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OBJETIVOS. 1. Determinar el papel de los mecanismos autoinmunes en la patogenia de la fibromialgia. Evaluar la presencia de anticuerpos anti-serotonina, anticuerpos anti-gangliósidos y otros autoanticuerpos en sangre periférica de pacientes con fibromialgia y controles sanos así como analizar la variación de estos anticuerpos en función del estado clínico de los pacientes. 2. Evaluar la presencia de disbalances entre citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y estudiar la asociación de los polimorfismos genéticos de estas citoquinas con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la fibromialgia. 3. Analizar el polimorfismo de los genes KIR y HLA de clase I y clase II en pacientes con fibromialgia y controles sanos con el objetivo de conocer su posible asociación con la susceptibilidad y manifestaciones clínicas de la enfermedad. METODOLOGÍA Determinación de anticuerpos IgG e IgM anti-serotonina: ELISA tipo sándwich y anticuerpos anti-Gangliósidos mediante dot-blot. Los niveles de serotonina en suero se determinaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La determinación de citoquinas en suero se realizó con tecnología Luminex, con la excepción del TGF-β1 que se realizó mediante ensayo ELISA tipo sándwich. El polimorfismo de los genes de las citoquinas se determinó mediante un ensayo de discriminación alélica con sondas Taqman específicas. El estudio del polimorfismo VNTR del gen de la IL-4 se realizó PCR convencional empleando cebadores específicos para amplificar la región de interés El tipaje de los genes HLA-A, B, C, y KIR se realizó mediante las técnicas de PCR-SSO y PCR-SSP. CONCLUSIONES: 1. Los niveles de serotonina se encuentran disminuidos en el suero de los pacientes con FM pero no parecen asociarse con la severidad de las manifestaciones clínicas. 2. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM y los niveles séricos de estos anticuerpos se encuentran aumentados en pacientes con FM respecto a la población sana. 3. La prevalencia de anticuerpos anti-serotonina IgG e IgM es mayor en pacientes de FM con niveles de ansiedad moderada, severa o grave que en pacientes con niveles de ansiedad leve, lo que sugiere una asociación de estos anticuerpos con formas más severas de la enfermedad. 4. Los niveles séricos de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas son similares en pacientes con FM y en la población sana. 5. Los SNPs de los genes de las citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias estudiadas no parecen asociarse con la susceptibilidad al desarrollo de FM. 6. El genotipo AA del SNP rs16944 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación grave o muy grave de la enfermedad según el test FIQ en pacientes con FM, por el contrario, la presencia del genotipo GA de este SNP se asocia con una manifestación más leve de la enfermedad. 7. El genotipo AA del SNP rs1143634 del gen de la IL-1β se asocia con una manifestación moderada o grave de la FM según el test CGI. 8. El genotipo 3R/3R de la región VNTR del gen de la IL-4 se asocia con una peor calidad de vida en pacientes con FM, por el contrario el genotipo 2R/3R se asocia a una mejor calidad de vida de los mismos. 9. El genotipo GG del SNP rs1800469 del gen del TGF-β se asocia a una mejor calidad de vida de los pacientes con FM, por el contrario el genotipo AG se asocia con niveles de ansiedad severa o grave en estos pacientes. 10. El polimorfismo de los genes KIR y HLA no se asocia con la susceptibilidad a desarrollar FM ni con las manifestaciones clínica de la misma. 11. Este trabajo confirma que la FM, además de estar condicionada por factores genéticos, desde el punto de vista inmunológico puede tener mecanismos etiopatogénicos diferentes como son los fenómenos autoinmunes o los fenómenos de desregulación de los mecanismos inflamatorios, hecho que puede tener relevancia clínica a la hora de evaluar adecuadamente a los pacientes así como para poder diseñar tratamientos más personalizados. OBJECTIVES 1. Determine the role of autoimmune mechanisms in the pathogenesis of fibromyalgia. To evaluate the presence of anti-serotonin antibodies, anti-ganglioside antibodies and other autoantibodies in peripheral blood of patients with fibromyalgia and healthy controls, as well as to analyze the variation of these antibodies according to the clinical status of patients. 2. Evaluate the presence of imbalances between pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines and to study the association of cytokine genetic polymorphisms with the susceptibility and clinical manifestations of fibromyalgia. 3. To analyze the polymorphism of KIR and HLA class I and class II genes in fibromyalgia patients and healthy controls in order to investigate their potential association with the susceptibility and clinical manifestations of the disease. METHODOLOGY The determination of anti-serotonin IgG and IgM antibodies was performed bysandwich ELISA, and the determination of anti-Ganglioside antibodies was performed by dot-blot. Serum levels of serotonin were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Serum cytokine determination was performed using Luminex technology, with the exception of TGF-β1 that was performed by sandwich ELISA. The cytokine gene polymorphisms were determined by allelic discrimination assay, with specific Taqman probes and alternatively by Sanger sequencing. The study of the IL-4 gene VNTR polymorphism was performed by conventional PCR using the specific primers to amplify the region of interest. Typing of the HLA-A, B , C, and KIR genes was performed using PCR-SSO and PCR-SSP techniques. CONCLUSIONS: 1. Serotonin levels are decreased in the serum of FM patients but doesn´t appear to be associated with the severity of clinical manifestations. 2. The prevalence and serum levels of IgG and IgM anti-serotonin antibodies are increased in patients with FM compared to the healthy population. 3. The prevalence of IgG and IgM anti-serotonin antibodies is higher in FM patients with moderate or severe anxiety levels than in patients with mild anxiety levels, suggesting an association of these antibodies with more severe forms of the disease. 4. Serum levels of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines are similar in patients with FM and in healthy population. 5. SNPs of the studied pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine genes doesn´t appear to be associated with susceptibility to FM development. 6. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs16944 is associated with a severe or very severe manifestation of the disease according to the FIQ test in patients with FM, by contrast, the presence of GA genotype in this SNP is associated with a milder manifestation of the disease. 7. The AA genotype of the IL-1β gene SNP rs1143634 is associated with a moderate or severe manifestation of FM according to the CGI test. 8. The 3R/3R genotype of the IL-4 gene VNTR region is associated with a worse quality of life in patients with FM., by contrast the 2R/3R genotype is associated with a better quality of life. 9. The GG genotype of the TGF-β gene SNP rs1800469 associated with a better quality of life in patients with FM, by contrast the AG genotype is associated with severe anxiety levels in these patients. 10. KIR and HLA genes polymorphism is not associated with the susceptibility and clinical manifestations of FM. 11. This work confirms that FM is conditioned by genetic factors, but also may be related to immunological factors such as autoimmune phenomena or a deregulation of inflammatory mechanisms, which may be relevant for an adequate clinical assessment of patients as well as for the design personalized treatments

Hemos estudiado un total de 59 pacientes críticos, (32 politraumatizados y 27 quemados), así como una población sana control de 32 sujetos. Las edades oscilaban entre 15 y 75 años y la gravedad clínica estaba medida en Trauma Score y porcentaje de superficie corporal quemada. Ninguno de los pacientes recibió transfusión sanguínea previa al estudio ni drogas esteroideas. Las infecciones, eran con frecuencia la causa de muerte tardía en pacientes politraumatizados y quemados. El origen de las mismas, parecía relacionarse con la depresión de las defensas inmunitarias, en estos pacientes, a las pocas horas del accidente. Los enfermos, presentaban una linfopenia inicial en las primeras 24 – 48 horas del trauma o lesión térmica, al compararlos con los individuos sanos controles. La linfopenia, afectaba en números absolutos a las subpoblaciones linfocitarias CD3, CD 4 y CD8 siendo proporcional a la gravedad del traumatismo y no relacionada con la extensión de la quemadura. Los valores absolutos de linfocitos B, no sufrían modificaciones, en los primeros momentos tras el accidente, aunque se observaba un descenso de los niveles de IgG estadísticamente significativo (p = 0.001). El sistema monocítico/macrofágico, mostraba una disminución de la capacidad fagocítica en ambos grupos de pacientes y estadísticamente significativo con respecto al grupo sano control. La determinación de los valores de la proteína C reactiva, exhibía en todo momento, cifras elevadas en ambos grupos de pacientes inmediatamente después de la agresión (traumática o térmica). El descubrimiento de las citoquinas (TNF, IL 1β, gamma interferon… etc), como factores solubles, secretados por las células activadas y sus funciones en las reacciones inflamatorias inespecíficas e inmunitaria específica, nos llevaba a pensar, en el importante papel que estos factores solubles jugaban en el normal funcionamiento del sistema inmune, de tal manera, que un desequilibrio en la producción de citoquinas o en el tipo de la misma, podía conducir a alteraciones metabólicas, de la coagulación, del sistema temoregulador y del sistema inmune entre otros. El trauma y la quemadura, eran estímulos suficientemente fuertes como para provocar la liberación e citoquinas TNF e IL 1, y estas, a su vez, eran capaces de inducir cambios importantes en el fenotipo celular, fue así como encontrábamos que aunque existía linfopenia en las primeras 24 – 48 horas tras el trauma y lesión térmica, los linfocitos estaban activados y esto se ponía de manifiesto, con la presencia o aumento de expresión de marcadores de activación-adhesión (CD25, CD69 y CD71; CD11c, CD49a y CD54 respectivamente) en sus membranas. Concomitantemente a estos marcadores de activación, se observaba un moderado incrementos de linfocitos que mostraban simultáneamente los antígenos CD4+ y CD8+, sobretodo en los pacientes quemados. Dichas células CD4+ CD8+, a pesar de estar relacionadas con la activación, no expresaban los antígenos CD25 ni CD71. Así pues, el traumatismo y las quemaduras se acompañaban de una activación de los linfocitos que podría guardar relación con la intensidad de aquellos. La evolución de las cifras de linfocitos periféricos, en las semanas posteriores al accidente, dependía de la evolución clínica de los pacientes. Observábamos que los pacientes que experimentaban una mejoría clínica, mostraban un incremento en las cifras de linfocitos CD3+, CD4+ y CD8+. La mejoría clínica, se acompañaba asimismo de un restablecimiento de la función fagocítica, de un ascenso de los niveles de IgG y de una disminución de los valores de proteína C reactiva. Por el contrario, en quienes evolucionaban mal o no sobrevivían, se observaba una disminución sostenida de las cifras de IgG en suero y valores elevados de proteína C reactiva. Nosotros pensamos que todos estos cambios, estaban producidos por una liberación excesiva de citoquinas. Luego, parece razonable concluir que la linfopenia es motivada por un secuestro de las células en el endotelio vascular y otros tejidos inflamados y dañados, debido a la alta densidad de moléculas de adhesión exhibidas por las membranas celulares de los enfermos, que hacen, que los linfocitos se adhieran a estos lugares y sólo más tarde, con la recuperación del sujeto, y la posible disminución de citoquinas, la densidad de estas moléculas vaya disminuyendo y los linfocitos pasen nuevamente al torrente circulatorio. La linfopenia, no es por consiguiente la causa de la inmunodeficiencia, sino más bien el resultado o la consecuencia de cambios en la concentración de citoquinas, que son genuinamente, el origen de la depresión en las defensas orgánicas y del fracaso multiórgano. Creemos que en un futuro, no muy lejano, se diagnosticaran en cada paciente individual las alteraciones de defensa específicas, lo que facilitará el conocimiento de su situación inmunológica actual y pronóstico. De este modo, estaremos en mejor disposición de instaurar modalidades profilácticas y terapéuticas que podrían contribuir a la mejora de la respuesta inmune en aquellos sujetos víctimas de accidentes. Las infecciones siguen constituyendo la principal causa de muerte tardía después de traumatismos graves y quemaduras severas. La razón de esta inmunodeficiencia sigue siendo desconocida. En el presente trabajo nos hemos planteado estudiar la influencia directa de los traumatismos graves y las quemaduras sobre el sistema inmunitario, para poder conocer el mecanismo por el cual los pacientes son especialmente vulnerables a las infecciones. Para ello, nos hemos marcado los siguientes objetivos: 1) Determinar el perfil inmunológico inicial, característico de los enfermos críticos y su relación con la gravedad clínica inicial. 2) Conocer el cortejo inmunológico que acompaña a los pacientes a lo largo de la evolución de su cuadro patológico y su posible relación con el pronóstico. 3) Por último, valorar la influencia que el estado inmunitario tiene sobre la existencia de pacientes clínicamente muy graves, pero que sobreviven, así como de pacientes con altas posibilidades de sobrevivir, de acuerdo a criterios estrictamente clínicos, pero que sin embargo fallecen.

Tesis de maestría en ciencias de la salud El protozoario G. lamblia es el parásito causal de giardiasis, infección parasitaria que se produce por la contaminación fecal/ oral en un medio de higiene precario, siendo una de las enfermedades intestinales humanas más comunes en todo el mundo. Las manifestaciones clínicas de esta infección varían desde el estado de portador asintomático hasta llegar a desarrollar un cuadro de diarrea severa, dolor abdominal, náuseas, malabsorción de nutrientes y pérdida de peso. En la actualidad, el tratamiento farmacológico contra la giardiasis llega a ser efectivo, sin embargo, tiene algunas limitantes importantes, como la inducción de efectos secuendarios y la probable inducción de cepas resistentes. No se cuenta con una vacuna contra G. lamblia en humanos, esto es en gran medida por los limitados conocimientos que se tienen de la respuesta inmune durante la enfermedad. Para lograr desarrollar esta, primeramente se deben identificar, caracterizar, purificar o sintetizar los antígenos que confieren inmunogenicidad a la vacuna. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre antígenos inmunogénicos de G. lamblia es limitado. Por esta razón, es importante entender los mecanismos inmunológicos que controlan y erradican la infección por este parásito intestinal. El presente estudio se enfocó en la caracterización e identificación de la proteína inmunogénica 5G8 de G. lamblia a través de la técnica analítica de espectrometría de masas y el posterior análisis por herramientas bioinformáticas, así como también la caracterización parcial de la respuesta inmune celular contra este antígeno. La proteína 5G8 se aisló mediante una cromatografía de afinidad a partir de un lisado de trofozoítos de G. lamblia. La proteína 5G8 aislada (~ 71 kDa) fue analizada mediante espectrometría de masas. Se identificaron dos proteínas con masas moleculares relativas de ~ 28 kDa y ~ 38 kDa pertenecientes a la familia de Proteínas Variables de Superficie (VSPs). El análisis bioinformático permitió identificar un constructo, el cual fue traducido en una sola cadena polipeptídica compuesta de 607 aminoácidos y una masa molecular de ~ 61 kDa. Adicionalmente, al evaluar la respuesta inmune celular, se observó una proliferación celular significativamente más alta (p < 0.05) en esplenocitos estimulados con la proteína 5G8 aislada y el lisado de trofozoítos de G. lamblia comparada con los que fueron estimulados con una proteína irrelevante utilizada como control negativo (HEL). Por otro lado, el porcentaje de expresión del marcador CD69 como indicativo de activación temprana en estos esplenocitos, se mostró más elevado en las células que estuvieron en contacto con el extracto proteico total y la proteína 5G8 de G. lamblia comparado con los esplenocitos con la proteína utilizada como control negativo (HEL). Por último, el análisis de modelado molecular in silico proporcionó un acercamiento al posible sitio de unión e interacciones moleculares entre los péptidos inmunodominantes de la proteína 5G8 y las moléculas del MHC-II (haplotipo I-Ak). El resultado mostró una distribución uniforme y compacta del péptido con mayor inmunodominancia (67-81 aa) en la cavidad, favoreciendo su posible interacción con aminoácidos de los bolsillos del MHC-II (haplotipo I-Ak). En conclusión, nuestros datos sugieren que la proteína 5G8 es una VSP (~ 71 kDa) codificada por un solo gen. Esta proteína puede inducir una respuesta inmune celular en esplenocitos de ratones infectados y re-infectados G. lamblia. Las interacciones químicas que se favorecen entre péptidos inmunodominantes con aminoácidos de los bolsillos del MHC-II nos permiten profundizar en el conocimiento de epítopes potenciales que desencadenan una respuesta inmune celular, los cuales podrían considerarse como blanco de futuros estudios. La caracterización bioquímica e inmunológica de antígenos inmunogénicos proporcionará una mejor comprensión de la interacción G. lamblia-hospedero, y será importante para el desarrollo de estrategias de control eficaces contra la giardiasis. Universidad de Sonora. División de Ciencias Biológicas y de la Salud. Programa de maestría en ciencias de la salud 2016.

163 páginas. -- Tesis doctoral. Universidad de Valladolid. Instituto de Biología y Genética Molecular-CSIC. Leída, 18-12-2015, Las citocinas IL-12 p70 e IL-23 polarizan la respuesta inmune a los tipos Th1 y Th17. Estas citocinas comparten una subunidad, la IL-12 p40 (gen IL12/23B) y difieren en una subunidad específica, la IL-12 p35 (gen IL12A) en la IL-12 p70, y la IL-23 p19 (gen IL23A) en la IL-23. La regulación del balance IL-12 p70/IL-23 es relevante en infecciones fúngicas invasivas y enfermedades autoinmunes. La transcripción de IL23A se regula por una combinación de c-Rel con coactivadores como ATF2, que se activa por fosforilación complementaria, dependiente de PKC y MAPKs, de las Thr-71 y Thr-69. Los receptores de patrones fúngicos Dectin-1 y Dectin-2 inducen la producción de LTB4, cisteinil-leucotrienos y PAF que contribuyen a la fosforilación de ATF2. La transcripción de IL12A se reprime por el estímulo fúngico zimosano mediante la desacetilación dependiente de NAD+ de las histonas del promotor de IL12A por SIRT1, reduciendo la accesibilidad de c-Rel.

El rápido desarrollo de la Inmunología durante el pasado y presente siglo, ha hecho que la Inmunología sea actualmente la ciencia que más interrelación tiene con otras disciplinas del campo de la Biología y de la Biomedicina en general. Su carácter multidisciplinar hace que se integre y se complemente a la perfección con multitud de disciplinas biomédicas. Por otro lado, cada día aumenta el número de enfermedades en las que se reconoce que la participación del sistema inmunitario, es la causa, o contribuye de forma importante al proceso patológico. Precisamente, durante el curso 2013-2014, ha empezado a impartirse por vez primera la asignatura de Inmunología Aplicada e Inmunopatología, del Area de Inmunología del cuarto curso de Grado en Biología, que a la vez que analiza las múltiples aplicaciones de la Inmunología en distintos campos de la Biotecnología y la Biomedicina, estudia con detalle aspectos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos de las principales enfermedades de base inmunológica. Con esta red, pretendemos aprovechar la experiencia acumulada durante el pasado año con la asignatura de Inmunología General, impartida en tercer curso del Grado en Biología, para asegurar la adecuada coordinación entre el profesorado de las dos asignaturas actuales y fomentar el trabajo en equipo, buscando con ello cumplir con las competencias previstas descritas en las guías docentes de ambas asignaturas.

Tesis inédita presentada en la Universidad Europea de Madrid. Facultad de Ciencias Biomédicas. Programa de Doctorado en Biomedicina y Ciencias de la Salud, La enfermedad arterial periférica (EAP) es una enfermedad arterial inflamatoria crónica que se inicia con la pérdida de las funciones homeostáticas del endotelio. Esta disfunción endotelial se ha asociado con una disminución de la bioactividad del óxido nítrico (NO). En este contexto, los anticuerpos anti-beta2-glicoproteína I (ABGPI) se encuentran elevados en la EAP e inducen una sobreexpresión de moléculas de adhesión y de citoquinas proinflamatorias por el endotelio. El patrón de activación endotelial sustentado por los ABGPIs es similar al obtenido tras la activación de los receptores Toll-Like (TLR) del sistema inmune. Los subtipos TLR2 y TLR4 se han asociado de forma consistente con la aterosclerosis. El objetivo principal de esta tesis es el de investigar una hipotética asociación entre los títulos de ABGPI y la expresión génica de los receptores pro-aterogénicos TLR2 y TLR4 del sistema inmune presentes en las células endoteliales, tras la exposición de un cultivo celular a suero de pacientes con EAP seropositivos para ABGPI. Métodos: Compendio de cinco artículos originales. Los tres primeros estudios fueron observacionales y se realizaron en humanos. Su objetivo fue el de identificar una eventual relación entre los ABGPIs circulantes y los eventos patogénicos primarios de la EAP. Se incluyeron pacientes con EAP y sujetos sanos control pareados con los casos. Se determinó la dilatación braquial mediada por flujo (DBMF) como estimador de la función endotelial. El metabolismo del NO fue evaluado a través de la determinación de los niveles de nitritos plasmáticos. Se midieron los niveles de proteína c-reactiva y el recuento de células blancas periféricas. Los ABGPIs fueron detectados en suero mediante inmunofluorescencia indirecta. Los dos últimos estudios fueron experimentales y se llevaron a cabo usando suero humano no fraccionado y un cultivo de células endoteliales de aorta humana. El objetivo de estos estudios fue el de investigar una posible relación entre los títulos de ABGPI y la expresión génica de los receptores pro-aterogénicos TLR2-TLR4 y de sus efectores intracelulares MyD88-IRAK1, tras la estimulación del cultivo celular con suero de pacientes con EAP seropositivos para el autoanticuerpo. Resultados: En los estudios en humanos se observó que los títulos de ABGPIs circulantes se encuentran elevados en pacientes con EAP. Los títulos de ABGPI se asociaron con una menor DBMF y con unos mayores niveles de nitritos plasmáticos y de proteína c-reactiva. El recuento de monocitos fue mayor en pacientes con altos títulos de ABGPI. Los estudios realizados en cultivo celular demostraron que la estimulación de células endoteliales sanas con suero humano seropositivo para ABGPI obtenido de pacientes con EAP, induce un aumento de la expresión génica del receptor TLR4 y de su molécula de señalización celular MyD88 por las células endoteliales. Conclusiones: Los ABGPIs circulantes se encuentran elevados en pacientes con EAP y se asocian con la disfunción endotelial, la alteración del metabolismo del NO y el proceso inflamatorio que acontece desde las fases iniciales de la enfermedad. Además, la actividad transcripcional de TLR4 y de su proteína de diferenciación mieloide (MyD88) en el cultivo de células endoteliales se relaciona con los títulos de los ABGPIs presentes en el suero de los pacientes con EAP. Estos hallazgos sugieren una novedosa vía de activación de la aterosclerosis en pacientes con EAP. [Resumen Teseo], UEM