Search

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Neurocisticercose (NC) é uma infecção parasitária, causada pela forma metacestódea de Taenia solium que acomete o sistema nervoso central. Devido à gravidade do quadro clínico da NC há a necessidade de aperfeiçoar o diagnóstico por meio da busca de fontes antigênicas novas e alternativas. Esse estudo teve como objetivo analisar frações antigênicas de metacestódeos de Taenia saginata, por proteômica e aplicar estes antígenos em plataformas diagnósticas na NC humana. O extrato salino (ES) de metacestódeos de T. saginata foi fracionado por cromatografia de gel filtração (resina Sephacryl S-100) e cromatografia de troca iônica em resinas (carboximetil-sepharose (CM) - trocadora catiônica e dietilaminoetil-sepharose (DEAE) - trocadora aniônica). As frações F1 e F2 (gel filtração) e CMS1, CMS2, DEAES2 e DEAES2 (troca iônica), foram obtidas. O ES e suas frações foram avaliados em eletroforese 1D (F1, F2 e DEAES2) e 2D (DEAES2) para caracterização do perfil proteico e testados por ELISA e/ou immunoblotting (1D e/ou 2D) em amostras de soro e/ou líquor de pacientes com NC (G1), com outras infecções parasitárias ou desordens neurológicas (G2) e indivíduos saudáveis (G3) para detecção de anticorpos IgG. Os parâmetros de diagnóstico: sensibilidade (Se), especificidade (Es), área sob a curva (AUC) e likelihood ratios (LR + e LR-) foram calculados. A identificação de proteínas de interesse foi realizada por espectrometria de massas (MS) após seleção das frações obtidas por ELISA e/ou immunoblotting (1D e/ou 2D). A predição de epítopos de célula B também foi realizada. DEAES2 foi utilizada como sonda para o desenvolvimento de um imunossensor utilizando amostras de líquor. A fração F1 apresentou bandas polipeptídicas de 64-68 kDa. A fração F1 apresentou os melhores parâmetros de diagnóstico, em relação ao ES (Se: 93,3% e 84,4%; Es: 93% e 86%; AUC: 0,990 e 0,928; LR+: 13,42 e 6,07 e LR-: 0,07 e 0,18, respectivamente) no immunoblotting quando esta fração foi testada com pool de amostras do G1 houve um forte reconhecimento. Duas proteínas foram identificadas: enolase [Taenia multiceps] e calreticulina [T. solium], e essas proteínas apresentaram 18 e 10 epítopos de célula B preditos, respectivamente. Duas bandas proteicas foram identificadas em F2 (F2a - 20 kDa e F2b - 15 kDa). A análise por MS identificou duas proteínas: mioglobina [fios taurus] (F2a) e glicoproteína de 8 kDa [T. multiceps] (F2b), que apresentaram três epítopos preditos. O ELISA utilizando a fração F2 apresentou melhores parâmetros de diagnóstico (Se: 80,0%; Es: 90,5%; AUC: 0,954; LR+: 8,42 e LR-: 0,22), em relação ao ES. DEAES2 (64-68 kDa), apresentou parâmetros de diagnóstico similares ao líquido de vesícula de T. solium, em amostras pareadas de soro e líquor. O perfil eletroforético bidimensional revelou 24 spots. Após o immunoblotting 2D, utilizando pool de líquor de pacientes do G1 e G2, dois spots (1-pI 5,4; > 70 kDa e 2-pI 5,4; > 50kDa) foram selecionados para análise por MS. Três proteínas promissoras para o diagnóstico da NC foram identificadas: small heat-shock; putative growth regulator 14-3-3 e calreticulina [T. solium]. O imunossensor imobilizado com DEAES2 apresentou resultados relevantes quando utilizado compósitos de ZnO com Ag2O (ZnO:Ag2), 0,9%. Os resultados de voltametria de pulso diferencial (DPV) revelaram picos de intensidade de corrente elétrica: 1,74 pA (G1) e 1,30 pA (G2). Concluiu-se que importantes proteínas das frações antigênicas obtidas por técnicas cromatográficas foram identificadas com potencial aplicação em plataformas imunodiagnósticas na NC humana. Neurocysticercosis (NC) is a parasitic disease that affects the central nervous system and is caused by Taenia solium metacestodes. Due to the seriousness of the clinical picture on NC there is a need to improve diagnosis through the search of new and alternative antigenic sources. This study aimed to analyze antigenic fractions from Taenia saginata metacestodes by proteomic tools and apply these antigens in diagnostic platforms to human NC. Saline extract (SE) from T. saginata metacestodes was fractionated by: gel filtration (Sephacryl S- 100 resin) and ion exchange (carboximetil-sepharose (CM) - cationic exchanger and dietilaminoetil-sepharose (DEAE) - anionic exchanger) chromatography. Six antigenic fractions were obtained: F1 and F2 (gel filtration) and CMS1, CMS2, DEAES1 and DEAES2 (ion exchange). SE and its fractions were evaluated by 1D (F1, F2 and DEAES2) and 2D (DEAES2) electrophoresis for proteic profile characterization and tested by ELISA and/or immunoblotting (1D and/or 2D) using serum or cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC (G1), other parasitic diseases or neurologic disorders (G2) and healthy individuals (G3) to detect IgG antibodies. Diagnostic parameters: sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC) and likelihood ratios (LR + and LR-) were calculated. Identification of proteins from interest was done by mass spectrometry (MS), after selection of the best fractions by ELISA and/or immunoblotting (1D and/or 2D). The prediction of B cell epitopes was also done. DEAES2 was also used as a probe to develop an immunosensor using CSF samples. F1 presented proteic bands from 64-68 kDa. F1 achieved the best diagnostic parameters when comparing to ES, (Se: 93.3% and 84,4%; Sp: 93% and 86%; AUC: 0.990 and 0.928; LR+: 13.42 and 6.07 and LR: 0.07 and 0.18, respectively), in immunoblotting when testing this fraction with pool of samples from G1 there was strong recognition. Two proteins were identified: enolase [Taenia multiceps] and calreticulin [T. solium], these proteins presented respectively, 18 and 10 predicted epitopes. Two proteic bands were identified on F2 (F2a - 20 kDa and F2b - 15 kDa). MS analyses identified two proteins: mioglobin [Bos taurus] (F2a) and a 8 kDa glicoprotein [T. multiceps] (F2b), which presented 3 predicted epitopes. ELISA using F2 presented great diagnostic parameters (Se: 80%; Sp: 90,5%; AUC: 0.954; LR+: 8.42 and LR-: 0.22) if compared with ES. DEAES2 (64-68 kDa), presented diagnostic parameters similar to those achieved when testing vesicular fluid from T. solium metacestodes using serum and CSF paired samples. The bidimensional electrophoretical profile revealed 24 spots. After 2D immunoblotting, using pool of CSF samples from patients from G1 and G2 two spots (1-pI 5.4; > 70 kDa and 2-pI 5.4; > 50kDa) were selected for MS analyses. Three promising proteins for NC diagnosis were identified: small heat-shock; putative growth regulator 14-3-3 and calreticulin [T. solium]. The immunosensor using DEAE S2 presented relevant results when using ZnO with Ag2O (ZnO:Ag2), 0,9% composites. Differential pulse voltammetry (DPV) results revealed peaks of electric intensity: 1.74 pA (G1) and 1.30 pA (G2). It can be concluded that important proteins on the antigenic fractions obtained by chromatographic techniques were identified with potential application on immunodiagnostic platforms for human NC. Tese (Doutorado)

INTRODUCTION: Considering that alternative antigens for diagnosing neurocysticercosis continue to be a challenge because of the increasing difficulty in obtaining parasites from naturally infected pigs for preparation of Taenia solium homologous antigen, the aim of the present study was to evaluate the detergent (D) and aqueous (A) fractions from saline extract of Taenia saginata metacestodes for diagnosing neurocysticercosis. METHODS: Taenia saginata was obtained from naturally infected bovines in the Triângulo Mineiro region, State of Minas Gerais, Brazil. The carcasses came from cold storage units and had been slaughtered in accordance with the inspection technique recommended by the Federal Inspection Service. The D and A fractions were obtained by using Triton X-114 (TX-114). Serum samples were obtained from 40 patients with a diagnosis of neurocysticercosis, 45 with other parasitic diseases and 30 from apparently normal individuals. IgG antibody levels were evaluated using the ELISA and immunoblotting assays. RESULTS: The ELISA sensitivity and specificity were 95% and 73.3%, when using saline extract; 95% and 82.6% for the D fraction; and 65% and 61.3% for the A fraction, respectively. The immunoblotting assay confirmed the ELISA results, such that the D fraction was more efficient than the other extracts, and the 70-68kDa component was immunodominant among neurocysticercosis patients. CONCLUSIONS: These results demonstrated that the D fraction from Taenia saginata metacestodes obtained using TX-114 can be used as a heterologous antigenic fraction in the immunoblotting assay for serologically diagnosing human neurocysticercosis, given its ability to select immunodominant antigens. INTRODUÇÃO: Considerando que antígenos alternativos para o diagnóstico da neurocisticercose (NC) continua sendo um desafio devido ao aumento da dificuldade em se obter parasitas de suínos naturalmente infectados, para a preparação do antígeno homólogo de Taenia solium, o objetivo do presente estudo foi avaliar frações detergente (D) e aquosa (A), do extrato salino de metacestódeo de Taenia saginata para diagnóstico da NC. MÉTODOS: Bovinos, naturalmente infectados com Taenia saginata, procedentes da região do Triângulo Mineiro, Estado de Minas Gerais, Brasil, foram obtidos de frigoríficos e abatidos de acordo com a técnica de inspeção recomendada pelo Serviço de Inspeção Federal. As frações D e A foram obtidas utilizando Triton X-114 (TX-114). Amostras de soro foram obtidas de 40 pacientes com diagnóstico de NC, 45 com diagnóstico de outras doenças parasitárias e 30 de indivíduos aparentemente normais. Níveis de IgG foram avaliados pelos testes ELISA e Imunoblotting. RESULTADOS: A sensibilidade e especificidade do teste ELISA foram 95% e 73,3%, quando utilizado o extrato salino, 95% e 82,6% para fração D, e 65% e 61,3% para a fração A, respectivamente. O ensaio Imunoblotting confirmou os resultados do teste ELISA, sendo a fração D mais eficiente que os outros extratos, observando-se que o componente 70-68kDa se comportou como imunodominante para os pacientes com NC. CONCLUSÕES: Estes resultados demonstraram que a fração D de metacestódeo de Taenia saginata obtida com TX-114 pode ser utilizada como fração antigênica heteróloga pelo Imunoblotting para o diagnóstico sorológico da NC humana, considerando sua habilidade para selecionar antígenos imunodominantes.