes e micro-organismos deterioradores. L. monocytogenes pode estar presente em diversos tipos de alimentos, devido à sua capacidade de sobreviver em ampla faixa de temperatura e causar a listeriose através da ingestão de alimentos contaminados. Este estudo objetivou o isolamento e identificação de bactérias láticas (BAL) com potencial anti-Listeria de leite de cabra cru, a caracterização dos sobrenadantes livres de células (SLC) quanto: à atividade antimicrobiana; ao espectro de ação; à estabilidade térmica e em diferentes valores de pH; à resistência a agentes químicos e a diferentes concentrações de NaCl; ao modo de ação; à capacidade de adsorção à listeria em diferentes condições de temperatura, pH e na presença de agentes químicos. Também visou realizar a identificação molecular dos isolados a fim de aplicar as BAL ou as bacteriocinas por elas produzidas como estratégia de bioconservação de alimentos. Foram isoladas três culturas (LS1, LS2 e LS3) bacteriocinogênicas de leite de cabra cru com atividade anti-listeria. Em particular Lactococcus lactis (LS2), que produziu bacteriocina bacteriostática, ativa em pH baixo e em temperatura de 4 °C a 80 °C, que pode ser uma alternativa para o controle de listeria em produtos lácteos fermentados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Because of the diversity of its indigenous microbiota, goat milk is considered a good source of new strains of lactic acid bacteria (LAB) with potential for exploitation as alternatives to food biopreservation. The increasing consumer demand for these alternatives justifies studies to investigate the antimicrobial potential of these microorganisms. The present study aimed to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial action range of autochthonous strains of BAL isolated from goat milk that can be potentially used as biopreservatives in food. The bacteriocinogenic activity against Listeria monocytogenes and stability in different environmental conditions were also the target of this study. Fifty-seven isolates of BAL (33 isolates of Enterococcus spp., and 24 isolates of Lactococcus spp.), previously characterized as bacteriocinogenic by genotypic and phenotypic methods, were subjected to macrorestriction with SmaI and PFGE and their profiles were compared with the results of bacteriocinogenic genes previously searched. High genetic diversity was observed for both genders. Although PFGE showed sufficient discriminatory power, isolates with different results for bacteriocinogenic genes were grouped as identical in both genders. Twelve isolates from Lactococcus spp. and eighteen isolates of Enterococcus spp., representing different pulsotypes, were selected for evaluation of the antimicrobial activity range against 46 target microorganisms (including BAL, pathogens and spoilage microorganisms). Lactococcus strains showed a wide spectrum against the targets, especially against L. monocytogenes and Clostridium spp.. Enterococcus spp., similarly, was able to inhibit various targets, acting mainly against Listeria spp. Gram- negative microorganisms also showed sensitivity to isolates of both genders. Six isolates (four Enterococcus spp., and two Lactococcus spp.) were evaluated for bacteriocinogenic potential against L. monocytogenes strains from different serotypes and all of them were inhibited by bacteriocins produced by these LAB. Additionally, bacteriocins produced by these isolates showed a wide range of stability at different pH values and temperatures. The data showed that goat milk can contain a diverse microbiota able to inhibit microorganisms of interest to the food industry and can be potentially employed in biopreservation of foods produced at different processing conditions. O leite de cabra, devido a diversidade de sua microbiota autóctone, é considerado uma boa fonte de novas cepas de Bactérias Ácido Láticas (BAL) com potencial para exploração como alternativas à biopreservação de alimentos. A crescente demanda dos consumidores por essas alternativas justifica estudos que investiguem o potencial antimicrobiano desses micro-organismos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e o espectro de ação de cepas de BAL antagonistas autóctones de leite de cabra que podem ser potencialmente utilizadas como biopreservantes em alimentos. A atividade bacteriocinogênica contra Listeria monocytogenes e estabilidade das bacteriocinas em diferentes condições ambientais também foram alvo deste trabalho. Cinquenta e sete isolados de BAL (33 isolados de Enterococcus spp. e 24 isolados de Lactococcus spp.), previamente caracterizados como bacteriocinogênicos por metodologias genotípicas e fenotípicas, foram submetidos à macrorrestrição com a enzima SmaI e PFGE e seus perfis foram comparados aos resultados de genes bacteriocinogênicos previamente pesquisados. Alta variabilidade genética foi observada para ambos os gêneros. Embora o PFGE tenha apresentado poder discriminatório suficiente, isolados com diferentes resultados para genes de bacteriocinas foram agrupados como idênticos em ambos os gêneros. Doze isolados de Lactococcus spp. e dezoito isolados de Enterococcus spp., representativos de diferentes pulsotipos, foram selecionados para avaliação do espectro de ação antimicrobiana contra 46 micro- organismos indicadores (incluindo BAL, micro-organismos deteriorantes e patógenos). Os isolados de Lactococcus spp. demonstraram amplo espectro de ação sobre os micro-organismos alvo, com destaque para a atividade contra os patógenos L. monocytogenes e Clostridium spp.. Enterococcus spp., de modo similar, foi capaz de inibir diversos micro-organismos alvo, apresentando atividade principalmente contra Listeria spp. Cepas Gram-negativas também apresentaram sensibilidade aos isolados de ambos os gêneros. Seis isolados (quatro Enterococcus spp. e dois Lactococcus spp.) foram avaliados quanto ao potencial bacteriocinogênico contra cepas de L. monocytogenes de diferentes sorotipos e todos os sorotipos foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas pelas BAL. Adicionalmente, as bacteriocinas produzidas por estes isolados apresentaram ampla faixa de estabilidade em diferentes valores de pH e temperaturas. Os dados obtidos demonstraram que o leite de cabra pode conter uma microbiota bacteriocinogênica diversificada, capaz de inibir micro-organismos de interesse à indústria de alimentos, podendo ser potencialmente empregadas na bioconservação de alimentos produzidos em diferentes condições de processamento.

Twenty samples of Brazilian meat and meat products were screened by the agar overlay method for bacteriocin-producing lactic acid bacteria, using Lactobacillus sake ATCC 15521 as indicator strain. Based on Gram staining, KOH reaction, catalase test and fermentation of 49 carbohydrates (API 50 CH), three out of seven isolates with confirmed antagonist properties were identified as Lactobacillus curvatus, one as Leuconostoc mesenteroides and one as Leuconostoc sp. Two isolates could not be properly identified using these tests. The inhibitors produced by these strains were sensitive to proteases. Inhibition due to lytic bacteriophages was ruled out, so the isolates were classified as bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Four of them presented antilisterial activity and a potential application as biopreservatives in meat systems.Vinte amostras de carnes e produtos cárneos brasileiros foram analisadas com a finalidade de se isolar bactérias láticas produtoras de bacteriocina, através do método de antagonismo em ágar, utilizando Lactobacillus sake ATCC 15521 como microrganismo indicador. Baseado na coloração de Gram, reação com KOH, teste de catalase e teste de fermentação de 49 carboidratos (API 50 CH), três das sete cepas com características antagonísticas foram classificadas como Lactobacillus curvatus, uma como Leuconostoc mesenteroides e uma como Leuconostoc sp. Duas cepas não puderam ser identificadas usando apenas estes testes. Os inibidores produzidos por essas cepas mostraram-se sensíveis a proteases. A inibição devido a bacteriófagos líticos foi descartada e assim as culturas foram classificadas como bactérias láticas produtoras de bacteriocina. Quatro cepas apresentaram atividade antilisterial, e conseqüentemente um potencial de utilização como bioconservadores em produtos cárneos.

Blood is a common by-product of the meat industry, which has several potential applications in the animal feed industry. However, since blood is highly susceptible to microbial spoilage, blood and its fractions are often not suitable ingredients for the feed industry. Biopreservation appears as an alternative for the improvement of blood's quality towards its use as an ingredient in foodstuff. The objective of this work was to isolate and identify Lactic Acid Bacteria (LAB) in avian blood obtained from industrial slaughterhouses and evaluate their antimicrobial activity. Ninety-six LAB were isolated from avian blood and genotyped. Eleven Amplified rDNA Restriction Analysis groups were identified. Between two and five different species were detected in each blood sample (31 strains in all blood samples) which were selected to study antagonistic activity. Twenty-eight of them produced antimicrobial compounds such as organic acids, 11 strains produced hydrogen peroxide (H2O2) and two released bacteriocin-like compounds. The latter, identified asLactobacillus salivarius(DSPV 027SA) andEnterococcus faecalis(DSPV 008SA), inhibited the growth ofEscherichia coli, Pseudomonas aeruginosaand some serotypes ofSalmonellaspp.These two LAB strains would be candidates for potential application as a blood biopreservation system. This biotechnological tool is cheaper than others sanitation techniques and could reduce the risk of pathogens transmission thought food chain. &nbsp, La sangre es uno de los residuos más contaminantes de la industria cárnica, y a la vez es tiene diversas aplicaciones en la industria alimenticia animal. No obstante, dado que la sangre es altamente susceptible a la descomposición microbiana, ella y sus fracciones suelen no estar disponibles para su uso como ingredientes en la industria alimenticia. La biopreservación se presenta como una alternativa para mejorar la calidad de la sangre y de esta forma presentarla como un ingrediente en la elaboración de productos alimenticios. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar bacterias ácido lácticas (BAL) a partir de sangre aviar obtenida en mataderos industriales y evaluar su actividad antimicrobiana. Se aislaron 96 colonias presuntivas de BAL a partir de sangre aviar, las cuales fueron genotipificadas. Se estudiaron 31 BAL obtenidas a partir de diferentes muestras de sangre y se identificaron 11 grupos de bacterias diferentes a partir del análisis de restricción del ADN microbiano. De éstas, 28 produjeron compuestos antimicrobianos como ácidos orgánicos, 11 generaron peróxido de hidrógeno (H2O2) y dos fueron productoras de sustancias tipo bacteriocinas. Estas últimas, identificadas comoLactobacillus salivarías(DSPV 027SA) yEnterococcus faecalis(DSPV 008SA), inhibieron el crecimiento deEscherichia coli, Pseudomonas aeruginosay algunos serotipos deSalmonellaspp.De esta forma se lograron identificar dos cepas de BAL como potenciales candidatas para ser aplicadas en un sistema de biopreservación de sangre aviar. Esta herramienta biotecnológica es más económica que otras técnicas de sanitización y reduciría el riesgo de transmisión de microorganismos patógenos a lo largo de la cadena agroalimentaria. &nbsp

Bactérias viáveis adicionadas em produtos cárneos com a finalidade de melhorar a qualidade sanitária, as características sensoriais e reduzir nitritos, são denominadas de cultura iniciadora. Pode ser constituída de cultura pura ou mista com habilidade em produzir substâncias antimicrobianas como ácido lático e bacteriocinas, capazes de inibir microrganismos indesejáveis ao produto alimentício. Neste trabalho, avaliou-se algumas associações entre bactérias láticas, Lactobacillus, Pediococcus e Enterococcus, visando obter culturas láticas com habilidade bioquímica para fermentação homolática; alta viabilidade celular; tolerância ao sais NaCl e NaNO2; capacidade de reduzir nitritos e inibir patógenos como S. aureus; Salmonella spp. e E. coli enteropatogênica. Os cultivos foram desenvolvidos em MRS, incubados a 37ºC por 48 horas. O ácido lático foi determinado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Nitrito residual foi determinado por espectrofotometria. A fermentação homolática com melhor produção de ácido lático (4,61%) e alta viabilidade celular (3 x 10(15) UFC/mL) foi obtida pela cultura constituída de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium . A cultura mista selecionada apresentou alta viabilidade celular (1x10(14) UFC/mL), mesmo em altas concentrações de NaCl e NaNO2. O caldo fermentado apresentou 99% de redução do nitrito inicial. A cultura lática mista selecionada inibiu S. aureus, Salmonella spp. e E. coli em ágar BHI. Em lingüiça frescal, observou-se a diminuição da contagem de S. aureus e coliformes totais em relação ao controle. Salmonella spp. não foi detectada nas amostras testadas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicação da cultura mista selecionada como cultura iniciadora em produtos cárneos.Viable bacteria added in meat products with the objective to improve the quality and the sensorial characteristics and to reduce nitrites are called starter culture. They can be formed by pure or mixed culture that are able to produce antimicrobial substances as lactic acid and bacteriocins and to inhibit undesirable microorganisms in the food product. In this work there were evaluated various associations of lactic bacteria among Lactobacillus, Pediococcus and Enterococcus, in order to obtain lactic cultures with the biochemical ability for homolactic fermentation; high cellular viability; tolerance to the NaCl and NaNO2 salts; able to reduce nitrites and to inhibit pathogens such as S. aureus, Salmonella and E. coli. The cultures were developed in MRS medium, incubated at 37ºC for 48 hours. Lactic acid was determined by HPLC. Residual nitrite was measured by spectrophotometry. The homolactic fermentation with better lactic acid production (4.61%) and higher cellular viability (3x10(15) CFU/mL) were obtained by the culture constituted by L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium. The selected starter showed high cellular viability (1x10(14)CFU/mL), even in high concentrations of NaCl and NaNO2. The fermented broth showed reduction (99%) of initial nitrite. The selected mixed lactic acid culture inhibited S. aureus, Salmonella spp. and E. coli in BHI-agar. In fresh sausage it was observed reductions on counts of S. aureus and total coliforms were observed in fresh sausage, in relation to the controls. Salmonella spp. was not detected in the assayed samples. The results show the possibility of application of the selected mixed culture as starter culture in meat products.

Among the wide range of products naturally fermented by lactic acid bacteria (LAB), there are the homemade cheeses. These bacteria are inherent to the raw milk and the fermentation process for producing compounds responsible for the flavor and texture of the products. Its use is one of the oldest food preservation techniques, since they are able to produce substances with antagonistic action against spoilage and pathogenic microorganisms, particularly Listeria monocytogenes, commonly found in refrigerated dairy products. In addition, many lactic acid bacteria have probiotic potential, thus becoming the most attractive one for its use. In North West Frontier region of Rio Grande do Sul a typical cheese is produced, popularly called colonial cheese, which its knowledge of fabrication techniques have been transferred verbally through generations. For being manufactured, in most cases, with raw milk without the addition of starter cultures and under poor conditions of hygiene, it has a diverse unwanted microbial population. This aspect is characterized as a danger to consumers, as well as spoilage organisms that can also serve as a carrier of pathogenic microorganisms. The objective of this study is to isolate and identify lactic acid bacteria with probiotic characteristics and bacteriocinogenic from milk and artisan cheeses produced in this region. Thus initially the BAL were isolated and tested for antagonist ability against pathogens, and then checked the ability to produce antimicrobial substances of proteinaceous nature (bacteriocins), as well as resistance to biological barriers, as a criteria for the selection of isolated with probiotic potential. Molecular identification was performed by obtaining and sequencing of 16S rDNA or the ITS region. Subsequently, the isolated were evaluated for antimicrobial resistance of clinical use and the production of the enzyme β-hemolysin as virulence factors. The selected isolated were used as inoculum in cheese produced at a pilot level, with monitoring of physical-chemical and microbiological, over twenty-eight days of maturation under refrigeration. Of total lactic acid bacteria isolated twentyone (34.43%) showed antagonistic potential against pathogenic microorganisms reference. Of these, seven (33.33%) were able to produce antimicrobial substances of nature protein, being classified as possibly bacteriocinogenic and five (23.81%) isolated were shown to possess probiotic potential. The molecular identification of these proved to treat Enterococcus durans, Enterococcus faecium and Lactobacillus plantarum. The isolated F9 and U5 were selected and added as bacteriocin and probiotic culture, respectively, as a pilot project in cheese artificially contaminated with Listeria monocytogenes. No isolated was able to remove this pathogenic organism in the cheese, and the cultivation of bacteriocinogenic shown to be capable of maintaining viable cells of the microorganism stable during the maturation period. The probiotic proved to be able to withstand during the ripening of the cheese, while maintaining a viable cell number in the order of 107 - 108UFC.g-1 cheese, which allows its use with probiotic purpose. Dentre a variada gama de produtos fermentados naturalmente por bactérias ácido láticas (BAL) encontram-se os queijos artesanais. Estas bactérias são inerentes da matéria-prima leite e durante o processo fermentativo produzem compostos responsáveis pelo flavor e textura dos produtos. Sua utilização constituise em uma das técnicas mais antigas de conservação de alimentos, já que são capazes de produzir substâncias com caráter antagônico frente a micro-organismos deteriorantes e patogênicos, com destaque a Listeria monocytogenes, comumente encontrada em produtos lácteos refrigerados. Além disso, muitas bactérias ácido láticas possuem potencial probiótico, constituindo-se em um atrativo a mais para sua utilização. Na região Fronteira Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul é produzido um queijo típico, popularmente denominado queijo colonial, cujo conhecimento das técnicas de fabricação tem sido transferido verbalmente ao longo das gerações. Por ser fabricado, na grande maioria dos casos, com leite cru, sem a adição de culturas iniciadoras e sob condições deficientes de higiene, possui uma diversificada população microbiana indesejada. Este aspecto se caracteriza como um perigo aos consumidores, já que além de micro-organismos deteriorantes pode também servir como veículo de micro-organismos patogênicos. Assim, o objetivo do presente estudo foi isolar e identificar bactérias ácido láticas com características bacteriocinogênicas e probióticas, de leite e queijos artesanais desta região. Para isso, inicialmente, as BAL foram isoladas e testadas quanto a sua capacidade antagonista frente a micro-organismos patogênicos e então verificada a capacidade de produção de substâncias antimicrobianas de natureza protéica (bacteriocinas). A resistência a barreiras biológicas, como um dos critérios para seleção de isolados com potencial probiótico também foi avaliado. A identificação molecular dos isolados potencialmente bacteriocinogênicos e probióticos foi realizada por meio da obtenção e sequenciamento do rDNA 16S ou da região ITS. Posteriormente, os isolados foram avaliados quanto à resistência a antimicrobianos de uso clínico e à produção da enzima β-hemolisina, como fatores de virulência. Os isolados selecionados foram utilizados como inoculo em queijos produzidos a nível piloto, com monitoramento de parâmetros físico-químicos e microbiológicos, ao longo de vinte e oito dias de maturação, sob refrigeração. Do total de bactérias láticas isoladas, vinte e uma (34,43%) demonstraram potencial antagonista frente a micro-organismos patogênicos de referência. Destas, sete (33,33%) mostraram-se capazes de produzir substâncias antimicrobianas de natureza proteica, sendo classificadas como, possivelmente, bacteriocinogênicas e cinco (23,81%) dos isolados demonstraram possuir potencial probiótico. A identificação molecular destes revelou se tratarem de Enterococcus durans, Enterococcus faecium e Lactobacillus plantarum. Os isolados F9 e U5 foram selecionados e adicionados como cultura bacteriocinogênica e probiótica, respectivamente, em queijos a nível piloto, artificialmente contaminados com Listeria monocytogenes. Nenhum dos isolados foi capaz de eliminar este microorganismo patogênico nos queijos, porém o cultivo bacteriocinogênico se mostrou capaz de manter as contagens de células viáveis deste micro-organismo estáveis durante o período de maturação. A cultura probiótica se revelou capaz de resistir durante a maturação do queijo, mantendo um número de células viáveis na ordem de 107 - 108UFC.g-1 de queijo, o que permite sua utilização com propósito probiótico.

Blood is a common by-product of the meat industry, which has several potential applications in the animal feed industry. However, since blood is highly susceptible to microbial spoilage, blood and its fractions are often not suitable ingredients for the feed industry. Biopreservation appears as an alternative for the improvement of blood's quality towards its use as an ingredient in foodstuff. The objective of this work was to isolate and identify Lactic Acid Bacteria (LAB) in avian blood obtained from industrial slaughterhouses and evaluate their antimicrobial activity. Ninety-six LAB were isolated from avian blood and genotyped. Eleven Amplified rDNA Restriction Analysis groups were identified. Between two and five different species were detected in each blood sample (31 strains in all blood samples) which were selected to study antagonistic activity. Twenty-eight of them produced antimicrobial compounds such as organic acids, 11 strains produced hydrogen peroxide (H2O2) and two released bacteriocin-like compounds. The latter, identified as Lactobacillus salivarius (DSPV 027SA) and Enterococcus faecalis (DSPV 008SA), inhibited the growth of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and some serotypes of Salmonella spp. These two LAB strains would be candidates for potential application as a blood biopreservation system. This biotechnological tool is cheaper than others sanitation techniques and could reduce the risk of pathogens transmission thought food chain. La sangre es uno de los residuos más contaminantes de la industria cárnica, y a la vez es tiene diversas aplicaciones en la industria alimenticia animal. No obstante, dado que la sangre es altamente susceptible a la descomposición microbiana, ella y sus fracciones suelen no estar disponibles para su uso como ingredientes en la industria alimenticia. La biopreservación se presenta como una alternativa para mejorar la calidad de la sangre y de esta forma presentarla como un ingrediente en la elaboración de productos alimenticios. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar bacterias ácido lácticas (BAL) a partir de sangre aviar obtenida en mataderos industriales y evaluar su actividad antimicrobiana. Se aislaron 96 colonias presuntivas de BAL a partir de sangre aviar, las cuales fueron genotipificadas. Se estudiaron 31 BAL obtenidas a partir de diferentes muestras de sangre y se identificaron 11 grupos de bacterias diferentes a partir del análisis de restricción del ADN microbiano. De éstas, 28 produjeron compuestos antimicrobianos como ácidos orgánicos, 11 generaron peróxido de hidrógeno (H2O2) y dos fueron productoras de sustancias tipo bacteriocinas. Estas últimas, identificadas como Lactobacillus salivarías (DSPV 027SA) y Enterococcus faecalis (DSPV 008SA), inhibieron el crecimiento de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y algunos serotipos de Salmonella spp. De esta forma se lograron identificar dos cepas de BAL como potenciales candidatas para ser aplicadas en un sistema de biopreservación de sangre aviar. Esta herramienta biotecnológica es más económica que otras técnicas de sanitización y reduciría el riesgo de transmisión de microorganismos patógenos a lo largo de la cadena agroalimentaria.

Fil: Cardoso, María de las Mercedes Elisa. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ingeniería Química; Argentina. Las bacterias ácido lácticas, que gozan del status de “Generalmente Reconocidas Como Seguras”, otorgado por la Organización Mundial de la Salud, pueden producir sustancias antimicrobianas de naturaleza proteica, denominadas bacteriocinas, que actúan como bioconservantes alimentarios. Se investigó la capacidad bacteriocinogénica de la cepa de Enterococcus faecalis DBFIQ E24, aislada de leche cruda producida en la región santafesina. Esta cepa fue sensible a vancomicina y carente de capacidad hemolítica. El sobrenadante libre de células de sus cultivos presentó actividad inhibitoria contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, hongos filamentosos y levaduras. Los ensayos enzimáticos demostraron la naturaleza proteica de la sustancia activa, que además resultó ser resistente a altas temperaturas, estable en un extenso rango de pH y a distintos tiempos y temperaturas de almacenamiento. El Peso Molecular aparente del sobrenadante, determinado por ultrafiltración y diálisis, estuvo comprendido entre 1000 y 2000 Dalton, y su título fue de 266 Unidades Arbitrarias por mililitro.El modo de acción de la sustancia inhibitoria fue bactericida y bacteriolítico. Mediante electroforesis en geles de poliacrilamida se determinó el Peso Molecular aproximado, el que resultó estar entre 3.5 y 1.06 kilo Dalton. Se realizó la purificación parcial de la sustancia antimicrobiana aplicando dos protocolos de purificación: 1) Cromatografías de Intercambio catiónico, Fase reversa y Líquida de alta resolución en fase reversa; 2) Precipitación salina con sulfato de amonio, seguida de cromatografías de filtración por geles, intercambio catiónico, fase reversa y líquida de alta resolución en fase reversa. Ambos protocolos presentaron perfiles cromatográficos similares. Lactic acid bacteria, whose present-day status, given by the World Health Organization, is that of “Normally Regarded as Safe”, can produce antimicrobian substances derived from protein, called bacteriocins, which act as food biopreservers. The bacteriocinogenic potential of an Enterococcus faecalis DBFIQ E24 strain was surveyed which was isolated from raw milk yielded in the province of Santa Fe. The strain was sensitive to vancomycin and presented no hemolitic capacity. The culture cell-free supernatant showed inhibitory activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, filamentous fungi and yeast. Enzyme assays confirmed the proteinic nature of the active substance, which also proved to be resistant to high temperature, stable in a wide range of pH and to various storage times and temperatures. The supernatant apparent Molecular Weight, measured through ultrafiltration and dialysis, was somewhere between 1000 and 2000 Dalton, its titer was 266 Arbitrary Units per mililiter. The inhibitory substance presented bactericide and bacteriolytic actions. The approximate Molecular Weight, which was obtained through polyacrylamide gel electrophoresis, was between 3.5 and 1.06 kilo Dalton. An antimicrobial substance partial purification was performed by applying two purification protocols: 1) Cation-exchange, Reversed-phase and Reverse-phase High-performance Liquid chromatographies; 2) Ammonium sulfate saline precipitation followed by gel permeation, Cation-exchange, Reversed-phase and Reverse-phase High-performance Liquid chromatographies. In both protocols, chromatography profiles were similar. Agencia Nacional para la Promoción Científica y Tecnológica Universidad Nacional del Litoral

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Silage is a sort of conserved fodder obtained through the fermentation of forage by lactic bacteria, which convert the soluble carbohydrates in lactic acid. This acid is responsible for reducing the pH of the ensiled mass, inhibiting the growth of deteriorating and pathogenic microorganisms, with no interference in the nutritional features of the ensiled culture. In addition to the lactic acid, the lactic bacteria may produce other antimicrobial compounds, such as the bacteriocins. In the present study, it was isolated 256 cultures of lactic bacteria from Estilosantes Campo Grande, in varied periods of fermentation. Among the 256 isolates obtained, 83% (214) displayed antagonist activity against the indicator microorganism. Among these, only 10% were capable of growing in basal medium. An analysis of the genetic diversity of 20 isolates was done by BOX-PCR. Eight isolates of lactic bacteria which presented high antagonist activity and elevated growth rate were selected and their fermenting profile in 49 carbohydrates sources allowed the identification of theses isolates, such as Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. The analysis of the 16S rDNA showed the same identification. The crude extract of the antimicrobial substance similar to bacteriocin (Blis) of three isolates inhibited the growth of the indicator microorganism, and the antagonist activity was also observed after pH neutralization (pH 7,0) with NaOH. The antagonist activity of the Blis crude extract was lost after the treatment with proteolytic enzymes. These three lactic acid bacteria isolates presented a broad spectrum of antagonist activity, inhibiting several species of different microorganisms. The antimicrobial feature of these isolates observed in this in this work, associated with other growth and fermentation physiological parameters shows that the lactic bacteria cultures isolated in silage from Estilosantes Campo Grande are potential candidates to be evaluated as inoculants in legume silage. A silagem é uma forma de forragem conservada obtida por meio da fermentação da forrageira pelas bactérias lácticas, que convertem os carboidratos solúveis em ácido láctico. Este ácido é responsável por reduzir o pH da massa ensilada, inibindo o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos, sem interferir com as características nutricionais da cultura ensilada. Além do ácido láctico, as bactérias lácticas podem produzir outros compostos antimicrobianos, como as bacteriocinas. Neste estudo, foram isoladas 256 culturas de bactérias lácticas da silagem de Estilosantes Campo Grande, em diferentes períodos de fermentação. Dos 256 isolados de bactérias lácticas obtidos, 83% (214) demonstraram atividade antagonista contra o micro-organismo indicador. Dentre estes, apenas 10% foram capazes de crescer em meio basal. Análise da diversidade genética de 20 isolados foi realizada por BOX-PCR. Oito isolados de bactérias lácticas que apresentaram alta atividade antagonista e elevada velocidade de crescimento foram selecionados e o perfil de fermentação de 49 carboidratos permitiu a identificação desses isolados como Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. A análise do gene 16S rDNA mostrou a mesma identificação. O extrato bruto da substância antimicrobiana semelhante a bacteriocina (Blis) de três isolados de bactérias lácticas inibiu o crescimento do micro-organismo indicador, e a atividade antagonista do extrato também foi observada após a neutralização do pH (pH 7,0) com NaOH. A atividade antagonista do extrato bruto da Blis foi perdida após o tratamento com enzimas proteolíticas. Estes tres isolados de bactérias lácticas demonstraram amplo espectro de atividade antagonista, inibindo várias espécies de micro-organismos diferentes. A característica antimicrobiana destes isolados observada neste trabalho, associada com outros parâmetros fisiológicos de crescimento e fermentação faz com que as culturas de bactérias lácticas isoladas de silagem de Estilosantes Campo Grande sejam candidatos potenciais para serem avaliados como inoculantes em silagens de leguminosas.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Lactic acid bacteria (LAB) occur naturally as indigenous microbiota in raw milk, and play an important role in the microbial ecology of this product due to their antimicrobial activity against spoilage and pathogenic microorganisms, such as Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. Several LAB species were already isolated and identified as producers of some bacteriocins. However, researches should be conducted to optimize the antimicrobial substances production to control the development of foodborne pathogens and spoilage microorganisms. Considering the bacteriocins application viability in the food industry, the aim of this work was to verify the proteinaceus nature and the culture conditions interference on production of antimicrobial substances by Lactic Acid Bacteria (LAB) cultures isolated from raw milk and cheese. The antimicrobial substance produced were characterized for sensibility of different enzymes, for antimicrobial action against Listeria spp., Staphylococcus spp. and LAB cultures, and the effect of eight variations of culture media (MRS, modified MRS - mMRS, M17, and BHI, added or not with cistein solution) and eight combinations of time and temperature of incubation (25 and 35 °C for 12, 24, 48 and 72h) were evaluated. The antimicrobial substances produced by 80 LAB cultures presented a proteinaceous nature, indicating the bacteriocin production. Lactococcus spp. was the genera with better antimicrobial activity and Listeria spp. was the most sensitive genera. The culture media MRS and mMRS and the incubation conditions of 25 °C for 24h, and to 35 °C for 12h presented better antimicrobial activity performance. Considering the obtained results, it was possible to understand some important aspects in relation to the bacteriocin production by some genera of LAB, leading further studies to their future application in dairy products. Bactérias ácido láticas (BAL) são constituintes naturais da microbiota do leite cru, exercendo importante papel na segurança alimentar, devido ação antimicrobiana sobre microrganismos deteriorantes e patógenos, como Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. Várias espécies de BAL já foram isoladas e identificadas como produtoras de diversas bacteriocinas. Porém, pesquisas devem ser conduzidas a fim de otimizar a utilização e a produção dessas substâncias antimicrobianas, visando o controle de patógenos e deteriorantes. Considerando a viabilidade de aplicação das bacteriocinas em indústrias de alimentos, este trabalho teve como objetivo verificar a natureza protéica e a interferência de condições de incubação na produção de substâncias antimicrobianas por isolados de Bactérias Ácido Láticas (BAL) de leite cru e queijo. As substâncias antimicrobianas produzidas foram caracterizadas quanto à sensibilidade enzimática, atividade antimicrobiana contra diferentes cepas de Listeria spp., Staphylococcus spp. e BAL, e avaliadas quanto à interferência de oito variações de meios de cultura (MRS, MRS modificado - MRSm, M17, e BHI, adicionados ou não de solução de cisteína) e oito combinações de tempo e temperatura de incubação (25 e 35 °C por 12, 24, 48 e 72h). As substâncias antimicrobianas produzidas por 80 isolados de BAL apresentaram natureza protéica, as caracterizando como bacteriocinas. Lactococcus spp. foi o gênero que apresentou melhor desempenho de atividade antimicrobiana e Listeria spp. foi o gênero mais sensível. Os meios de cultura MRS e MRSm e a combinação de 25 °C por 24h, e a 35 °C por 12h de incubação, foram as condições que apresentaram melhor performance de atividade antimicrobiana. Assim, foi possível conhecer alguns aspectos relevantes em relação à produção de bacteriocinas por alguns gêneros de BAL, direcionando estudos complementares para sua futura aplicação em produtos lácteos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Considering the importance of the lactic acid bacteria (LAB) as biopreservatives, and their inhibitory potencial against pathogens and spoilage microrganisms, the aim of this study was identify using molecular methodologies LAB isolates obtained from raw milk and soft cheese, and to conduct a detailed study about the presence of bacteriocin codifying genes. There were utilized 101 LAB isolates previously characterized as antagonist against Listeria monocytogenes. All LAB were submitted to 16S rDNA sequencing. Considering identified genera, specific bacteriocin codifying genes were analised. Based on their antimicrobial activity and presence of nisin genes, 10 Lactococcus spp. isolates were selected and submitted to nisin codifying gene sequencing and translation, for further comparison of predicted proteins. Enterococcus spp. were submitted to phenotipic evaluation of pathogenicity factors. Considering the 16S rDNA sequencing, the most frequent genera obtained were Enterococcus, Lactococcus e Lactobacillus. Most of the analysed isolates (80%) presented at least one bacteriocin codifying gene, being the lantibiothics the most frequent, followed by nisin and enterocin P. Concerning the translated sequences of nisin codifying gene, two variations were observed: substitution of histidine for asparagine (position 27) in two cultures, typical of nisin Z variation, and the substitution of an histidine for threonine (position 31) in three cultures, a nisin variation not described until now. Concerning the Enterococcus spp. pathogenicity factors, only incomplete haemolysis in horse blood agar and gelatinase production were observed in 23 e 11 isolates, respectively. In conclusion, the evaluated cultures presented great potential to be used as biopreservatives in food, specially the genera Lactococcus wich carry the nisin variants codifying genes not described yet in the literature. Considerando a importância das bactérias ácido láticas (BAL) como bioconservantes, devido a seu potencial inibidor de patógenos e microrganismos deteriorantes, o objetivo deste trabalho foi identificar por metodologias moleculares isolados desse grupo obtidos de leite cru e queijo frescal, e realizar um estudo detalhado quanto a presença de diversos genes de bacteriocinas. Foram utilizados 101 isolados de BAL previamente caracterizados como antagonistas contra Listeria monocytogenes. Todas as BAL foram submetidas à sequenciamento do gene 16S rDNA para identificação. Considerando os resultados obtidos, genes de bacteriocinas produzidas pelos diferentes gêneros identificados foram pesquisados. Alguns isolados identificados como Lactococcus spp. (10) foram selecionados considerando os resultados de atividade antimicrobiana e apresença de genes de nisina, e submetidos ao seqüenciamento e tradução desses genes para comparação as demais sequencias traduzidas. Os isolados do gênero Enterococcus spp. foram submetidos à ànalises fenotípicas de alguns fatores de patogenicidade. Considerando os resultados obtidos, os gêneros identificados foram principalmente Enterococcus, Lactococcus e Lactobacillus. Grande parte dos isolados (80%) apresentou genes para produção de ao menos uma bacteriocina, sendo mais comuns resultados positivos para lantibióticos, e especificamente para nisina e enterocina P. Na análise das seqüências traduzidas de nisina, foram observadas duas variações: substituição da histidina por asparagina (posição 27) em dois isolados (alteração típica da nisina Z), e substituição da histidina por uma treonina (posição 31) em três isolados (variação ainda não descrita). Quanto aos fatores de patogenicidade de Enterococcus spp., apenas hemólise incompleta em ágar sangue de cavalo e produção de gelatinase foram observadas em 23 e 11 isolados, respectivamente. Considerando os resultados obtidos, os isolados avaliados apresentam grande potencial como bioconservadores em alimentos, especialmente os isolados do gênero Lactococcus carreadores de genes responsáveis por produção de variantes da nisina não descritos na literatura.

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen which may survive in biofilms and persist in food processing plants. In this study, the ability of Leuconostoc mesenteroides (bac+ and bac-) to inhibit biofilm formation by L. monocytogenes ATCC 19115 was studied with stainless steel coupons immersed in BHI broth and BHI broth plus sucrose in combination with the Lactic Acid Bacteria (LAB). Adhered cells were collected with swabs and enumerated on selective agars (Oxford for listeria and MRS for leuconostoc). Leuconostoc mesenteroides bac+ in co-culture with L. monocytogenes was effective to inhibit biofilm formation by listeria for up to 3 hours of incubation, but at 24 hours, biofilm was present in all conditions tested, as confirmed by observations of stainless steel coupons under Scanning Electron Microscopy (SEM). It was also observed that in the presence of L. mesenteroides bac+ in BHI plus sucrose, a high number of elongated cells of L. monocytogenes was present, which may indicate an adaptation response of the pathogen to stress conditions with important implications for food safety. Listeria monocytogenes é um patógeno transmitido por alimentos que apresenta a capacidade de sobreviver em biofilmes e persistir em plantas de processamento de alimentos. O presente trabalho avaliou a habilidade de Leuconostoc mesenteroides (bac+ e bac-) de inibir a formação de biofilme por L. monocytogenes ATCC 19115 em lâminas de aço inoxidável imersas em caldo BHI com ou sem sacarose em combinação com bactérias láticas (BAL). As células aderidas nas lâminas foram coletadas com swabs e enumeradas em meios seletivos (Oxford para listeria e MRS para leuconostoc). Leuconostoc mesenteroides bac+ foi efetivo na inibição da formação de biofilme por L. monocytogenes por até 3 horas de incubação. Entretanto, após 24 horas de incubação, foi verificada a formação de biofilme em todas as condições testadas, conforme evidenciado pelas imagens obtidas por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Adicionalmente, foi observado um elevado número de células de L. monocytogenes alongadas na presença de L. mesenteroides bac+ em BHI adicionado de sacarose, indicando uma resposta de adaptação do patógeno às condições de estresse, com importantes implicações para a segurança alimentar.

Objetivo. Caracterizar los metabolitos producidos por bacterias ácido lácticas nativas con capacidad antilisterial. Materiales y métodos. Se analizaron 42 muestras tomadas de alimentos y equipos procesadores de alimentos, de donde se aislaron bacterias ácido lácticas, las cuales se identificaron por medio de pruebas bioquímicas. Se evaluó la actividad antagónica de las cepas aisladas frente a 17 cepas de L. monocytogenes pertenecientes a los serotipos 4b, 4e, y 3b utilizando la técnica de la gota y doble capa. Se obtuvieron extractos crudos para la caracterización de los metabolitos inhibitorios del crecimiento de las cepas de L. monocytogenes, los cuales fueron tratados con catalasa, ácido clorhídrico, proteinasa K y temperaturas de 95ºC y 121ºC. El peso molecular de las proteínas se aproximó utilizando la técnica de electroforesis SDS-PAGE y bioensayos. Resultados. De un total de 250 aislamientos se lograron identificar 75 cepas de bacterias ácido lácticas. La evaluación de la actividad antagónica indicó que los metabolitos inhibitorios producidos por las bacterias ácido lácticas no actuaban de igual manera frente a las diferentes cepas de L. monocytogenes. Sin embargo, se encontró que tres de los aislamientos nativos identificados como Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. y Enterococcus spp. presentaban una mejor actividad antilisterial debido a que sintetizan proteínas o metabolitos de peso molecular menor a 7600 Da. Conclusiones. En los alimentos distribuidos en Colombia existen cepas de bacterias ácido lácticas con potencial bioprotector.

Objetivo. Caracterizar los metabolitos producidos por bacterias ácido lácticas nativas con capacidad antilisterial. Materiales y métodos. Se analizaron 42 muestras tomadas de alimentos y equipos procesadores de alimentos, de donde se aislaron bacterias ácido lácticas, las cuales se identificaron por medio de pruebas bioquímicas. Se evaluó la actividad antagónica de las cepas aisladas frente a 17 cepas de L. monocytogenes pertenecientes a los serotipos 4b, 4e, y 3b utilizando la técnica de la gota y doble capa. Se obtuvieron extractos crudos para la caracterización de los metabolitos inhibitorios del crecimiento de las cepas de L. monocytogenes, los cuales fueron tratados con catalasa, ácido clorhídrico, proteinasa K y temperaturas de 95°C y 121°C. El peso molecular de las proteínas se aproximó utilizando la técnica de electroforesis SDS-PAGE y bioensayos. Resultados. De un total de 250 aislamientos se lograron identificar 75 cepas de bacterias ácido lácticas. La evaluación de la actividad antagónica indicó que los metabolitos inhibitorios producidos por las bacterias ácido lácticas no actuaban de igual manera frente a las diferentes cepas de L. monocytogenes. Sin embargo, se encontró que tres de los aislamientos nativos identificados como Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. y Enterococcus spp. presentaban una mejor actividad antilisterial debido a que sintetizan proteínas o metabolitos de peso molecular menor a 7600 Da. Conclusiones. En los alimentos distribuidos en Colombia existen cepas de bacterias ácido lácticas con potencial bioprotector. Objective. Characterization of antilisterial compounds produced by native lactic acid bacteria. Materials and methods. Lactic acid bacteria (LAB) were isolated from 42 samples collected from foods and food processing equipment. Identification of LAB species was assessed by biochemical reactions. The antilisterial activities of the isolates were tested against 17 L. monocytogenes strains belonging to 4b, 4e and 3b serotypes, by the agar differed spot on the lawn technique. Crude extracts were subjected to catalase, proteinase K, hydrochloric acid and high temperature (95°C and 121°C) treatments in order to characterize the antilisterial compounds. The molecular weights were estimated by SDS-PAGE and bioassays were performed. Results. Seventy five strains were identified out of 250 lactic acid bacteria isolates. The inhibitory compounds produced by LAB displayed dissimilar activities against the different L. monocytogenes strains. Furthermore, three native isolates identified as Lactobacillus spp., Leuconostoc spp. and Enterococcus spp. showed improved antilisterial effect due to the production of compounds with molecular weight below 7600 Da. Conclusions. We demonstrated the presence of native lactic acid bacteria with potential as biocontrolers in foods distributed in Colombia.

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Izildinha Moreno Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A biopreservação é uma técnica utilizada para estender a vida útil e aumentar a segurança dos alimentos por meio do emprego de microbiota protetora e/ou seus peptídeos antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de culturas produtoras de bacteriocinas sobre alguns patógenos Gram-positivos de ocorrência comum em produtos lácteos. As culturas bacteriocinogênicas Lactococcus lactis subsp. Lactis ATCC 11454, Lactobacillus plantarum ALC 01 e Enterococcus faecium FAIR-E 198 apresentaram comportamento distinto em relação à produção de bacteriocinas quando inoculadas em caldo MRS e em leite desnatado reconstituído (LDR) a 10%. Na avaliação do espectro de ação antimicrobiano pelo método de difusão em ágar por inoculação em poços, as bacteriocinas produzidas por Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 apresentaram atividade inibitória apenas sobre as linhagens de Listeria monocytogenes, já a nisina produzida por Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 demonstrou espectro de ação mais amplo, porém com menor atividade que as demais culturas bacteriocinogênicas. Na avaliação da compatibilidade de desenvolvimento associativo com fermentos lácticos comerciais, somente Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 apresentou atividade (halo de 6mm) sobre as linhagens constituintes de ambos os fermentos lácticos avaliados. A determinação da atividade acidificante foi realizada em LDR 10% após 8 e 24h de incubação a 35ºC; a adição de 0,1% e de 0,5% das culturas bacteriocinogênicas não afetou significativamente a capacidade de acidificação dos fermentos lácticos. Além disso, observou-se que o desenvolvimento associativo dos fermentos lácticos com Lb. Plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198, em ambas as concentrações, proporcionou significativo aumento da atividade das bacteriocinas destas culturas, enquanto que a atividade da nisina de Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 foi suprimida. A atividade de aminopeptidases foi determinada após desenvolvimento das culturas lácticas em caldo MRS, Lb. Plantarum ALC 01 apresentou as maiores atividades. Também foi analisado o comportamento de patógenos Gram-positivos durante desenvolvimento associativo com as culturas produtoras de bacteriocinas e fermento láctico em LDR 10% a 35ºC por 48h. Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 não influenciaram significativamente o desenvolvimento de Bacillus cereus K1-B041 e de Staphylococcus aureus ATCC 27154 durante as primeiras 24h de incubação a 35ºC, contudo apresentaram forte ação inibitória sobre L monocytogenes Scott A. Já Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 afetou o desenvolvimento de todos os patógenos apenas durante as primeiras 12h de incubação. O fermento láctico demonstrou significativa ação inibitória sobre B. cereus K1-B041 (>7,37 log UFC/ml) e L monocytogenes Scott A (>6,26 log UFC/ml). Em queijo Minas Frescal, não foi observada diferença significativa entre a ação das culturas bacteriocinogênicas e o fermento láctico sobre L. monocytogenes Scott A e S. aureus ATCC 27154. B. cereus K1-B041 demonstrou susceptibilidade a Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 após 7 dias. Pelo método de diluição crítica não foi detectada atividade de bacteriocina nos queijos durante os 21 dias de estocagem a 8 ± 1ºC. A adição das culturas produtoras de bacteriocinas como adjuntas ao queijo Minas Frescal não promoveu alteração no pH e na acidez, contudo Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 promoveram aumento da proteólise primária e secundária. Embora os resultados obtidos demonstrem que as culturas bacteriocinogênicas avaliadas não possam ser empregadas como único método de conservação, estas podem atuar em sinergia com outros fatores para aumentar a eficiência no controle de patógenos Gram-positivos, especialmente L. monocytogenes, em produtos lácteos fermentados Abstract: The biopreservation system, such as bacteriocinogenic lactic bacteria cultures and/or their bacteriocins, have received increasing attention and new approaches to control pathogenic and spoilage microorganisms have been developed. The purpose of this study was to evaluate the action of bacteriocin-producing cultures (Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, Lactobacillus plantarum ALC 01 and Enterococcus faecium FAIR-E 198) on some Gram-positive pathogens in different culture media and dairy products. The bacteriocin production was influenced by the media. The antimicrobial activity of these cultures was evaluated by agar-well diffusion assay. The bacteriocins produced by Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 presented inhibitory activity on Listeria monocytogenes alone, on the other hand, the nisin produced by Lc. lactis subsp. Lactis ATCC 11454 demonstrated wide action spectrum, albeit with lower activity. In compatibility of associative development evaluation with the commercial starter culture, only Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 presented activity on the starter culture. The acidifier activity determination was carried out in skimmed milk after 8h and 24h of incubation at 35ºC. The addition of 0.1% and 0.5% of the bacteriocinogenic cultures did not affect the production of lactic acid by the starter culture. The associative development of the starter culture with Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 provided significant increase in bacteriocin activity of these cultures, while the activity of Lc. Lactis subsp. lactis ATCC 11454 nisin was suppressed. The aminopeptidase activity was determined after cellular lise of the lactic cultures previously grown in MRS broth. Lb plantarum ALC 01 presented the largest activity. Moreover, the behavior of Gram-positive pathogens was analyzed during co-culture with the bacteriocin-producing bacteria and with the starter culture in skimmed milk. Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 did not influence the development of Bacillus cereus K1-B041 and of Staphylococcus aureus ATCC 27154 during the first 24h of incubation at 35ºC. They presented strong inhibition on L. monocytogenes Scott A. Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 affected the development of the pathogens studied during the first 12h of incubation. The starter culture demonstrated good inhibition of B. cereus K1-B041 (>7.37 log UFC/ml) and L monocytogenes Scott A (>6.26 log UFC/ml). In Minas Frescal cheese, significant difference was not observed between the action of the bacteriocinogenic cultures and the starter culture on L. monocytogenes Scott A and S. aureus ATCC 27154. B. cereus K1- B041 demonstrated susceptibility to Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 after 7 days. Bacteriocin activity was not detected in the cheeses during 21 days at 8 ± 1ºC. The addition of the bacteriocin-producing bacteria as an adjunct culture to the Minas Frescal cheese did not promote alteration in the pH and in the acidity, however Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 promoted an increase of the cheese proteolysis. Although the obtained results demonstrated that bacteriocinogenic cultures cannot be used as only method of conservation, these can be used as an additional barrier to optimize the control of Gram-positive pathogens, especially L. monocytogenes, in dairy products Doutorado Doutor em Tecnologia de Alimentos

A total of 285 samples of meat and meat products were evaluated for the presence of bacteriocin-producing lactic acid bacteria by the "sandwich" test. From 174 of these samples, 813 strains of lactic acid bacteria were isolated. They were able to inhibit the growth of Staphylococcus aureus CTC 33 and/or Listeria innocua Lin 11. When evaluated by the well-diffusion assay, 128 of these strains inhibited the growth of the indicator strains. The inhibitory spectra of activity of the isolates were evaluated against a range of Gram-positive and Gram-negative test organisms. S. aureus was the most sensitive indicator tested, whereas Enterococcus faecalis and Lactobacillus plantarum were the most resistant ones. All the compounds produced by the lactic acid bacteria were fully or partially inactivated by some of the proteolytic enzymes, which indicates their proteinaceous nature. The antimicrobial activity of the bacteriocins produced by the lactic acid bacteria isolated in this work could act as a potential barrier to inhibit the growth of spoilage bacteria and foodborne pathogens. Um total de 285 amostras de carnes e produtos cárneos foi avaliado para detecção de culturas produtoras de bacteriocinas pelo método do "sanduíche". A partir de 174 destas amostras, 813 linhagens de bactérias lácticas com atividade inibitória sobre Staphylococcus aureus CTC 033 e/ou Listeria innocua Lin 11 foram isoladas. Quando examinadas pelo método de antagonismo simultâneo em poços, 128 destas linhagens inibiram o crescimento dos microrganismos indicadores. O espectro de atividade das linhagens isoladas foi avaliado com diversos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. De um modo geral, S. aureus foi o microrganismo indicador mais sensível, enquanto Enterococcus faecalis e Lactobacillus plantarum foram os mais resistentes. Todos os compostos antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácticas testadas foram completa ou parcialmente inativados por enzimas proteolíticas, o que indica sua natureza protéica. A atividade antimicrobiana das bacteriocinas produzidas pelas linhagens de bactérias lácticas isoladas neste trabalho pode atuar como uma barreira potencial para inibir o crescimento de bactérias deterioradoras e patogênicas de origem alimentar.

No presente trabalho, foram estudadas as bacteriocinas produzidas por seis linhagens bacterianas: duas culturas Lactobacillus sake, duas de Lactobacillus curvatus, uma de Leuconostoc mesenteroides, uma de Leuconostoc sp 12. As atividades inibitórias foram quantificadas pelo método da diluição crítica, utilizando-se os indicadores Lactobacillus sake ATCC 15521 e Listeria monocytogenes. As bacteriocinas produzidas foram caracterizadas também quanto à sensibilidade a enzimas, faixa de temperatura na produção, termoestabilidade, estabilidade em diferentes pHs e modo de ação (bactericida ou bacteriostático) frente a Listeria monocytogenes. Nenhuma bacteriocina foi destruída pela pepsina, mas todas foram sensíveis à proteinase K, tripsina e alfa-amilase (exceto a bacteriocina produzida por Leuconostoc sp 12, que foi insensível a alfa-amilase). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 e Lactobacillus sake 16 apresentaram atividade antilisterial, sendo a maior inibição observada para Lactobacillus sake 1 e Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800UA/mL). Lactobacillus sake 1 e Lactobacillus curvatus 5 produziram as bacteriocinas mais termoestáveis. Lactobacillus sake 1 produziu a bacteriocina com maior estabilidade a variações de pH. Todas as bactérias láticas produziram bacteriocina entre 4ºC e 30ºC, sendo esta propriedade muito interessante para futuras aplicações em produtos cárneos refrigerados. In this work, the bacteriocins produced by six bacterial strains were studied (Lactobacillus sake 1, Lactobacillus curvatus 5, Leuconostoc mesenteroides 11, Leuconostoc sp 12, Lactobacillus curvatus 14 and Lactobacillus sake 16). Title of inhibitory activity was determined by critical dilution assay, using Lactobacillus sake ATCC 15521 and Listeria monocytogenes as indicator microorganisms. The inhibitory compounds were also characterized with respect to stability to the action of enzymes, thermostability, stability in several pHs and mode of action (bactericide or bacteriostatic) towards Listeria monocytogenes. No bacteriocin was destroyed by pepsin, but all of them were destroyed by proteinase K, trypsin and alpha-amylase (except that alpha-amylase did not inactivate the bacteriocin produced by Leuconostoc sp 12). Lactobacillus sake 1, Leuconostoc mesenteroides 11 and Lactobacillus sake 16 exerted antilisterial activity. The more active strains against Listeria monocytogenes were Lactobacillus sake 1 and Leuconostoc mesenteroides 11 (12.800 AU/ml). Bacteriocins produced by Lactobacillus sake 1 and Lactobacillus curvatus 5 presented the highest thermal stability. The bacteriocin of Lactobacillus sake 1 was the most stable to pH variations. All LAB produced bacteriocin in the range of temperature from 4ºC to 30ºC and this property is of great interest for future applications in refrigerated meat products.

Twenty samples of Brazilian meat and meat products were screened by the agar overlay method for bacteriocin-producing lactic acid bacteria, using Lactobacillus sake ATCC 15521 as indicator strain. Based on Gram staining, KOH reaction, catalase test and fermentation of 49 carbohydrates (API 50 CH), three out of seven isolates with confirmed antagonist properties were identified as Lactobacillus curvatus, one as Leuconostoc mesenteroides and one as Leuconostoc sp. Two isolates could not be properly identified using these tests. The inhibitors produced by these strains were sensitive to proteases. Inhibition due to lytic bacteriophages was ruled out, so the isolates were classified as bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Four of them presented antilisterial activity and a potential application as biopreservatives in meat systems. Vinte amostras de carnes e produtos cárneos brasileiros foram analisadas com a finalidade de se isolar bactérias láticas produtoras de bacteriocina, através do método de antagonismo em ágar, utilizando Lactobacillus sake ATCC 15521 como microrganismo indicador. Baseado na coloração de Gram, reação com KOH, teste de catalase e teste de fermentação de 49 carboidratos (API 50 CH), três das sete cepas com características antagonísticas foram classificadas como Lactobacillus curvatus, uma como Leuconostoc mesenteroides e uma como Leuconostoc sp. Duas cepas não puderam ser identificadas usando apenas estes testes. Os inibidores produzidos por essas cepas mostraram-se sensíveis a proteases. A inibição devido a bacteriófagos líticos foi descartada e assim as culturas foram classificadas como bactérias láticas produtoras de bacteriocina. Quatro cepas apresentaram atividade antilisterial, e conseqüentemente um potencial de utilização como bioconservadores em produtos cárneos.

Bactérias viáveis adicionadas em produtos cárneos com a finalidade de melhorar a qualidade sanitária, as características sensoriais e reduzir nitritos, são denominadas de cultura iniciadora. Pode ser constituída de cultura pura ou mista com habilidade em produzir substâncias antimicrobianas como ácido lático e bacteriocinas, capazes de inibir microrganismos indesejáveis ao produto alimentício. Neste trabalho, avaliou-se algumas associações entre bactérias láticas, Lactobacillus, Pediococcus e Enterococcus, visando obter culturas láticas com habilidade bioquímica para fermentação homolática; alta viabilidade celular; tolerância ao sais NaCl e NaNO2; capacidade de reduzir nitritos e inibir patógenos como S. aureus; Salmonella spp. e E. coli enteropatogênica. Os cultivos foram desenvolvidos em MRS, incubados a 37ºC por 48 horas. O ácido lático foi determinado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Nitrito residual foi determinado por espectrofotometria. A fermentação homolática com melhor produção de ácido lático (4,61%) e alta viabilidade celular (3 x 10(15) UFC/mL) foi obtida pela cultura constituída de L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium . A cultura mista selecionada apresentou alta viabilidade celular (1x10(14) UFC/mL), mesmo em altas concentrações de NaCl e NaNO2. O caldo fermentado apresentou 99% de redução do nitrito inicial. A cultura lática mista selecionada inibiu S. aureus, Salmonella spp. e E. coli em ágar BHI. Em lingüiça frescal, observou-se a diminuição da contagem de S. aureus e coliformes totais em relação ao controle. Salmonella spp. não foi detectada nas amostras testadas. Os resultados mostram a possibilidade de aplicação da cultura mista selecionada como cultura iniciadora em produtos cárneos. Viable bacteria added in meat products with the objective to improve the quality and the sensorial characteristics and to reduce nitrites are called starter culture. They can be formed by pure or mixed culture that are able to produce antimicrobial substances as lactic acid and bacteriocins and to inhibit undesirable microorganisms in the food product. In this work there were evaluated various associations of lactic bacteria among Lactobacillus, Pediococcus and Enterococcus, in order to obtain lactic cultures with the biochemical ability for homolactic fermentation; high cellular viability; tolerance to the NaCl and NaNO2 salts; able to reduce nitrites and to inhibit pathogens such as S. aureus, Salmonella and E. coli. The cultures were developed in MRS medium, incubated at 37ºC for 48 hours. Lactic acid was determined by HPLC. Residual nitrite was measured by spectrophotometry. The homolactic fermentation with better lactic acid production (4.61%) and higher cellular viability (3x10(15) CFU/mL) were obtained by the culture constituted by L. curvatus, L. plantarum, P. acidilactici e E. faecium. The selected starter showed high cellular viability (1x10(14)CFU/mL), even in high concentrations of NaCl and NaNO2. The fermented broth showed reduction (99%) of initial nitrite. The selected mixed lactic acid culture inhibited S. aureus, Salmonella spp. and E. coli in BHI-agar. In fresh sausage it was observed reductions on counts of S. aureus and total coliforms were observed in fresh sausage, in relation to the controls. Salmonella spp. was not detected in the assayed samples. The results show the possibility of application of the selected mixed culture as starter culture in meat products.

Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar […]. O presente trabalho teve como objectivo a selecção de estirpes BAL previamente isoladas do queijo do Pico (DOP), avaliando a actividade antimicrobiana e a sua eficácia contra a Listeria monocytogenes no queijo fresco. As propriedades tecnológicas e segurança das BAL produtoras de bacteriocinas foram igualmente investigadas para avaliar a capacidade para serem utilizadas como culturas de arranque e/ou adjuntas no fabrico do queijo. Os isolados foram caracterizados pelas suas propriedades tecnológicas: produção de diacetilo, actividades enzimáticas, proteólise e lipólise. A sua segurança foi avaliada através do estudo da actividade β-hemolítica, produção de DNase, gelatinase e histamina, e resistência aos antibióticos. Foi testada a produção de bacteriocinas pelas BAL, bem como a cinética de crescimento, pH e produção de ácido láctico no queijo fresco. Nestes queijos inoculados com as BAL produtoras de bacteriocinas, foi ainda realizada uma avaliação sensorial por um painel de provadores não treinados. […]. ABSTRACT: […]. The purpose of this study was to select LAB strains with antimicrobial activity, previously isolated from Pico cheese, and evaluate their efficacy against Listeria monocytogenes in fresh cheese. In addition, the technological and safety relevant properties from bacteriocin-producing LAB were investigated in order to determine their ability for the efficient use as starter/adjunct cultures in cheese making. Isolates were characterised in terms of their main technological properties: diacetyl production, enzymatic activities, proteolysis and lipolysis. Their safety was also evaluated by studying their β-haemolytic activity, production of DNase, gelatinase and histamine, and antibiotic resistance. Bacteriocin production by LAB was tested in fresh cheese, including LAB growth kinetics, cheese pH and titratable acidity. Additionally, the sensorial attributes of fresh cheeses made with these LAB as adjunct cultures were evaluated by a non-trained panel. […].