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O câncer de próstata é o segundo tipo de neoplasia que mais afeta homens no Brasil. De acordo com o Instituto Nacional de Câncer (INCA), em 2020 surgirão mais de 65 mil novos casos desta doença. Uma via eficiente para o tratamento deste câncer é a partir da produção de radiofármacos que se ligam especificamente ao antígeno de membrana prostático específico (PSMA), superexpresso nas células cancerígenas. Este trabalho estudou a radiomarcação do PSMA-617 com lutécio-177 de atividade específica distinta, em função da rota de produção (com ou sem carregador) e o efeito in vitro e in vivo nas propriedades do radiofármaco. Também foi estudado o escalonamento de lotes piloto de produção do PSMA-617-177Lu (sem carregador), que demonstrou a viabilidade na produção de lote contendo até 4 doses terapêuticas do PSMA-617-177Lu. O trabalho apresenta proposta de um kit para marcação, a partir do estudo da estabilidade de armazenamento dos constituintes da radiomarcação. A estabilidade das doses terapêuticas foi estabelecida por até 48 horas, mediante congelamento do produto, em embalado de transporte, que viabilizará o envio do radiofármaco para regiões distantes do local de produção. O estudo de saturação in vitro demonstrou que a maior atividade específica do radiofármaco resultou em valor de Kd (constante de dissociação) significativamente inferior. No ensaio de competição observou-se que, independentemente da atividade específica estudada, o bloqueio da ligação do PSMA-617-177Lu no PSMA expresso foi semelhante. No ensaio de internalização verificou-se porcentagens semelhantes, a despeito da atividade específica de marcação. Os perfis de clareamento sanguíneo foram semelhantes, assim como o perfil de biodistribuição não foi afetado em função da atividade específica de marcação do PSMA-617-177Lu. Contudo, observou-se um retardo na eliminação do PSMA-617-177Lu de órgãos viscerais não alvo (fígado, baço, pâncreas) na marcação com menor atividade específica. Este estudo atestou a estabilidade do PSMA-617-177Lu in vivo, pois não se observou incremento da captação óssea (177LuCl3 possuí tropismo por osso), para ambas as atividades especificas estudadas. Os ensaios com camundongos com tumor de próstata revelaram captação tumoral semelhante, independentemente da atividade específica, contudo observou-se melhor relação tumor/sangue, órgãos e tecidos de interesse com PSMA-617-177Lu com menor atividade específica. O estudo de bloqueio apresentou, para ambas as atividades específicas, redução expressiva na captação tumoral e renal dos radiofármacos. Concluiu-se que a variação da atividade específica de marcação do PSMA-617 não afetou a especificidade de ligação tumoral e a escolha do lutécio-177 (com ou sem carregador) poderá basear-se em fatores como a disponibilidade do radioisótopo e os custos de produção envolvidos. Accordingly, to Instituto Nacional do Cancer (INCA) prostate cancer is the second type of malignant disease that most affects men in Brazil. More than 65,000 new cases are expected in 2020. Prostate cancer cells overexpress PSMA, which make it radiopharmaceuticals that specifically bind to PSMA an efficient route for treatment. This work evaluated the effect in vitro and in vivo of two different specific activities of the 177Lu-PSMA-617 based on lutetium-177 route production (with or without carrier added). In addition, the feasibility of production up to 4 therapeutic doses were demonstrated at the scheduling of pilot batches of 177Lu-PSMA-617 (non-carried added). Based on the stability of the therapeutic doses, a prompt kit for radiolabeling was presented in this work. It will be possible to send the radiopharmaceutical to distant regions from the IPEN due to the stability of froze therapeutic doses in a transport package stablished up to 48 hours. The higher specific activity of the radiopharmaceutical showed a lower dissociation constant (Kd value) with statistical significance in the saturation assay. Regardless the specific activity studied, the molar concentration of 177Lu-PSMA-617 was similar in the competition assay. Independent of the specific activity, similar percentages of 177Lu-PSMA-617 were internalized at the internalization assay. Pharmacokinetic and biodistribution profiles were similar, regardless of the specific activity of the radiopharmaceutical. The lower specific activity resulted in a delay in the elimination of 177Lu-PSMA-617 from non-target visceral organs (liver, spleen and pancreas). For both specific activities studied were attested the stability in vivo of 177Lu-PSMA-617, once there was no increase in bone uptake (177LuCl3 has bone tropism). Similar uptakes of 177Lu-PSMA-617 are observed, independent of the specific activity studied, however a better ratio tumor/blood, tissue and specific organs of interest were noticed with the 177Lu-PSMA-617 at the lower specific activity in the biodistribution tumor model. A significant reduction in tumor and renal uptakes of the radiopharmaceutical, for both specific activities, were observed at the in vivo blocking assay. In conclusion, independent of the specific activity of the 177Lu-PSMA-617 studied (with or without carrier added), it was observed similar tumors uptakes. The costs involved in the production of the radiopharmaceutical and the availability of the radioisotope should be used in the choice of lutetium-177 (with or without carrier added).

Submitted by Pedro Silva Filho (pfsilva@ipen.br) on 2019-06-21T12:51:23Z No. of bitstreams: 0 Made available in DSpace on 2019-06-21T12:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Funda????o de Amparo ?? Pesquisa do Estado de S??o Paulo (FAPESP) Comiss??o Nacional de Energia Nuclear (CNEN) O carcinoma de c??lulas renais (CCR) ?? respons??vel por, aproximadamente, 1 a 3% das neoplasias malignas humanas e, dentre os tumores urol??gicos, ?? o mais agressivo. A heterogeneidade biol??gica, a resist??ncia aos f??rmacos e os efeitos colaterais ?? quimioterapia s??o os maiores obst??culos ao tratamento eficaz do CCR. V??rias mol??culas v??m sendo correlacionadas com o fen??tipo agressivo deste tumor, sendo uma delas o fator de transcri????o NF-kB. Estudos demonstraram a ativa????o de NF-kB no CCR e muitos apontaram NF-kB1 (p50) como uma mol??cula importante na progress??o tumoral e met??stase. Neste trabalho, foi utilizada a t??cnica de silenciamento g??nico de interfer??ncia por RNA - Short hairpin RNA (shRNA) - para diminuir a express??o de NF-kB1 em c??lulas murinas de carcinoma de c??lulas renais (Renca). Verificou-se que, in vitro, a diminui????o da express??o do gene NF-kB1 reduz a capacidade proliferativa das c??lulas Renca e aumenta a taxa de apoptose tardia/necrose e a quantidade de c??lulas na fase G2/M do ciclo celular. Al??m disso, as an??lises de Western blot revelaram aumento significativo da express??o proteica de Ciclina B1 e Bax. A regula????o negativa da p50 tamb??m alterou a capacidade clonog??nica das c??lulas que, conjugada ?? irradia????o ionizante, levou ?? diminui????o significativa da fra????o de sobreviv??ncia das c??lulas Renca e diminuiu a viabilidade celular verificada atrav??s do ensaio de MTS. Os ensaios in vivo mostraram que as c??lulas com baixa express??o de NF-kB1 (Renca-shRNA- NF-kB1) apresentam tumorigenicidade significativamente menor que as c??lulas controle e as an??lises de imunohistoqu??mica mostraram aumento significativo das ??res necr??ticas dos tumores Renca-shRNA-NF-kB1, al??m da diminui????o da marca????o de Ki-67, um marcador de prolifera????o celular. Os resultados indicam que a diminui????o da express??o de NF-kB1 pode suprimir a tumorig??nese do CCR, induzindo apoptose tardia/necrose, podendo ser um potencial alvo terap??utico para este carcinoma. Disserta????o (Mestrado em Tecnologia Nuclear) IPEN/D Instituto de Pesquisas Energ??ticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP FAPESP: 14/19265-7 CNEN: 95/SEFESP 01/2016

A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89μg/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas. Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to alleviate or cure a disease. Retroviral vectors are a tool for gene transfer is widely used. Bicistronic vectors are an attractive alternative for treatment of complex diseases. A variety of options exists to simultaneously express two genes in genetically modified cells. The most common approach relies on bicistronic vectors in which the genes are linked to each other by an internal ribosome entry site allowing co-translational expression of both cistrons. Endostatin, the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in anti-angiogenic in a variety of experimental tumor models, and clinical trials to test it as an anti-tumor agent are already under way. Immunotherapy has been used as adjuvant treatment for tumors and has been used in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was to construct and characterize in vitro an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding endostatin and intereukin-2. The construction of the vector was performed in three stages, the final construction was analyzed by restriction analysis and sequencing. Packaging cells were prepared. The endostatin and interleukin-2 levels were determined by Dot blot. Monocistronic and bicistronic mRNA expression were analyzed by real time RT-PCR. Bicistronic vector showed high levels of virus trites, ranging from 4.20x105 to 1.53x106UFC/mL. Secreted levels of endostatin and interleukin-2 ranged from 1.08 to 2.08μg/106cells.24h and 0.66 - 0.89g/106cells.24h, respectively. The mRNA expression of ES in the NIH3T3 clone pLend-IRES-IL2SN was 2 times higher than the level presented by the NIH3T3 clone pLendSN. The endostatin promoted inhibition (40%) of endothelial cell proliferation. Interleukin-2 promoted a proliferation of 10.6% lymphocytes CD4 and 8.9% of CD8. We conclude that the IRES bicistronic vector provides a powerful tool for studies of cell biology of cancer and new therapeutic strategies.