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La obtención de doble haploides mediante ginogénesis es una novedosa técnica que se utiliza dentro del campo de la mejora vegetal, la cual se basa en la producción de embriones haploides a partir de células del gametofito femenino, siempre y cuando no haya ocurrido el proceso de fecundación. Una vez obtenidas las plantas haploides, se obtienen individuos doble haploides por un proceso de duplicación cromosómica que puede ser espontáneo o inducido y que da lugar a plantas homocigotas para todos sus loci. En este trabajo, se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica sobre las diferentes técnicas de ginogénesis que se utilizan en Cucumis melo y Cucumis sativus, dos de los cultivos más importantes dentro de la familia. La metodología comúnmente más empleada en C. melo para la obtención de plantas haploides es la técnica de ginogénesis in situ inducida por polen irradiado, a pesar del inconveniente que representan la adquisición del aparataje para la irradiación del polen. En el caso de C. sativus, la técnica más utilizada es la de ginogénesis in vitro basada en el cultivo de ovarios, por ser la más eficiente y requerir de una metodología más sencilla. En ambas especies, debido a los bajos porcentajes de generación espontánea de plantas doble haploides obtenidos, estas técnicas de ginogénesis suelen estar acompañadas de un tratamiento con colchicina como agente inductor de duplicación cromosómica que da lugar a plantas doble haploides que podrán ser utilizadas directamente como un nuevo cultivar, o como parentales para la obtención de híbridos comerciales. Abstract: Obtaining double haploids by gynogenesis is a innovative technique used within the field of plant improvement, which is based on the production of haploid embryos from the cells of the female gametophyte if the fertilization process has not occurred. Once haploid plants are obtained, double haploid individuals are obtained by a chromosomal duplication process which can be spontaneous or induced giving rise to homozygous plants for all its loci. In this work, a bibliographic review has been carried out on the different techniques of gynogenesis used in Cucumis melo and Cucumis sativus, two of the most important crops within the family of Cucurbits. The most used methodology in C. melo for obtaining haploid plants is the technique of in situ gynogenesis induced by irradiated pollen, despite the inconvenience of acquiring the equipment for pollen irradiation. In the case of C. sativus, the most used technique is in vitro gynogenesis which is based on the cultivation of ovaries, being the most efficient and requiring a simpler methodology. In both species, due to the low percentages of spontaneous generation of double haploid plants obtained, these gynogenesis techniques are usually accompanied by a colchicine treatment as a chromosomal duplication inducing agent which results in double haploid plants that can be used directly as a new cultivar, or as parents for obtaining commercial hybrids.

Flor yeasts of Saccharomyces cerevisiae have been extensively studied for biofilm formation, however the lack of specific haploid model strains has limited the application of genetic approaches such as gene knockout, allelic replacement and Quantitative Trait Locus mapping for the deciphering of the molecular basis of velum formation under biological ageing. The aim of this work was to construct a set of flor isogenic haploid strains easy to manipulate genetically. The analysis of the allelic variations at 12 minisatellite loci of 174 Saccharomyces cerevisiae strains allowed identifying three flor parental strains with different phylogenic positions. These strains were characterized for sporulation efficiency, growth on galactose, adherence to polystyrene, agar invasion, growth on wine and ability to develop a biofilm. Interestingly, the inability to grow on galactose was found associated with a frameshift in GAL4 gene that seems peculiar of flor strains. From these wild flor strains, isogenic haploid strains were constructed by deleting HO gene with a loxP-KanMX-loxP cassette followed by the removal of the kanamycin cassette. Haploid strains obtained were characterized for their phenotypic and genetic properties and compared with the parental strains. Preliminary results showed that the haploid strains represent new tools for genetic studies and breeding programs on biofilm formation.The inability to metabolize galactose was found to be a useful selectable marker in flor yeast strain development programs.The inability to metabolize galactose was found to be a useful selectable marker in flor yeast strain development programs.

[EN] The existence of the imprinting mechanism in zebrafish may be useful for studying the role this same phenomenon has in mammals. To try to figure out how the imprinting occurs in zebrafish, androgenote and gynogenote haploid larvae are built. Gynogenote haploid larvae are produced by fertilization of oocytes with UV light irradiated spermatozoa, and androgenote haploid larvae by UV light irradiated oocyte fertilized with sperm. Differences in the obtaining of these larvae are noted and the effectiveness of the applied radiation may be analyze. With the haploid larvae that survive after 24 hours and diploid larvae, cell cultures were performed. Using cultures derived from such larvae, somatic cell nuclear transplant experiments make it possible to assess the capacity of the oocyte to reprogram the nucleus from somatic haploid cells from already differentiated larvae., [ES] La existencia del mecanismo de imprinting en pez cebra puede ser útil para estudiar el papel que cumple este mismo fenómeno en mamíferos. Para intentar averiguar cómo tiene lugar el imprinting en el pez cebra, se construyen larvas haploides ginogenotas y androgenotas. Las larvas haploides ginogenotas se producen por fertilización de ovocitos con espermatozoides radiados con luz UV, y las larvas haploides androgenotas por fertilización de ovocitos radiados con luz UV con espermatozoides. Se observan diferencias en la obtención de estas larvas y se podrá analizar la eficacia de la radiación aplicada. Con las larvas haploides que sobrevivan tras 24 horas y con larvas diploides se realizan cultivos celulares. El uso de los cultivos derivados de tales larvas en experimentos de transplante nuclear de células somáticas, permitirá evaluar mejor la capacidad del ovocito para reprogramar el núcleo de células somáticas haploides procedentes de larvas ya diferenciadas.

La producción de doble haploides a través del cultivo de microsporas aisladas es una alternativa para obtener líneas puras mucho más eficaz que las técnicas de mejora genética clásica. Esta técnica presenta las ventajas de reducir considerablemente el tiempo y los recursos, materiales y humanos, necesarios para la obtención de líneas puras. En berenjena (Solanum melongena) esta técnica no está todavía puesta a punto. En este trabajo hemos conseguido optimizar esta técnica en berenjena, regenerando doble haploides de forma eficiente. Hemos demostrado también que tras la inducción, las microsporas forman embriones y que es en etapas más tardías de la embriogénesis cuando tiene lugar una desdiferenciación a callo. Los doble haploides regenerados fueron analizados mediante técnicas de citometría de flujo y marcadores moleculares, demostrando su origen androgénico. Ésta técnica ha sido aplicada a distintos genotipos de berenjena para seleccionar el que mejor responde a la inducción de androgénesis y a la regeneración. A partir del genotipo seleccionado, hemos ensayado una serie de factores que en otras especies tienen un efecto positivo en la inducción de androgénesis como son: butionin sulfoximina, ácido abcísico, epibrasinólido, fuentes de carbono alternativas a la sacarosa, osmóticos, cocultivo con microsporas de Brassica napus y goma arábiga. Con la mayoría de los factores se observaron efectos positivos a nivel de la respuesta androgénica, crecimiento o mejora en la calidad del material obtenido, llegando a obtener embriones en estadios más avanzados del desarrollo. Se ensayaron también métodos de disgregación mecánica del material obtenido, para la realización posterior de estudios de regeneración a planta completa de forma independiente del genotipo. Además de lo dicho, los resultados obtenidos abren nuevos caminos para continuar mejorando la eficiencia de los cultivos de microsporas de berenjena, y conseguir la obtención de doble haploides de forma rutinaria para su uso en programas de mejora.

A modification of a protocol used to induce tobacco microspore embryogenesis was tested in eggplant (Solanum melongena L.). In tobacco, uninucleate microspores are subjected to stress treatment by culturing in mannitol containing "B" medium at 33ºC for six days. The microspores are then transferred to maltose containing AT3 medium for further development. In the experiment presented here late uninucleate and bi-nucleate microspores of the eggplant cultivar Bambino were pre-cultured in B medium and then incubated at +4ºC, 25ºC and 33ºC, respectively, for two days. After the pre-treatments, microspore cultures were transferred to AT3 medium containing 0.25 M maltose and maintained at 25ºC in the dark. Presence of symmetrical division and multinucleate structures was checked with DAPI staining of the nucleus after one and two weeks. Symmetrical division of the nucleus and multinucleate structures were observed only in uni-nucleate microspores pre-treated at 33ºC for two days. The frequency of multinucleate structures was 19.4% under these conditions. We demonstrated that eggplant is responsive to the modified tobacco protocol in the production of symmetrically division and multinucleate structures. These results may be used as a basis for adaptation fully of the tobacco system in eggplant. Uma modificação de um protocolo utilizado para induzir embriogênese a partir de micrósporos de tabaco foi testada em berinjela (Solanum melongena L.). Em tabaco, micrósporos uninucleados são submetidos a um tratamento de estresse em meio "B" contendo manitol a 33ºC por seis dias. Os micrósporos são então transferidos para um meio AT3 contendo maltose para as fases posteriores de desenvolvimento. Neste estudo, micrósporos uninucleados e binucleados tardios do cultivar de berinjela Bambino foram pré-cultivados em meio "B" e, posteriormente, incubados a 4ºC, 25ºC e 33ºC por dois dias. Após os pré-tratamentos, as culturas de micrósporos foram transferidas para o meio AT3 contendo maltose 0,25 M e mantidas a 25ºC no escuro. A presença de divisão simétrica e estruturas multinucleadas foram verificadas com coloração DAPI do núcleo após uma e duas semanas. Foram observadas divisões simétricas dos núcleos e estruturas multinucleadas somente em micrósporos uninucleados, pré-tratados a 33ºC por dois dias. A frequência de estruturas multinucleadas foi de 19,4% sob essas condições. Nós demonstramos que a berinjela responde ao protocolo modificado de tabaco para produção de divisões simétricas e estruturas multinucleadas. Esses resultados podem ser utilizados como base para uma completa adaptação do sistema de tabaco em berinjela.

En la actualidad se cuenta con un protocolo de regeneración de plántulas de onoto, Bixa orellana L., mediante la embriogénesis somática (ES) a partir del cultivo de anteras, el cual ha sido probado eficientemente en varios genotipos. Con la finalidad de determinar si las plántulas obtenidas eran haploides, o si había ocurrido una duplicación espontánea de los cromosomas, se realizaron estudios citogenéticos a embriones normales y anormales, así como a plántulas cultivadas in vitro y plantas aclimatadas regeneradas por esta técnica en umbráculo. Se describen los procesos de prefijación, fijación, hidrólisis y tinción más eficientes para cada uno de los materiales evaluados. Las observaciones citológicas realizadas mostraron que fueron haploides (n=8 cromosomas), percibiéndose una gran estabilidad en el número cromosómico en las diferentes fases evaluadas. Estos estudios ponen en evidencia la importancia de obtener información relevante sobre la estabilidad genética que permitiría establecer protocolos con el uso de agentes mutagénicos (colchicina) en programas de mejoramiento en onoto donde se pretenda obtener plantas dihaploides ciento por ciento homocigotas, mediante la técnica de ES a partir del cultivo de anteras. At this time, a protocol for regeneration of plantlets through somatic embryogenesis from annatto, Bixa orellana L., anthers has been efficiently achieved in different genotypes. In order to verify if plantlets obtained were haploid or if spontaneous chromosome duplication had occurred, cytogenetic studies were made on normal and abnormal embryos, as well as on in vitro cultivated and acclimatized plants regenerated by this technique in the greenhouse. A description of the most efficient processes of prefixation, fixation, hydrolysis and dyeing for each genetic material evaluated is presented. According to mitotic countings, they were all haploids (n=8 chromosomes), showing great stability in chromosome number at different phases. These studies indicate the importance of obtaining relevant information on genetic stability in order to establish protocols using mutagenic agents such as colchicine in breeding programs where dihaploids annatto plants are to be obtained by means of somatic embryo techniques from anther culture.