Search

Bolest suhog oka je multifaktorijalna bolest površine oka čije su glavne značajke nestabilnost i hiperosmolarnost suznog filma, što uzrokuje upalu i oštećenje površine oka [1]. Kationske U/V nanoemulzije važan su formulacijski pristup za unaprjeđenje liječenja suhog oka jer mogu uklopljenom lijeku produljiti vrijeme zadržavanja na površini oka te osigurati uklanjanje simptoma uz smanjenu učestalost doziranja [2]. Ibuprofen je izabran kao modelni nesteroidni protuupalni lijek koji djeluje na upalnu komponentu bolesti. Cilj istraživanja bio je razvoj funkcionalne kationske nanoemulzije za liječenje bolesti suhog oka specifično dizajnirane s obzirom na fizičko-kemijska svojstva koja određuju biokompatibilnost, bioadhezivnost, oslobađanje lijeka i stabilnost. Kationske nanoemulzije s ibuprofenom izrađene su koristeći mikrofluidizator. Kao nositelj pozitivnog naboja korišten je kitozan niske molekulske mase. Od ostalih pomoćnih tvari korišteni su Miglyol 812, lecitin S45 i Cremophor® EL. Lecitin S45 izabran je kao surfaktant jer, osim što su njegove sastavnice prirodno prisutne u suznom filmu, sadrži i negativno nabijene slobodne masne kiseline te omogućuje uklapanje kitozana u nanoemulzije. Cremophor® EL izabran je kao oftalmički prihvatljiv sekundarni, neionogeni surfaktant jer dodatno stabilizira nanoemulziju. Određena je veličina kapljica, indeks polidisperznosti (PDI) i zeta-potencijal te osmolarnost, pH, viskoznost i površinska napetost nanoemulzija. Ispitana je i uspješnost uklapanja lijeka, in vitro oslobađanje te stabilnost. Mukoadhezivnost je ispitana reološkom metodom, a biokompatibilnost koristeći in vitro stanični model humanog epitela rožnice [3] te ex vivo model rožnice svinje. Veličina kapljica kitozanskih nanoemulzija iznosila je 175, 1 – 208, 4 nm (PDI 0, 127 – 0, 356), a zeta-potencijal 24, 6 – 37, 0 mV. Utvrđena je biokompatibilnost i mukoadhezivnost kitozanskih nanoemulzija. [1] J.P. Craig, K.K. Nichols, E.K. Akpek, B. Caffery, H.S. Dua, C.K. Joo, Z.Liu, J.D. Nelson, J.J. Nichols, K. Tsubota, F. Stapleton. TFOS DEWS II Definition and Classification Report. Ocul Surf 15 (2017) 276-83. [2] L. Gan, J. Wang, M. Jiang, H. Bartlett, D. Ouyang, F. Eperjesi, J. Liu, Y. Gan. Recent advances in topical ophthalmic drug delivery with lipid-based nanocarriers. Drug Discov Today 18 (2013) 290-7. [3] M. Juretić, B. Jurišić Dukovski, I. Krtalić, S. Reichl, B. Cetina-Čižmek, J. Filipović-Grčić, J. Lovrić, I. Pepić. HCE-T cell-based permeability model: A well- maintained or a highly variable barrier phenotype? Eur J Pharm Sci 104 (2017) 23-30.

Svrha rada Bolest suhog oka je multifaktorijalna bolest površine oka čije su glavne značajke nestabilnost i hiperosmolarnost suznog filma, što uzrokuje upalu i oštećenje površine oka. Kationske U/V nanoemulzije važan su formulacijski pristup za unapređenje terapije suhog oka. Zbog svojih intrinzičnih svojstava mogu osigurati uklanjanje simptoma suhog oka uz smanjenu učestalost doziranja, a uklopljenom lijeku mogu produljiti vrijeme zadržavanja na površini oka. U sklopu ovog istraživanja ibuprofen je izabran kao modelni nesteroidni protuupalni lijek koji djeluje na upalnu komponentu bolesti suhog oka. Svrha ovoga istraživanja bila je ispitati biokompatibilnost kationskih nanoemulzija s ibuprofenom na in vitro i ex vivo modelima rožnice. Materijali i metode Kationske nanoemulzije s ibuprofenom (Hubei Biocause Phamaceutical, Kina) izrađene su visokoenergetskom metodom na mikrofluidizatoru (model M-110EH-30, Microfluidics, SAD). Kao nositelj pozitivnog naboja korišten je kitozan niske molekulske mase (Sigma-Aldrich, Njemačka). Od ostalih pomoćnih tvari korišteni su Miglyol 812 (Kemig, Hrvatska), lecitin S45 (Lipoid, Njemačka), Cremophor® EL (BASF, Njemačka) i glicerol (T. T. T., Hrvatska). Izrađenim nanoemulzijama izmjerena je veličina kapljica, indeks polidisperznosti (PDI) i zeta potencijal (Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Velika Britanija) te osmolarnost i pH. Za uzgoj 3D modela epitela humane rožnice korištena je HCE-T stanična linija (RIKEN Cell Bank, Japan) uzgajana na Transwell® pločama (Corning, SAD). Izlaganje modela nanoemulzijama provedeno je tijekom 30 minuta, a vijabilnost modela određena je 24 sata nakon izlaganja kolorimetrijskim MTT testom. Svježe svinjske očne jabučice dobivene su iz lokalne klaonice. Rožnice su izlagane nanoemulzijama tijekom 5 i 15 minuta, nakon čega je ispitano njihovo oštećenje korištenjem otopine fluoresceina (Sigma-Aldrich) uz kobaltno plavu lampu (Conóptica, Španjolska). Rezultati Kationske nanoemulzije s veličinom kapljica od 172, 5 do 208, 4 nm (PDI 0, 116-0, 356) uspješno su izrađene korištenjem mikrofluidizatora. Zeta potencijal nanoemulzija s kitozanom je pozitivan te su njegove vrijednosti više za nanoemulzije s većim udjelom kitozana. Biokompatibilnost nanoemulzija in vitro ispitana je korištenjem 3D modela epitela humane rožnice, a ex vivo korištenjem modela rožnice svinje. Korištenjem in vitro i ex vivo modela dokazana je biokompatibilnost kationskih nanoemulzija s ibuprofenom. Kod 3D in vitro staničnog modela epitela rožnice vijabilnost je iznosila oko 100%, a kod ex vivo modela rožnice oka svinje nije uočeno značajno obojenje rožnica fluoresceinom, što ukazuje na odsutnost oštećenja. Zaključak Ovo je istraživanje pokazalo da kationske nanoemulzije imaju potencijal za tehnološku platformu u razvoju suvremenih farmaceutskih oblika za liječenje bolesti suhog oka. Rezultati ovoga istraživanja temelj su za daljnja pretklinička i klinička ispitivanja.

Poloksamersko-kitozanske micele s deksametazonom su pripravljene otapanjem poloksamera (5 %, m/v), kitozana [0, 005 % (m/v) ili 0, 01 % (m/v) ili 0, 015 % (m/v)] i djelatne tvari (10 mg) u acetatnom puferu (10 ml, pH = 4, 5 ili pH = 6, 0). Neuklopljeni je deksametazon uklonjen filtriranjem disperzije kroz membranski filtar veličine pora 0, 45 µm. Sustavi su karakterizirani s obzirom na veličinu i raspodjelu veličina micela, zeta-potencijal i uklapanje lijeka. In vitro oslobađanjem je pokazano da se deksametazon smješten na međupovršini jezgre i hidrofilnog dijela micele oslobađa brzo (tijekom prvog sata) dok se deksametazon smješten u jezgri micele oslobađa sporo, difuzijom ili uslijed disocijacije micela. Utjecaj poloksamersko-kitozanskih micela na permeabilnost uklopljenog deksametazona ispitivan je na Caco-2 staničnoj liniji. Učinak micela na čvrste međustanične veze Caco-2 monosloja ispitan je mjerenjem transepitelnog električnog otpora (TEER) tijekom 24 sata. U odnosu na poloksamerske micele, poloksamersko-kitozanske micele povećavaju permeabilnost deksametazona kroz Caco-2 monosloj te privremeno smanjuju TEER, ovisno o pH sredine i koncentraciji kitozana. Tako pri pH 4, 5 i koncentraciji kitozana od 0, 015 % (m/v) u sustavu, micele 1, 8 puta povećavaju permeabilnost deksametazona u odnosu na poloksamerske micele. Privremeno smanjenje TEER-a može se pripisati privremenom (reverzibilnom) otvaranju čvrstih veza stanica monosloja i upućuje na ne toksičnost sustava u ispitivanim koncentracijama.

Bolest suhog oka bolest je površine oka koja je u današnje vrijeme česta pojava. Češće se javlja kod starijih osoba, žena, osoba koje su izložene niskoj vlažnosti zraka, osoba s autoimunim poremećajima, ali i kod mlađih osoba zbog svakodnevne dugotrajne uporabe digitalnih uređaja. Kationske nanoemulzije sa svojstvom mukoadhezivnosti stupaju u kontakt s mucinima na površini oka i namijenjene su liječenju bolesti površine oka zbog duljeg zadržavanja lijeka i veće bioraspoloživosti. U liječenju simptoma blagog oblika bolesti suhog oka dobre rezultate pokazuju kationske nanoemulzije pripravljene od sastavnica sličnih onima koje su fiziološki prisutne na površini oka. U sklopu ovog diplomskog rada uspješno su pripravljene formulacije koje sadrže 2,5% (m/m) polusintetske smjese srednjelančanih triglicerida, 0,05% (m/m) lecitina, 0,25% (m/m) makrogolglicerol ricinoleata 35, 0,05% (m/m) kitozana – polusintetskog kationskog polimera sa svojstvom mukoadhezivnosti, 2,5% (m/m) glicerola – alkohola neutralnog naboja prikladnog za izotonizaciju nanoemulzija i pročišćenu vodu do 100% (m/m). Pripravljenim formulacijama ispitana su fizičko-kemijska svojstva: prosječna veličina, raspodjela veličina te zeta-potencijal kapljica unutarnje faze. Također, ispitano je svojstvo mukoadhezivnosti reološkom metodom te određivanjem veličine kapljica, raspodjele veličina kapljica i zeta-potencijala nanoemulzija nakon miješanja s mucinom. Na temelju provedenih ispitivanja kao formulacija s potencijalom za daljnji razvoj ističe se sekundarna kationska nanoemulzija s oligomerom kitozana pripravljena dodavanjem otopine oligomera kitozana u smjesu prije priprave nanoemulzije procesom mikrofluidizacije. Dry eye disease is an ocular surface disease common in present times, more expressed in certain populations, such as senior citizens, women, people exposed to low humidity, patients with autoimmune diseases as well as younger people due to excessive everyday use of digital devices. Cationic nanoemulsions of mucoadhesive properties interact with mucins on the ocular surface and are intended for treatment of ocular surface diseases due to longer retention time of the drug and consequently its greater bioavailability. In treating symptoms of mild form of dry eye disease, cationic nanoemulsions composed of components similar to those found as constituents of the ocular surface show good results. Formulations prepared for purposes of this diploma thesis are composed of 2.5% (w/w) semisynthetic mixture of middle chain fatty acids, 0.05% (w/w) lecithin, 0.25% (w/w) macrogolglycerol ricinoleate 35, 0.05% (w/w) chitosan – semisynthetic cationic polymer with mucoadhesive properties, 2.5% (w/w) glycerol – neutrally charged alcohol suitable for nanoemulsion isotonisation and purified water to 100% (w/w). Formulations were tested for their physicochemical properties: average size, size distribution as well as zeta-potential of droplets of inner phase of nanoemulsions. In addition, mucoadhesive properties were also tested using rheological method and by measuring droplet size, size distribution and zeta-potential of nanoemulsions after the addition of mucin. Based on all conducted tests, formulation showing the potential for further development is secondary cationic nanoemulsion with chitosan oligosaccharide formed by adding a solution of chitosan oligosaccharide to the mixture before the process of microfluidisation.

Nanoemulzije se ističu kao inovativni farmaceutski oblik s velikim potencijalom u liječenju bolesti suhog oka. Prednosti nanoemulzija temelje se na njihovoj strukturi i sastavu koje imaju učinak nadomještanja i stabilizacije suznog filma te na mogućnosti uklapanja slabo topljivih gluokokoritikoida kao što je loteprednol etabonat, djelatna tvar nedavno odobrena u liječenju blagih do umjerenog oblika bolesti suhog oka. Poseban potencijal imaju kationske nanoemulzije, zbog dobrih svojstava širenja po površini oka pri primjeni te produljenom zadržavanju na površini oka. Cilj ovog diplomskog rada bio je razviti sekundarnu kationsku U/V nanoemulziju s kitozanom pogodnu za uklapanje loteprednol etabonata. Nanoemulzije U/V tipa izrađene su visokoenergetskom metodom mikrofluidizacije. Kao ulja faza odabran je Capryol 90 zbog dobre topljivosti loteprednol etabonata u toj uljnoj fazi. Razvoj nanoemulzije proveden je u tri faze, (i) probir vrste i udjela neionske površinski aktivne tvari, (ii) probir vrste i udjela anionske površinski aktivne tvari te (iii) probir udjela niskomolekulskog kitozana. U svih fazama razvoja provedena je fizičko-kemijska karakterizacija nanoemulzija u vidu određivanja veličine i raspodjele veličina kapljica disperzne faze te zeta-potencijala. Na temelju provedene fizičko-kemijske karakterizacije sekundarna kationska nanoemulzija s 0,05 % (m/m) kitozana, 5 % (m/m) Capryola® 90, 0,25% (m/m) makrogol 15 hidroksistearata i 0,1% (m/m) lecitina Lipoid S75 ističe se kao vodeća formulacija s najvećim potencijalom za uklapanje loteprednol etabonata. Nanoemulsions stand out as an innovative dosage form with great potential in the treatment of dry eye disease. The benefits of nanoemulsions are based on (i) their structure and composition, which have the effect of replacing and stabilizing the tear film; and (ii) the ability to incorporate poorly soluble glucocorticoids such as loteprednol etabonate, an active substance recently approved in the treatment of mild to moderate dry eye disease. Cationic nanoemulsions have a unique potential due to their good spreading properties on the eye surface and prolonged retention on the eye surface. The aim of this thesis was to develop a secondary cationic O/W nanoemulsion with chitosan suitable for the incorporation of loteprednol etabonate. O/W type nanoemulsions are prepared by microfluidization. Capryol® 90 was chosen as the oil phase due to the good solubility of loteprednol etabonate in this oil phase. The development of the nanoemulsion was carried out in three phases, (i) screening of the type and content of nonionic surfactants, (ii) screening of the type and content of anionic surfactants, and (iii) screening of the content of low molecular weight chitosan. In all phases of development, physicochemical characterization of nanoemulsions was performed in the terms of determining the size and size distribution of droplets of the dispersed phase and zeta potential. Based on the performed physicochemical characterization, the secondary cationic nanoemulsion with 0.05% (w/w) chitosan, 5% (w/w) Capryola® 90, 0.25% (w/w) macrogol 15 hydroxystearate and 0.1% (w/w) Lecithin Lipoid® S75 stands out as the leading formulation with the greatest potential for incorporation of loteprednol etabonate.

Bolest suhog oka je multifaktorijalna bolest koju karakterizira nestabilnost i hiperosmolarnost suznog filma te upala površine oka. Kationske nanoemulzije tipa ulje u vodi (U/V) predstavljaju napredak u liječenju bolesti suhog oka služeći kao tehnološka platforma za uklapanje slabo topljivih djelatnih tvari, omogućujući pritom njihovo produljeno zadržavanje na površini oka te istodobnu nadoknadu i stabilizaciju narušenog suznog filma. Cilj ovog doktorskog rada je razvoj funkcionalne kationske nanoemulzije za liječenje bolesti suhog oka. U tu su svrhu pripravljena dva tipa nanoemulzija korištenjem mikrofluidizatora: primarne kationske nanoemulzije sa stearilaminom i sekundarne kationske nanoemulzije s kitozanom. Primarne kationske nanoemulzije s rastućim udjelima stearilamina male su veličine kapljica (< 100 nm), primjerene disperznosti (PDI ≤ 0,25), pozitivnog zeta-potencijala (3,1-25,5 mV), prikladne pH vrijednosti, male viskoznosti i površinske napetosti 31,3-35 mN m-1. Pripravljene nanoemulzije stabilne su tijekom petomjesečne pohrane. Nakon miješanja s disperzijom mucina zapažene su promjene u veličini kapljica i zeta-potencijalu koje ukazuju na interakciju s mucinom. Takve promjene nisu bile izraženije s povećanjem udjela stearilamina na više od 0,05 % (m/m). Vijabilnost 3D HCE-T modela iznosila je najmanje 90 % nakon izlaganja pripravljenim formulacijama. Sekundarne kationske nanoemulzije pripravljene s manjim (NC1: 0,05 %, m/m) i većim (NC2: 0,3 %, m/m) udjelom kitozana veličine su kapljica približno 180 nm, veće homogenosti (PDI < 0,2) i pozitivnog zeta-potencijala (18,7 i 30 mV). Iako je formulacija NC1 pokazala bolju stabilnost, ibuprofen je uspješno uklopljen u obje formulacije (INC1 i INC2). Fizičkokemijska svojstva (pH, viskoznost, osmolarnost i površinska napetost) pripravljenih formulacija unutar su raspona prikladnog za primjenu na oko. Formulacija INC1 stabilnija je od formulacije INC2 nakon jednomjesečne pohrane. Bakteriološka filtracija prikladna je metoda sterilizacije pripravljenih formulacija. Oslobađanje ibuprofena iz pripravljenih formulacija značajno je brže nego iz uljne otopine i suspenzije ibuprofena. Reološka karakterizacija formulacija pomiješanih s disperzijom mucina pokazala je njihov mukoadhezivni karakter koji, ipak, nije izraženiji kod formulacije INC2 s većim udjelom kitozana. Ispitivanja na 3D HCE-T modelu i ex vivo modelu rožnice svinje pokazala su izuzetnu biokompatibilnost INC1 formulacije. Uzimajući u obzir sve rezultate, nanoemulzija s 0,05 % (m/m) stearilamina i INC1 formulacija ističu se kao vodeće formulacije s velikim potencijalom za liječenje bolesti suhog oka. Dry eye disease is a multifactorial disease characterized by tear film instability and hyperosmolarity and ocular surface inflammation. Oil-in-water (O/W) cationic nanoemulsions represent a progress in dry eye disease treatment serving as a technological platform for incorporation of poorly soluble drugs, enabling prolonged residence time at the ocular surface and, at the same time, replenishment and stabilization of compromised tear film. The aim of this doctoral thesis is development of a functional cationic nanoemulsion for dry eye disease treatment. For this purpose two nanoemulsion types were prepared using microfluidizer: primary cationic nanoemulsions with stearylamine and secondary cationic nanoemulsions with chitosan. Primary cationic nanoemulsions with increasing stearylamine weight fraction are characterized with small droplet size (< 100 nm), low PDI (≤ 0.25), positive zeta-potential (3.1-25.5 mV), appropriate pH, low viscosity and surface tension 31.3-35 mN m-1. The nanoemulsions are stable after 5-month storage. Changes in nanoemulsion droplet size and zeta-potential were observed after mixing with mucin dispersion, which indicates interactions with mucin. However, the changes were not more pronounced with the increase in stearylamine weight fraction above 0.05 % (w/w). Viability of 3D HCE-T model was at least 90 % after exposure to the prepared formulations. Secondary cationic nanoemulsions prepared with low (NC1: 0.05 %, w/w) and high (NC2: 0.3 %, w/w) chitosan weight fraction are characterized with droplet size of around 180 nm, greater homogeneity (PDI < 0.2) and positive zeta-potential (18.7 and 30 mV). Although the formulation NC1 showed greater stability, ibuprofen was successfully incorporated in both formulations (INC1 and INC2). The physico-chemical properties (pH, viscosity, osmolarity and surface tension) of the prepared formulations are within the range acceptable for ophthalmic application. The formulation INC1 is more stable than the formulation INC2 after 1-month storage. Filtration is an appropriate sterilization method for the prepared formulations. Ibuprofen release from the prepared formulations is significantly faster than from ibuprofen oil solution and suspension. Rheological characterization of the formulations mixed with mucin dispersion showed their mucoadhesive character which, however, is not more pronounced with the formulation INC2 with higher chitosan weight fraction. The assays performed using 3D HCE-T model and ex vivo porcine cornea model showed remarkable biocompatibility of the formulation INC1. Taking everything into account, the nanoemulsion with 0.05 % (w/w) stearylamine and INC1 formulation point out as the lead formulations holding great potential for the treatment of dry eye disease.

Topikalna primjena lijekova na oko je preferirani put primjene lijekova pri liječenju bolesti oka. Pod pojmom konvencionalnih oftalmičkih lijekova podrazumijevamo otopine i suspenzije lijeka koje se primjenjuju na površinu oka u obliku kapi za oko. Takovi farmaceutski oblici lijeka relativno brzo se uklanjaju s površine oka te je potrebno njihovo učestalo doziranje za postizanje farmakološkog učinka. To ima negativan učinak na adherenciju pacijenta. Terapijski nanosustavi predstavljaju jedno od inovativnih rješenja koja mogu dovesti do povećanja bioraspoloživosti topikalno primijenjenog oftalmičkog lijeka. Glaukom je bolest karakterizirana oštećenjem vidnog živca i jedan od vodećih uzroka sljepoće. Povišeni očni tlak smatra se jednim od glavnih čimbenika rizika u razvoju glaukoma. Melatonin se istaknuo kao jedan od potencijalnih lijekova za uspiješno liječenje povećanog očnog tlaka i spriječavanja razvoja glaukoma . U ovom radu pripravljene su lecitinsko-kitozanske nanočestice s uklopljenim melatoninom, zadovoljavajućih fizičko-kemijskih svojstava. Kationski polimer kitozan osigurava pozitivni površinski naboj nanočestica čime se potencijalno omogućava njihova interakcija s vodenomucinskim slojem suznog filma te produljuje vrijeme zadržavanja oftalmičke formulacije na površini oka. Pri ispitivanim uvjetima, lecitinsko-kitozanske nanočestice karakterizira produljeno oslobađanje melatonina. Permebilnost melatonina određena je korištenjem in vitro modela epitela rožnice temeljenog na HCE-T staničnoj liniji. Brzina oslobađanja melatonina korelira sa brzinom permeacije melatonina preko in vitro model epitela rožnice. Topical administration of ophthalmic drugs is the preferred route of administration of drugs in the treatment of ocular diseases. The term conventional ophthalmic drugs is referred to drug solutions and suspensions that are applied to the eye surface in the form of eye drops. Such pharmaceutical dosage forms are removed relatively quickly from the eye surface, and their frequent dosing is required to achieve a pharmacological effect. This has a negative effect on patient adherence. Drug delivery nanosystems represent one of the innovative solutions that can increase the bioavailability of a topically applied ophthalmic drug. Glaucoma is a disease characterized by damage to the optic nerve and one of the leading causes of blindness. Elevated eye pressure is considered one of the major risk factors for glaucoma development. Melatonin has emerged as one of the potential drugs for successfully treating increased eye pressure and preventing glaucoma development. In this work, melatonin-loaded lecithin-chitosan nanoparticles were prepared with satisfactory physicochemical properties. Incorporation of chitosan in the system povides nanoparticles with positive charged surface. This enables potential interation of nanoparticles with the mucoaqueous layer of the tear film and increase of retention time of the ophthalmic formulation on eye surface. Nanoparticles were characterised by prolonged melatonin release. Melatonin permeability was investigated using in vitro HCE-T corneal epithelial model. A correlation between melatonin in vitro release from nanoparticles and permeation rate was observed.

Cilj ovog diplomskog rada bio je razviti nanoemulziju U/V tipa stabiliziranu neionskim i ionskim surfaktantom te polielektrolitom. Nanoemulzije U/V tipa pripravljene su visokoenergetskom metodom mikrofluidizacije s Miglyolom 812 kao uljnom disperznom fazom. Pripravljenim nanoemulzijama mjerene su prosječna veličina kapljica, indeks polidisperznosti i zeta potencijal ovisno o rastućim udjelima lecitina S45, Cremophora EL i kitozana niske odnosno srednje molekulske mase. Nanoemulzije s najboljim svojstvima i stabilnošću bile su formulacije s 2,5% Migloyla 812, 0,05% lecitina S45, 0,25% Cremophora EL i 0,05% kitozana niske odnosno 0,1% kitozana srednje molekulske mase. Povećanjem udjela lecitina i Cremophora EL dolazi do smanjenja veličine kapljica sustava, dok u suprotnosti povećanje udjela kitozana rezultira većim kapljicama. Vrijednosti indeksa polidisperznosti nisu pokazale ovisnost o udjelu lecitina, dok rastućim udjelom Cremophora EL i kitozana PDI generalno raste. Rastućim udjelom lecitina postiže se sve negativniji zeta potencijal, no dodavanjem Cremophora EL taj negativni zeta potencijal opada. Dodatkom kitozana pak zeta potencijal se mijenja u pozitivne vrijednosti i raste sve većim udjelom kitozana. Sve razvojne formulacije s lecitinom i Cremophorom EL pokazale su stabilnost 30 dana nakon izrade. Konačne nanoemulzije koje su sadržavale još i kitozan pokazale su se nedovoljno stabilnima pri masenim udjelima kitozana niske molekulske mase od 0,1% i više te masenom udjelu kitozana srednje molekulske mase od 0,2% i više. Usporedbom rezultata mjerenja veličine kapljica, indeksa polidispoerznosti i zeta potencijala između nanoemulzija s kitozanom niske i nanoemulzija s kitozanom srednje molekulske mase nisu zabilježene značajne razlike u vrijednostima ovih parametara. The aim of this diploma thesis was to develop a nanoemulsion of O/W type stabilized by nonionic and ionic surfactant and polyelectrolyte. Nanoemulsions of O/W type were prepared using the high energy method of microfluidisation with Miglyol 812 as the oily dispersed phase. The prepared nanoemulsions were subjected to measurments of thier average droplet size, polydispersity index and zeta potential depending on the rising mass fraction of lecithin S45, Cremophor EL and low, as well as medium molecular weight chitosan. The final nanoemulsions with the best properties and stability were formulations containing 2,5% Miglyol 812, 0,05% lecithin S45, 0,25% Cremophor EL and 0,05% low and 0,1% medium molecular weight chitosan respectively. By increasing the fraction of lecithin and Cremophor EL, droplet size of the system decreases, while, on the contrary, increasing the fraction of chitosan results in bigger droplets. The values of the polydispersity index did not show dependence on the lecithin share, while the growing share of Cremophor EL and chitosan generally increases the PDI values. Zeta potential gets more and more negative with the increase of lecithin share, but by adding Cremophor EL that negative zeta potential diminishes and approaches zero. The addition of chitosan sees the shift of zeta potential into positive values that grow with an increasing share of chitosan. All of the developmental formulations containing lecithin and Cremophor EL expressed stability thirty days after their preparation. The final nanoemulsions with low molecular weight chitosan share of 0,1% and above and medium molecular weight chitosan share of 0,2% and above were found to be not stable enough during the same period of thirty days. Comparison of the results of average droplet size, polydispersity index and zeta potential measurments between low and medium molecular weight chitosan nanoemulsions did not show significant differences in the values of these parameters.

Apsorpcija i posljedično bioraspoloživost topikalnih oftalmičkih lijekova je ograničena zbog barijera prednjeg dijela oka kao što su nazolakrimalna drenaža, refleks treptanja i suzenja, čvrste barijere rožnice te proteini i metabolički enzimi suzne tekućine. S ciljem povećanja bioraspoloživosti oftalmičkih lijekova, smanjenja nuspojava zbog neproduktivne apsorpcije u sistemsku cirkulaciju te smanjene učestalosti doziranja istražuju se i razvijaju inovativni farmaceutski oblici topikalnih oftalmičkih lijekova. Potencijal U/V nanoemulzija u oftalmičkoj primjeni temelji se na sličnosti nanoemulzija sa suznim filmom. Kako je većina oftalmičkih lijekova slabo topljiva u vodi, uklapanjem u uljnu fazu U/V nanoemulzija povećava se njihova topljivost. S ciljem produljenja zadržavanja nanoemulzija na površini oka, površina kapljica modificira se dodatkom kationskih surfaktanata ili polimera. Time površina kapljica unutarnje faze postaje pozitivno nabijena. Ključan parametar u procesu razvoja konačnog oblika lijeka je njegova stabilnost. Cilj ovog diplomskog rada je ispitati stabilnost kationskih U/V nanoemulzija čiju uljnu fazu čini Mygliol 812, surfaktanti koji osiguravaju stabilnost sustava su lecitin S45 i Cremophor EL, a pseudoemulgator kationski polimer kitozan. Nanoemulzije su pripravljene visokoenergetskom metodom mikrofluidizacije. Ispitativana je stabilnost nanoemulzija nakon skladištenja 30 dana pri sobnoj temperaturi i pri 4C, metodama ubrzanog starenja i nakon razrjeđenja umjetnom suznom tekućinom. Kao parametri stabilnosti, razmatrani su veličina kapljica, indeks polidisperznosti i zeta potencijal nanoemulzija. Određivanje stabilnosti nanoemulzija u stvarnom vremenu pri 4 i 25C ukazuju na potrebu čuvanja nanoemulzija pri nižim temepraturama. Nakon provedenih testova ubrzanog starenja, došlo do porasta veličine kapljica i indeksa polidisperznosti kationskih nanoemulija, koje prati i blagi porast zeta potencijala, ali nije došlo do vrhnjenja niti do odvajanja faza, što ukazuje na dobru kinetičku stabilnost formulacija. Miješanjem nanoemulzija sa suznom tekućinom u omjeru 40:7 nije došlo do značajne promjene veličine kapljica, indeksa polidisperznosti ni zeta potencijala kationske nanoemulzije. The absorption and consequently the bioavailability of topical ophthalmic drugs is limited by the anterior eye segment barriers such as nasolacrimal drainage, reflex blinking, tight corneal barriers and proteins and metabolic enzymes of tear fluid. In order to increase the bioavailability of ophthalmic drugs, reduce the side effects due to unproductive absorption into systemic circulation and reduced dosage frequency, innovative pharmaceutical forms of topical ophthalmic drugs are being investigated and developed. The potential of O/W nanoemulsion in ophthalmic drug delivery is based on the similarities of the nanoemulsion with the tear film. Since most of the ophthalmic drugs are poorly soluble in water, their encapsulation into the O/W nanoemulsion oil phase increases drug solubility. With the aim of prolonging the nanoemulsion retention on the surface of the eye, the droplet surface is modified by addition of cationic surfactants or polymers, which makes the droplets positively charged. The key parameter in the process of developing a final dosage form is its stability. The aim of this thesis is to examine the stability of the cationic O/W nanoemulsion whose oil phase makes the Mygliol 812, surfactants lecithin S45 and Cremophor EL, and pseudo-emulsifier cationic polymer chitosan. Nanoemulsions were prepared by a high-energy microfluidization method. The stability of nanoemulsion was tested after storage for 30 days at room temperature and at 4 ° C, accelerated stability testing methods and after dilution with simulated tear fluid. As stability parameters, the size of the droplet, the polydispersity index and the zeta potential of the nanoemulsion were considered. Determination of the stability of the nanoemulsion in real time at 4 and 25C indicates the need to store the nanoemulsion at lower temperatures. After accelerated aging tests were performed, the droplet size and polydispersity index of cationic nanoemulsion increased, followed by a mild increase in potency, but there was no creaming or phase separation, indicating good kinetic stability of the formulationsMixing the nanoemulsion with the simulated tear fluid at a ratio of 40: 7 did not induced any significant changes to the droplet size, polydispersity index nor zeta potential.

The anatomical barriers and the tear fluid dynamics in the precorneal area have a huge effect on the eye-related drug bioavailability. In situ forming gels stand out as the formulation candidates for the improvement of bioavailability and efficacy of topical ophthalmic drugs. These are prepared as liquid dosage forms that undergo phase transition on eye surface to form viscoelastic gel in response to an environmental stimulus following topical administration. During formulation development, in situ forming ophthalmic gels need to be fine-tuned considering all the biopharmaceutical challenges of the front of the eye. The aim of this thesis was to develop temperature-responsive in situ forming poloxamer P407/ poloxamer P188/chitosan gel fine-tuned in terms of polymer content, temperature of gelation and viscosity by applying Quality by Design principles. Minimizing the total polymer content, while retaining the advantageous rheological properties, has been achieved by means of D-optimal statistical design. In situ forming gels were prepared by cold method and analyzed by rheological temperature sweep test. Statistical software was used to set experimental design, establish the mathematical model and analyze the collected data. Validated mathematical models enabled the selection of 4 candidates of poloxamer 407/poloxamer 188/chitosan systems, which viscoelastic behavior was studied in depth by oscillatory rheological tests under biorelevant conditions. The optimal in situ forming gel was selected based on minimal polymer content, favorable rheological characteristics and in vitro resistance to tear dilution. The formulation robustness against entrapment of active pharmaceutical ingredients (API) with different physicochemical characteristics was demonstrated using four APIs in the concentrations and combinations relevant for topical ophthalmic use. Through discriminative in vitro release test, adequate release profile of model drug was proven. Biocompatibility of the optimal in situ forming gel was confirmed employing 3D corneal epithelial cell models. In conclusion, a systematic approach to in situ forming gel development implemented in this thesis resulted in a stable and robust formulation characterized by ease of formulation preparation, ability for sterile filtration and autoclaving, ease of administration, accuracy of dosing, avoidance of eye-related discomfort, biocompatibility and prolonged residence at the eye surface. Pri primjeni kapi za oko, zbog dinamičnih barijera prekornealonog područja, dolazi do brze eliminacije lijeka s površine oka. In situ gelovi predstavljaju jedno od inovativnih rješenja suvremene farmaceutske tehnologije za poboljšanje terapijske učinkovitosti topikalnih oftalmičkih lijekova. Takvi su sustavi oblikovani kao otopina lijeka, pogodna za topikalnu primjenu, a koja gelira izlaganjem fiziološkim uvjetima. In situ oftalmički gelovi trebaju biti pomno dizajnirani s ciljem produljenja vremena zadržavanja lijeka na mjestu primjene, povećanja bioraspoloživosti i učinkovitosti. Cilj je ovoga doktorskoga rada bio razviti in situ gel za oftalmičku primjenu korištenjem smjese polimera (poloksamera P407, poloksamera P188 i kitozana) specifično dizajnirane u smislu ukupnoga sadržaja polimera, temperature geliranja (Tgel), kompleksne viskoznosti (η*) i reološkoga parametra modula pohrane (G'). Korištenjem D-optimalnoga statističkoga eksperimentalnog dizajna optimirana su reološka svojstava razvijenih sustava uz smanjenje ukupne koncentracije korištenih polimera. In situ oftalmički gelovi poloksamera pripravljeni su ''hladnom'' metodom te analizirani reološkim testom promjene temperature. Statistički je softver korišten za postavljanje eksperimentalnoga dizajna, utvrđivanje modela, generiranje sekvenci i za statističku obradu prikupljenih podataka. Temeljem validiranih modela, odabrana su četiri vodeća poloksamer 407/poloksamer 188/kitozan sustava, čije je viskoelastično ponašanje ispitano u detaljnoj reološkoj karakterizaciji. S obzirom na najmanji udio polimera, poželjna reološka svojstva te in vitro rezistentnost na razrjeđenje suznom tekućinom, miješani je sustav PL1 odabran kao optimalni in situ gel. Prikladnost razvijenoga sustava kao platforme za uklapanje djelatnih tvari različitih fizikalno-kemijskih svojstava je dokazana je dodatkom četiri djelatne tvari u koncentracijama i kombinacijama relevantnim za topikalnu oftalmičku primjenu. Odgovarajući profil oslobađanja djelatne tvari iz PL1 platforme pokazan je diskriminatornom in vitro metodom oslobađanja. Biokompatibilnosti PL1 optimalnoga in situ gela pokazana je na 3D epitelnim modelima rožnice. Sustavan pristup razvoju in situ gela, proveden u sklopu doktorskoga rada, rezultirao je stabilnom i robusnom formulacijom, koju karakterizira jednostavna priprava, mogućnost sterilizacije te svojstva koja omogućuju jednostavnost primjene, točnost doziranja, izbjegavanje nelagode nakon primjene, biokompatibilnost i produljeno zadržavanje na površini oka.

Nanoemulzije zbog svojih su svojstava zanimljive kao formulacije namijenjene oftalmičkoj primjeni. Mogu biti izrađene niskoenergetskim i visokoenergetskim metodama. Za potrebe ovog rada korištene su dvije visokoenergetske metode, visokotlačna homogenizacija i mikrofluidizacija. Nanoemulzije su pripremljene tako da se najprije izradila primarna emulzija, koja je zatim prošla kroz jedan, tri i pet ciklusa visokotlačne homogenizacije, odnosno mikrofluidizacije. Veličina kapljica, PDI i zeta-potencijal određeni su nakon izrade i dva tjedna nakon izrade kako bi se mogla procijeniti stabilnost nanoemulzija. Dobivene nanoemulzije bile su mliječno bijele boje i nisu pokazale odvajanje faza tijekom dva tjedna. Općenito su pri većem tlaku i pri većem broju ciklusa izmjerene najmanje veličine kapljica, dok je najmanja veličina kapljica izmjerena za nanoemulziju izrađenu nakon pet ciklusa mikrofluidizacije pri tlaku od 1300 bara. PDI nijednom nije bio manji od 0,1. Zeta-potencijal bio je približno sličan kod svakog uređaja, pri svakom tlaku i broju ciklusa. Bitno je naglasiti da su izmjerene vrijednosti (~4 mV) daleko od očekivanih vrijednosti (~30 mV). Nijedna formulacija nije pokazala željena svojstva. Nanoemulsions are interesting as pharmaceutical formulations for ophthalmic use because of their specific properties. They can be made with low-energy and high-energy methods. High-pressure homogenization and microfluidization were two high-energy methods used in this research. Nanoemulsions were prepared as follows: firstly, the primary emulsion was made, which was then passed through one, three and five cycles of high-pressure homogenization or microfluidization. Droplet size, PDI and zeta-potential were measured one day after preparation and two weeks after preparation to assess the stability of nanoemulsions. Prepared nanoemulsions were milky white and phase separation did not occur in two weeks. In general, using higher pressure and greater number of cycles resulted with smaller droplet size, with the smallest droplet size measured for nanoemulsion produced after five microfluidization cycles at 1300 bar. PDI was never less than 0.1. The zeta-potential was approximately the same in nanoemulsions prepared using both devices, regardless of pressure and number of cycles. It is important to note that the measured values (~ 4 mV) are far from the expected values (~ 30 mV). None of the formulations showed the desired properties.

Bioraspoloživost lijeka u oku je vrlo niska pri topikalnoj primjeni konvencionalnih kapi za oko zbog brze eliminacije djelatne tvari s površine oka. Glavna karakteristika in situ gelirajućih sustava je produljenje zadržavanja pripravka na površini oka te posljedično povećanje bioraspoloživosti lijeka. Cilj ovog diplomskog rada bio je ispitati prikladnost staničnih modela epitela rožnice u ispitivanju biokompatibilnosti in situ gelirajućih sustava koji se temelje na poloksamerima i kitozanu. U tu svrhu korištena je imortalizirana stanična linija humanih epitelnih stanica rožnice, HCE-T, te in situ gelirajući sustav koji se sastoji od poloksamera P407 (14,2%, m/m), P188 (17%, m/m) te kitozana (0,25 %, m/m).Citotoksičnost in situ gelirajućeg sustava ispitivana je na monosloju humanih epitelnih stanica rožnice HCE-T te na in vitro modelima rožnice temeljenih na dvosloju i višesloju humanih epitelnih stanica HCE-T. Nakon tretiranja stanica s formulacijom, stanična vijabilnost procjenjivala se MTT testom. Citotoksični učinak nije zabilježen pri izlaganju monosloja HCE-T stanica in situ gelirajućem sustavu tijekom 5, 10 i 15 minuta. In vitro model epitela rožnice omogućio je određivanje utjecaja kitozana prisutnog u in situ gelirajućem sustavu na otvaranje čvrstih veza između epitelnih stanica rožnice mjerenjem transepitelnog električnog otpora. Citotoksični učinak nije zabilježen pri izlaganju in vitro modela epitela rožnice in situ gelirajućem sustavu tijekom 30 minuta. In vitro modeli epitela rožnice pokazali su se manje osjetljivim u usporedbi s monoslojem stanica te su stoga prikladniji modeli u ispitivanju citotoksičnosti in situ gelirajućih formulacija u razvoju. When conventional eye drops are applied topically, the bioavailability of the drug in the eye is very low due to the rapid elimination of the active substance. The main characteristic of in situ gelling systems is the prolongation of the retention time on the surface of the eye and consequently the increase in the bioavailability of the drug. The aim of this diploma thesis was to investigate the suitability of in vitro corneal epithelial models for the evaluation of the biocompatibility of in situ gelling system that are based on poloxamers and chitosan. For this purpose, the immortalized corneal epithelial cell line, HCE-T, and an in situ gel system consisting of P407 (14,2%, m/m), P188 (17%, m/m) and chitosan (0,25%, m/m) were used. The cytotoxicity of the in situ gelling system was investigated on a monolayer of a human corneal epithelial cell line, HCE-T and on in vitro corneal models based on bilayer and multilayer of HCE-T cells. After treating cells with the formulation, cell viability was evaluated by MTT test. The cytotoxic effect was not observed after a monolayer of HCE-T cells was exposed to the in situ gel system for 5, 10 and 15 minutes. The in vitro corneal epithealial model enabled the determination of the influence of chitosan present in the in situ gel system on the opening of tight junctions between the corneal epithelial cells by measuring the transepithelial electric resistance. The cytotoxic effect was not observed during the 30-minute exposure of the in vitro corneal epithelial models to the in situ gelling system. In vitro corneal epithelial models proved less sensitive in comparison to monolayer cells and are, therefore, more suitable models for studying cytotoxicity of the in situ gelling formulations.