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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. Tióis celulares estão entre os principais alvos das espécies reativas de oxigênio (ERO), portanto, estão no centro dos processos redox celulares. A oxidação de tióis proteicos pode levar à perda de função de enzimas, modulação de vias de sinalização e morte celular; assim, a manutenção do estado redox destes tióis é crucial para a homeostasia celular. Os sistemas da glutationa (GSH) e da tiorredoxina (Trx) são considerados os principais tampões redox celulares e são os principais sistemas envolvidos na manutenção do estado redox celular. A contínua reciclagem das formas oxidadas da GSH e Trx pelas enzimas glutationa redutase (GR) e tiorredoxina retudase (TrxR) é crucial para este processo, mantendo o contínuo fluxo de elétrons para peroxidases. A glutationa peroxidase (GPx) e as peroxirredoxinas (Prx) estão entre as peroxidases mais eficientes. As Prx são consideradas sensores de H2O2, participando de vias de sinalização redox, sendo o estado de oxidação de sua cisteína catalítica um marcador de estresse oxidativo. A perda da homeostasia redox tem sido correlacionada com diversas situações patológicas, como inflamação e câncer. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar a importância dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células contra oxidantes, além de estudar a modulação redox das Prx durante a fagocitose em neutrófilos. No primeiro trabalho investigamos o efeito de 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl] propionic acid (2-AAPA), um inibidor da GR, sobre parâmetros de viabilidade celular e balanço redox em células derivadas de glioblastoma humano A172. Nossos dados demonstram que o 2-AAPA, além de inibir a GR, também é um potente inibidor da TrxR. A inibição dessas enzimas por 2-AAPA diminuiu drasticamente a capacidade dessas células em metabolizar peróxidos orgânicos, deixando as células mais vulneráveis a este peróxido. 2-AAPA apresentou um perfil de toxicidade tempo- e concentração-dependente. A oxidação da Prx 1, Prx2 e Prx3 foi observada apenas na concentração tóxica de 100µM, após 30 min de incubação. 2-AAPA também causou uma severa disfunção mitocondrial, afetando o potencial de membrana e respiração acoplada a produção de ATP. Apresentamos evidências de que a oxidação de peroxirredoxinas e disfunção mitocondrial são eventos precoces na toxicidade de 2-AAPA a células A172. Coletivamente, esses dados reforçam a hipótese do papel central dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células a agentes oxidantes, e reforça a hipótese de que a inibição conjunta de GR e TrxR pode ser uma estratégia interessante para o tratamento de câncer. No segundo trabalho, estudamos a modulação redox de Prx durante o burst oxidativo em células pró-mielocíticas HL60 diferenciadas em neutrófilos. Demonstramos que a diferenciação dessas células com DMSO diminui a expressão da Prx2 de uma maneira tempo dependente, mas não alterou os níveis de Prx1, indicando um possível papel regulatório da Prx2 na diferenciação dessas células por DMSO. Enquanto isso, a diferenciação com ATRA não alterou os níveis de Prx2. A estimulação das células diferenciadas com forbol miristato acetato ou staphylococcus aureus induziu o burst oxiativo nas células diferenciadas, levando à oxidação da Prx1 de uma maneira tempo-dependente. A oxidação da Prx1 foi dependente da atividade da NADPH oxidase, já que a sua inibição aboliu esse efeito. Além disso, demonstramos que a inibição da NADPH oxidase por Diphenyleneiodonium chloride diminui a oxidação basal da Prx1. Por último, discutimos os resultados apresentados com dados obtidos em neutrófilos durante a minha estadia no Center for Free Radical Research da Nova Zelândia, sob orientação da Christine Winterbourn. Mostramos que as Prx estão completamente oxidadas em condições basais, um fenômeno nunca antes observado. Assim, apresentamos dados relevantes que podem ter implicações importantes para a sinalização redox e, consequentemente, para a função de células inflamatórias. De modo geral, os dados apresentados ressaltam a importância da modulação do ambiente redox na função e morte celular. Abstract : Thiol groups are amongst the main targets of reactive oxygen species (ERO), therefore they are at the center of all redox processes in the cell. Protein thiol oxidation can lead to loss of function, response signaling and cell death and, hence, the maintenance of thiols in cell is critical for cellular homeostasis. The glutathione (GSH) and thioredoxin (Trx) systems are the main redox buffers in cells. The continuous recycling of the oxidized forms of GSH and Trx is achieved by the action of glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), which keep the constant supply of electrons for the peroxidases. Among these, the peroxiredoxins (Prx) have a special role, acting as a peroxide sensor and marker of oxidative stress. The loss of redox homeostasis has been linked to several pathologies such as inflammation and cancer. Therefore, this work aims at study the importance of the GSH and Trx systems to cell protection against oxidants, and to analyze the redox modulation of Prx during inflammatory processes. In the first work, we investigated the effect of 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl]propionic acid (2-AAPA), an inhibitor of GR and TrxR, on parameters of cell viability and redox balance in A172 glioblastoma cells. The inhibition of these enzymes drastically reduced cell?s capacity to metabolized organic peroxides (but not H2O2) and, consequently, rendered cells more susceptible to organic peroxide. 2-AAPA also displayed a time and concentration dependent toxicity. We observed a marked oxidation of Prx 1, 2 and 3, as well as a severe mitochondrial dysfunction. Collectively, our results highlight the importance of GSH and Trx systems to cell?s protection against oxidants. Also, we present evidence that oxidation of Prx and mitochondrial dysfunction are early events in 2-AAPA toxicity to A172 cells. In the second work, we studied the redox modulation of Prx during oxidative burst in differentiated promyelocytic HL60 cells. We demonstrated that the differentiation of these cells to a neutrophil-like phenotype with dimethylsulfoxide (DMSO) greatlydiminished Prx2 expression in a time-dependent manner, but didn´t change Prx1 expression. Pharmacological stimulation or exposure to microbes induced the oxidative burst in the differentiated cells, leading to Prx1 oxidation in a time-dependent manner. Oxidation of Prx1 was dependent on NADPH oxidase, because inhibition of this enzyme abolished this effect. Furthermore, inhibition of the oxidase by Diphenyleneiodonium chloride reduced the basal oxidation of Prx1 in unstimulated cells. Lastly, we discuss the presented results with data obtained from human neutrophils during my stay at the Center for Free Radical Research in New Zealand under supervision of Christine Winterbourn. We show for the first time that the Prx are completely oxidized under unstimulated conditions. Therefore, the presented results may have important implications for the role of Prx in inflammatory cells function. Overall, this thesis highlights the central role of the modulation of the redox environment to cell function and death, as well as shows, for the first time, a Prx fully oxidized in unstressed conditions.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. O metilglioxal (MG) é uma toxina endógena sintetizada em diversas vias metabólicas, sendo a glicólise a principal delas. O aumento nos níveis de MG foi associado a transtornos de humor, como a depressão e a ansiedade, além de ser considerado um dos principais agentes causais do envelhecimento e de doenças neurodegenerativas. Contudo, não se sabe quais são os mecanismos moleculares envolvidos na indução desses efeitos. Assim, no presente trabalho foram avaliados os efeitos comportamentais e neuroquímicos após administração via intraperitoneal (i.p.) aguda e repetida de MG, em camundongos Swiss fêmeas, com 3 meses de idade. Os animais que receberam MG tiveram um aumento de imobilidade no teste da suspensão da cauda (TSC), tanto 15 minutos (25 - 200 mg/kg) ou 4 h após uma única administração de MG (10 e 25 mg/kg). Administrações repetidas de MG (1 injeção diária por 6 dias consecutivos de 10 e 25 mg/kg, seguida do TSC 24 h após a última injeção) também levou a um aumento no tempo de imobilidade no TSC. Este efeito tipo-depressivo não pode ser atribuído a uma alteração na atividade locomotora dos animais, uma vez que esta não foi afetada no teste do campo aberto. O MG 10 mg/kg induziu um efeito ansiolítico no TCA, uma vez que o tempo no centro foi aumentado 4 h após o tratamento com MG, o que já havia sido relatado na literatura. Este efeito ansiolítico também foi observado no teste da caixa claro/escuro, onde os animais tratados com MG (25 mg/kg) permaneceram mais tempo na área clara 4 h após a administração de MG. Este mesmo efeito foi observado no tratamento com doses repetidas de MG. As análises bioquímicas revelaram que o tratamento com MG (10 e 25 mg/kg) não é capaz de alterar os níveis de glutationa, e a expressão das enzimas glutamato-cisteína ligase, glutathiona redutase, glioxalase 1 e tiorredoxina redutase no hipocampo, estriado e cortex cerebral, exceto pelo aumento da atividade TrxR no hipocampo. O comportamento do tipo-depressivo induzido pelo MG não foi encontrado em outros trabalhos com injeção intracerebroventricular e por períodos prolongados, entretanto os testes comportamentais de forma aguda (15 min e 4 h) e administrações repetidas foram bastante consistentes. O conhecido efeito ansiolítico foi confirmado pelos nossos dados experimentais, cujo mecanismo de ação parece envolver os receptores GABAA. O conjunto de dados, juntamente com aqueles apresentados por outros autores, confirmam que o MG está envolvido com a modulação de comportamentos relacionados a depressão e a ansiedade em roedores. Adicionalmente, este trabalho mostrou que o9MG não é capaz de alterar os parâmetros bioquímicos relacionados às defesas antioxidantes 4 h após a sua administração. As buscas por mecanismos de ação do MG ainda precisam ser investigadas em estudos futuros. Abstract : Methylglyoxal (MG) is an endogenous toxin synthesized in several metabolic pathways, glycolysis is the main one. The increase in MG levels has been associated with mood disorders such as depression and anxiety, besides being one of the main causative agents of aging and neurodegenerative diseases. However, it is not known which are the molecular mechanisms involved in the induction of these effects. In the present study we evaluated the behavioral and neurochemical effects after intraperitoneal (i.p.) acute and repeated MG in Swiss female mice, 3 months old. The animals that received MG had an increased immobility time in the tail suspension test (TST) for both 15 minutes (25-200 mg / kg) or 4 h after a single administration of MG (10 and 25 mg / kg). Repeated administration of MG (1 injection daily for 6 consecutive days of 10 and 25 mg / kg, followed by the TSC 24 h after the last injection) also led to an increase in immobility time in the TST. Such depressant effect can not be attributed to a change in locomotor activity of the animals, since it was not affected in the open field test. The MG 10 mg / kg induced an anxiolytic effect on the OFT, since the time was increased in the center 4 h after MG treatment, which had already been reported in the literature. This anxiolytic effect was also observed in the light /dark box test where the animals treated with MG (25 mg / kg) remained longer in the light area 4 h after MG administration. This same effect was seen in treatment with repeated doses of MG. Biochemical analysis revealed that treatment with MG (10 and 25 mg / kg) is not capable of altering levels of glutathione, and expression of glutamate-cysteine ligase enzyme glutathione reductase, glyoxalase 1 and thioredoxin reductase in the hippocampus, striatum and cerebral cortex, except for increased TrxR activity in the hippocampus. The type-depressant behavior induced by MG has not been found in other studies with intracerebroventricular injection and for prolonged periods, though the behavioral tests acutely (15 min, 4 h) and repeated administration here were quite consistent. The known anxiolytic effect was confirmed by our experimental data, whose mechanism of action appears to involve the GABAA receptor. The data set, along with those presented by other authors, confirm that the MG is involved in the modulation of behaviors related to depression and anxiety in rodents. In addition, this study showed the MG is not able to change the biochemical parameters related to the antioxidant defenses 4 h after administration. The search for MG mechanisms of action still need to be investigated in future studies.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014 Com o aumento nos níveis de contaminação ambiental em nível global, organismos aquáticos estão sujeitos à ação tóxica de diversos xenobióticos, necessitando de eficientes sistemas de defesas para garantir sua sobrevivência. Neste trabalho, os bivalves Crassostreagigas (ostra do Pacífico) e Perna perna (mexilhão marrom) foram utilizados como organismos modelo para o estudo dos sistemas de defesas antioxidantes e de biotransfomação. Em um primeiro trabalho,as vias de biotransformação de fase II e do ácido mercaptúrico foram estudadas em ostras C. gigas expostas ao agente eletrofílico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Os dados apontam que a brânquia possui um robusto sistema de biotransformação, atuando como importante ponto de entrada para o CDNB e conjugando-o rapidamente com glutationa. A hemolinfa atuou como um transportador de metabólitos pelo organismo, permitindo que outros tecidos auxiliassem no processo de biotransformação e excreção, enquanto que a glândula digestiva atuou como um tecido auxiliar na metabolização. O derivado final da via do ácido mercaptúrico foi detectado como principal metabólito na água domar, comprovando sua excreção. Um segundo trabalho investigou o papel das enzimas antioxidantes glutationa redutase e tiorredoxina redutase em C. gigas e P. perna expostos a agentes oxidantes(hidroperóxido de cumeno e menadiona). Através de uma exposição aguda destes organismos a ZnCl2 ou CDNB, foi possível diminuir significativamente a atividade dessas enzimas, e consequentemente, afetando os sistemas de degradação de peróxidos dependentes das enzimas glutationa peroxidase e peroxirredoxina. Foi observada uma menor capacidade de degradação de peróxidos in vivo e maior mortalidade induzida por exposição ao peróxido de cumeno ou amenadiona. Estes resultados reforçam a ideia de uma maior susceptibilidade de organismos com um sistema antioxidante menos eficiente. O último estudo investigou a toxicidade de um contaminante emergente, nanopartículas de óxido de zinco (ZnONP), sobre ostras C.gigas. Neste trabalho foi observado que as ZnONP se agregam quando em água do mar, passando da escala nanométrica para micrométrica. Além disso, foi detectada uma alta taxa de liberação de zinco iônico na água do mar. A exposição de ostras a ZnONP por até 48 h causou acúmulo de zinco inicialmente na brânquia (24 e 48 h), seguido da glândula digestiva (48 h). Análises de microscopia eletrônica sugerem a presença de vesículas endocíticas contendo ZnONP em ambos os tecidos. Análises de marcadores antioxidantes e de estresse oxidativo apontam para um moderado efeito oxidativo das ZnONP no citosol, principalmente na brânquia após 48 h, causando peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e inibição da glutationa redutase. Porém, tanto as análises ultraestruturais quanto as bioquímicas apontam para fortes distúrbios mitocondriais, com alterações estruturais e oxidação de proteínas na brânquia e glândula digestiva. De modo geral, os estudos apontam que em bivalves: (i) ataques eletrofílicos podem ocorrer de maneira indiscriminada pelo organismo na ausência de um sistema de biotransformação íntegro na brânquia, (ii) danos oxidativos podem ser acumulados na ausência de um eficiente sistema antioxidante, afetando a sobrevivência do organismo e (iii) a mitocôndria de bivalves é susceptível a eventos oxidativos induzidos por ZnONP. Abstract: With the increasing level of global environmental contamination, aquatic species are subjected to the effects of different xenobiotics, relying on efficient cellular defenses systems to provide their survival. In this study, bivalves Crassostrea gigas (Pacific oyster) and Pernaperna (brown mussel) were used as model organisms to study the antioxidant and biotransformation systems. In a first study, the phase II biotransformation and mercapturic acid pathways were investigated inoysters C. gigas exposed to the electrophilic agent 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Data suggest that gill hold a robust biotransformation system, acting as an important site for CDNB uptake and quickly conjugating it with glutathione. The hemolymph allowed the transport of metabolites across the organism, allowing other tissues to aid on biotransformation and excretion processes. The digestive gland participated as a metabolizing ancillary tissue. The final product, mercapturic acid, was found as main metabolite in water, confirming its excretion by the organism. A second study investigated the role of the antioxidant enzymes glutathione reductase and thioredoxin reductase inC. gigas and P. perna exposed to oxidative agents (cumene hydroperoxide and menadione). Using an acute exposure to ZnCl2 orCDNB, enzymatic activity was considerably decreased, thus affecting the peroxide detoxification system of glutathione peroxidase and peroxiredoxin. These inhibitions jeopardized in vivo peroxide detoxification ability, inducing higher mortality on a further exposure to cumene hydroperoxide or menadione. These data reinforce the idea of a higher susceptibility in organisms with a less effective antioxidant system. The last study partially characterized the toxicity of an emerging contaminant, zinc oxide nanoparticles (ZnONP), to C. gigas. It was observed that ZnONP aggregate in seawater, changing from a nanometric to micrometric scale. Besides, it was detected a strong release of ionic zinc to seawater. Oysters exposure to ZnONP for up to 48 h caused zinc accumulation initially in gill (24 and 48 h), followed by digestive gland (48 h). Electron microscopy analysis suggests the presence of endocytic vesicles containing ZnONP in both tissues. Analysis of antioxidant and oxidative stress markers points to a moderate oxidant effect of ZnONP in the cytosol, especially in gills after 48 h, causing lipid peroxidation, protein oxidation and glutathione reductase inhibition. Nevertheless, both ultrastructural and biochemical analyses highlight a mitochondrial disturbance pattern, with structural alterations and protein oxidation in gill and digestive gland. In general, these studies allowed the conclusion that in bivalves, (i) electrophilic attacks can occur indiscriminately in the absence of a robust phase IIbiotransformation pathway in the gill, (ii) that oxidative damage can be accumulated in the absence of an effective antioxidant system, affecting animal survival, and (iii) bivalve mitochondria can be very susceptible to ZnONP.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. O trauma cranioencefálico (TCE) é uma patologia de grande impacto social e econômico. O TCE é a principal causa de mortalidade em pessoas com menos de 40 anos de idade. Desde os anos noventa do século 20, houve poucos avanços no tratamento e diagnóstico do TCE. Sabe-se que uma cadeia de eventos danosos, incluindo neuroinflamação, excitotoxicidade, disfunção do metabolismo mitocondrial e estresse oxidativo contribuem para a morte celular no TCE. O entendimento destes processos é essencial para projetarmos novas perspectivas de abordagem diagnóstica e terapêutica. Esta revisão tem por objetivo revisar a literatura e esclarecer qual é a correlação entre os dados envolvendo o estresse oxidativo e o traumatismo cranioencefálico, visando contribuir com novas perspectivas para a área. Esta revisão visa responder as seguintes perguntas: a) O estresse oxidativo está relacionado com o TCE? b) Marcadores de peroxidação lipídica são efetivos na avaliação e prognose no TCE? c) Quais estratégias antioxidantes estão sendo investigadas no TCE e qual é sua eficácia? e d) Quais as perspectivas para o uso de marcadores relacionados ao estresse oxidativo e de antioxidantes na prognose e tratamento do TCE? Desta forma, analisou-se a validade de se usar marcadores de peroxidação lipídica, enzimas antioxidantes, entre outros, na prognose do TCE. Também avaliamos estratégias antioxidantes testadas em estudos pré-clínicos e clínicos, apontando para novas perspectivas clínicas. Foi realizada revisão sistemática de publicações indexadas no Pubmed cruzando ?traumatic brain injury or head injury? com oxidative stress, Nrf2, antioxidant, glutathione e flavonoid. A base dedados foi filtrada focada nos objetivos e os principais resultados foram analisados. Há dados inequívocos da participação da peroxidação lipídica no dano induzido por TCE. A correlação dos marcadores de peroxidação lipídica com o prognóstico porém, não pode ser estabelecida. Um desses marcadores de estresse oxidativo, 8-iso-prostaglandina-F2a (8-iso-PGF2a), entretanto, apresentou grande correlação com o nível de severidade do trauma, e merece atenção em futuras pesquisas. As estratégias antioxidantes avaliadas até então, apesar de mostrarem algum sucesso pré-clínico, não foram bem sucedidas em ensaios clínicos. Perspectivas para futuros estudos podem incluir novos marcadores que poderão aumentar o poder preditivo de desfecho. Ativadores da via Nrf2/ARE, como é o caso de flavonóides, são uma estratégia neuroprotetora com boa perspectiva de sucesso. Isto baseado no fato de que estudos pré-clínicos foram bem sucedidos em demonstrar que a ativação desta via confere neuroproteção. Abstract : Traumatic brain injury (TBI) is a pathology of great social and economic impact. The TBI is the main cause of death in people under 40 years of age. Since the nineties of 20th century, there have been few advances in the treatment and diagnosis of TBI. It is known that a chain of damaging events, including neuroinflammation, excitotoxicity, mitochondrial metabolism dysfunction and oxidative stress contribute to cell death in the TBI. The understanding of these processes is essential for projecting new perspectives of diagnostic and therapeutic approach. This review aims to analyse data from to determine what is the correlation between the oxidative stress and traumatic brain injury, to contribute with new perspectives for the area. This review aims to answer the following questions: a) The oxidative stress is related to the TBI? b) The lipid peroxidation markers are effective in the evaluation and prognosis in TBI? c) What antioxidant strategies are being investigated in TBI and what is its effectiveness? and d) What are the perspectives for the use of markers related to oxidative stress and antioxidants on prognosis and treatment of TBI? We conducted systematic review of publications indexed in Pubmed including the terms "traumatic brain injury or head injury" and oxidative stress, antioxidant, glutathione, Nrf2 and flavonoids. The database was filtered focused on the objectives and the main results were analyzed. There is clear evidence of the involvement of lipid peroxidation in TCE-induced damage. The correlation of markers of lipid peroxidation with the prognosis, however, cannot be established. One of these markers, 8-iso-prostaglandin-F2 a (8-iso PGF2-a), however, showed high correlationwith the level of severity of the trauma, and deserves attention in future research. Antioxidants strategies assessed thus far, despite showing some pre-clinical success, have not been successfull in clinical trials. Prospects for future studies may include new markers that may increase the predictive power of outcome. Activators of via Nrf2ARE, as is the case of flavonoids, are neuroprotective strategy with good prospects of success. This based on the fact that pre-clinical studies have been successfull in demonstrating that the activation of this pathway confers neuroprotection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Florianópolis, 2011 As defesas antioxidantes e os sistemas de detoxificação podem ser modulados frente a contaminantes ambientais, dependendo do tempo e da intensidade da exposição, podendo levar a danos oxidativos. O objetivo deste trabalho é avaliar a resposta antioxidante e de adaptação celular de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas a ambientes contaminados na Bacia do Rio Cubatão do Norte, Joinville, SC, principal pólo industrial de Santa Catarina. O estudo foi desenvolvido em outubro de 2009 e de 2010, onde as tilápias (S3>S1=REF. Os níveis de HPAs e biliverdina na bile, de HPAs no sedimento, a atividade 7-etoxi-resorufina-O-desetilase (EROD) e a expressão do citocromo P450 1A (CYP1A), mostraram uma correlação positiva entre si. A elevação dos níveis de metabólitos de HPAs na bile indica um aumento na capacidade de metabolização e eliminação destes compostos. A maior metabolização poderia ser explicada pela indução da atividade da EROD associada ao aumento da expressão de CYP1A, especialmente no ponto S2. O decréscimo nos níveis de tióis do fígado e sangue, bem como, o aumento dos danos ao DNA indicam que após 2 dias de exposição houve aumento nos índices de estresse oxidativo nos animais dos 3 pontos de estudo, o que foi corroborado pelo aumento da clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1, 7 dias, S2). A restauração parcial do estado tiólico e de vários outros parâmetros, além da reversão nos danos ao DNA e a indução de peroxirredoxina 6 (Prx6, S2), indicam que houve uma resposta adaptativa aos 7 dias de exposição. As atividades tiorredoxina redutase (TrxR, 2 dias), glutationa redutase (GR, 7 dias) e colinesterásica (2 dias) diminuíram no ponto S1. Em 2009, as maiores alterações foram encontradas após 2 dias de exposição e relacionadas à depleção de grupos tióis, enquanto que as alterações enzimáticas aconteceram predominantemente em 2010, sugerindo uma diversidade de contaminantes e/ou de seu aporte. Este estudo mostrou que protocolos utilizando respostas antioxidantes, danos oxidativos e indução de CYP1A como biomarcadores de contaminação aquática foram complementares e eficientes em discriminar o grau de contaminação entre os vários pontos de estudo. Os dados comprovam que animais que habitam a região da Bacia do Rio Cubatão do Norte estão expostos a contaminantes de origem antrópica e que estes têm ação negativa sobre os indivíduos, necessitando de medidas corretivas a curto e longo prazo. Antioxidant defenses and detoxification systems may be modulated against environmental contaminants, depending on timing and intensity of exposure and may lead to oxidative damage. The aim of this study was to evaluate the antioxidant response and cellular adaptation of tilapia (Oreochromis niloticus) exposed to contaminated environments at Cubatão Basin, Joinville, SC, the main industrial area of Santa Catarina. The study was performed in October for two consecutive years (2009 and 2010). Tilapias ( S3> S1 = REF. The levels of PAHs and biliverdin in bile, PAHs in the sediment, 7-O-etoxiresorufina deetilase (EROD) activity and cytochrome P450 1A (CYP1A) expression presented good correlation. The high levels of PAH metabolites in bile indicates an increased ability to metabolize and dispose these compounds. The increased metabolization could be explained by the induction of EROD activity associated with increased CYP1A expression, especially at the site S2. The decrease in the levels of liver and blood thiols as well as an increase in DNA damage after 2 days of exposure are indicative of oxidative stress in animals from 3 studied sites, which is corroborated by the increased poly (ADP-ribose ) polymerase 1 (PARP1) cleavage (7 days, S2). The partial restoration of the thiol status and several other parameters, the reversal of DNA damage and peroxiredoxin 6 induction (Prx6, S2), indicate that there was an adaptive response after 7 days of exposure. The thioredoxin reductase (TrxR, 2 days), glutathione reductase (GR, 7 days) and cholinesterase (2 days) activities decreased at site S1. In the year 2009, most changes were found after 2 days of exposure and related to thiol status, whereas the enzyme changes occurred predominantly in 2010, suggesting a variety or diverse dosing of contaminants. This study showed that protocols using antioxidant responses, oxidative damage and CYP1A induction as biomarkers of aquatic contamination were complementary and efficient in discriminating the degree of contamination between the various sites of study. The data show that animals living in the Cubatão Basin, Joinville, SC, are exposed to contaminants of anthropogenic origin, producing a negative influence on individuals which requires corrective measures at short and at long term.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010 Estudo comparativo das atividades das enzimas antioxidantes catalase, glutationa peroxidase e peroxirredoxina em fatias de hipocampo de ratos, células de glioma de ratos (C6) e células de neuroblastoma de camundongos (N2a) expostas aos peróxidos de hidrogênio (H2O2) e cumeno (CuOOH).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 As espécies reativas de oxigênio (ERO), metabólitos secundários do metabolismo do oxigênio, são moléculas geradas e reguladas constantemente pela célula. O aumento na sua produção pode levar a inúmeros processos patológicos, e para evitar esses efeitos tóxicos das ERO a célula conta com um complexo sistema de defesas celulares, incluindo defesas antioxidantes. Esse sistema é bem estudado e caracterizado em eucariotos mais complexos, como os mamíferos, e em eucariotos mais simples, como as leveduras, mas ainda pouco se sabe sobre esse sistema e sua regulação em invertebrados marinhos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo estudar o sistema antioxidante de bivalves marinhos em situação de estresse oxidativo, e propor possíveis mecanismos de modulação e regulação redox nesses modelos animais. O trabalho foi dividido em dois experimentos: no primeiro, mexilhões azuis Mytilus edulis foram pré-expostos ao selênio (4µg/L) por 3 dias, e subseqüentemente expostos por mais 3 dias a cobre (56 µg/L). Neste experimento, objetivamos detectar se os efeitos oxidativos do cobre podem ser atenuados pela pré-exposição ao selênio. Vários parâmetros antioxidantes e de dano celular foram avaliados. Nesta primeira etapa, observou-se que o cobre causa oxidação de tióis protéicos (PSH) e inibição da enzima tioredoxina redutase (TrxR) na brânquia e induz danos no DNA em hemócitos. O selênio aumenta a atividade da enzima glutationa peroxidase dependente de selênio (GPx-Se) e os níveis de glutationa (GSH). Quando os animais são pré-expostos a selênio e expostos em seguida ao cobre, a pré-exposição ao selênio é capaz de neutralizar os efeitos deletérios desse metal, revertendo a oxidação dos PSH, evitando a indução de danos no DNA e revertendo parcialmente a inibição da TrxR. No segundo experimento, mexilhões Perna perna foram expostos por até 21 dias ao zinco (10 µM), um metal conhecido por afetar o metabolismo da glutationa. A exposição aguda (2 dias) ao zinco causou consumo de GSH e inibição da GR, porém estes valores retornam aos níveis basais após 7 e 21 dias de exposição. Os animais expostos por 7 e 21 dias ao zinco demonstram uma amplificação do sistema antioxidante, com aumento na atividade de diversas enzimas auxiliares (TrxR, GR) ou de detoxificação de ERO (catalase, glutationa peroxidase total, superóxido dismutase). Apesar disso, essa amplificação não impediu um aumento nos níveis de peróxidos citosólicos e nos índices de peroxidação lipídica evidenciados após a exposição por 7 ou 21 dias. O conjunto de dados desses dois experimentos demonstram a importância do sistema antioxidante para esses animais em situações de estresse oxidativo. O aumento dos níveis de GSH e da atividade da GPx-Se parecem ser uma importante via de proteção contra os danos oxidativos em mexilhões M. edulis, mediados pelo cobre. Já com relação ao zinco, o restabelecimento do metabolismo da glutationa, o qual é afetado pelo zinco, é fundamental para as células branquiais de mexilhões P. perna, o qual responde ao insulto oxidativo com uma forte resposta adaptativa de amplificação das defesas antioxidantes celulares.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Zinco na sua forma ionica livre e mantido em concentracoes muito baixas nas celulas de mamiferos. Em algumas vesiculas sinapticas de neuronios glutamatergicos, porem, ele pode ser encontrado em altas concentracoes, aonde atua como um modulador ionico. Em situacoes patologicas, porem, o zinco livre pode se acumular no citosol nas celulas neurais provocando diversos efeitos toxicos, tais como a inibicao de enzimas. O zinco e capaz de inibir as enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR) e tioredoxina redutase (TrxR), duas enzimas envolvidas na defesa celular contra oxidantes. Essa inibicao, portanto, pode resultar em um decrescimo na degradacao de peroxidos, levado a uma maior vulnerabilidade a danos oxidativos. O presente trabalho tem como objetivo investigar a relacao da inibicao das enzimas antioxidantes GR e TrxR, pela exposicao de celulas neurais ao zinco, com a susceptibilidade destas celulas quando desafiadas com agentes oxidativos. Celulas derivadas de neuroblastoma (N2a), astroglioma (C6) e fatias de hipocampo de ratos adultos foram pre-incubadas com 100 uM de ZnCl2 por 30 min, e em seguida expostas por uma hora a 100 uM de H2O2 ou 100 uM de peroxido de cumeno. O tratamento com ZnCl2 provocou uma queda na atividade da GR nos 3 modelos, sendo que as celulas C6 foram mais afetadas (77% de inibicao comparado com 30-35 % nos outros modelos). A enzima TrxR tambem foi inibida em 30% nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a e fatias de hipocampo, esse efeito nao foi observado. O tratamento com ZnCl2 diminuiu a taxa de consumo de H2O2 e CHP nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a somente o consumo de H2O2 foi afetado. Em celulas N2a, tanto o tratamento com ZnCl2 como com H2O2 provocaram uma diminuicao na viabilidade celular, porem a combinacao de ambos nao aumentou esta toxicidade. As celulas C6 foram resistentes aos efeitos toxicos dos peroxidos e ZnCl2, porem, o pre-tratamento com ZnCl2 aumentou a susceptibilidade dessas celulas a toxicidade de ambos os peroxidos, diminuindo a viabilidade, aumentando a permeabilidade celular e o dano ao DNA. O ZnCl2 nao aumentou a vulnerabilidade das fatias de hipocampo a toxicidade dos peroxidos, porem, quando estas foram expostas a 1 mM de H2O2, em combinacao com ZnCl2, houve queda na viabilidade celular na mesma proporcao causada pelo pre-tratamento com BCNU, um inibidor da GR. Neste caso, supoe-se que esta queda na viabilidade e devido a inibicao da GR. Em conclusao, os dados apresentados demonstram que, apesar da alta susceptibilidade das células neuronais (N2a) ao ZnCl2 e aos peróxidos, a inibição da GR não aumentou esta sensibilidade. Por outro lado, as células derivadas de astrócitos (C6) foram mais resistentes ao ZnCl2 e aos peróxidos, porém a inibição da GR e da TrxR pelo tratamento com zinco aumentaram a citotoxicidade de ambos os peróxidos. Nas células C6, o sinergismo entre a inibição das enzimas antioxidantes e a toxicidade aos peróxidos, provavelmente se deve a menor capacidade em degradar peróxidos. Desta forma, nosso dados indicam que a inibição de enzimas antioxidantes GR e TrxR é um fator importante associado a sua toxicidade em células neurais. Zinc in its free, ionic form is kept in very low concentrations in mammalian cells. In some synaptic vesicles in glutamatergic neurons, however, it can be found in high concentrations where it acts as an ionic modulator. In pathological situations, however, this free zinc can accumulate in the cytosol of neural cells producing a myriad of toxic effects, such as the inhibition of enzymes. Zinc can inhibit glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), both antioxidant enzymes that are crucial for cell protection against oxidants. Therefore, a disturbance in the activity of these enzymes hinder peroxide degradation and increases vulnerability to oxidative damage. The present work aims to investigate the relation between the inhibition of these enzymes by zinc and the susceptibility of neuronal and astrocytic cells, as well as hippocampal slices, to H2O2 and cumene peroxide (CHP). Cells derived from neuroblastoma (N2a), astroglyoma (C6) and hippocampal slices were pre-incubated with 100 uM of ZnCl2 for 30 min, and then exposed to 100 uM of H2O2 or CHP for 1h. Treatment with ZnCl2 decreased GR activity in the three models, but this effect was higher in C6 cells (70 % of inhibition in comparison to 30-35 % of inhibition in the other models). TrxR was inhibited by 30 % in C6 cells, while in N2a and hippocampal slices this effect was not observed. Treatment with Zn decreased H2O2 and CHP consumption rate in C6 cells, but only H2O2 consumption rate was reduced in N2a cells. Both ZnCl2 and H2O2 treatment induced a decrease in cellular viability in N2a cells, but their combination did not enhance this toxicity. C6 cells were more resistant to toxic effects of ZnCl2 and peroxides, however, the preincubation with ZnCl2 increased cell vulnerability to both peroxides, decreasing cell viability, increasing membrane permeability and DNA damage. ZnCl2 did not increased vulnerability of hippocampal slices to toxic effects of peroxides, but when these cells were exposed to 1 mM of H2O2 after the ZnCl2 pre-treatment, a decrease in cell viability was observed in the same proportion as the effect caused by the pretreatment with BCNU, an inhibitor of GR, indicating that this effect is likely due to GR inhibition. In conclusion, this data demonstrate that despite the high susceptibility of N2a cells to ZnCl2 and H2O2, the zincinduced GR inhibition did not increased this vulnerability. In contrast, C6 cells were more resistant to ZnCl2 and peroxides, but the inhibition of GR and TrxR by zinc treatment highly increased the citotoxicity of both peroxides. Hippocampal slices were more resistant than the cell cultures to the toxic effects of the treatments, but when exposed to higher doses of H2O2, Zn was able to sensitize the cells to peroxide toxicity. In C6 cells, the synergism between the inhibition of enzymes and peroxide toxicity probably is related to the decreased capacity to metabolize peroxides. Therefore our data suggest that the inhibition of the antioxidant enzymes GR and TrxR by zinc is an important factor associated with its toxicity in neural cells.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências O mercurio, em suas formas organicas e inorganicas, e um toxicante ambiental capaz de provocar deficits neurologicos severos em animais e humanos. O sistema nervoso em desenvolvimento apresenta uma maior suscetibilidade aos efeitos deleterios induzidos por mercuriais. Neste contexto, exposicoes durante o periodo pre#]natal e lactacional representam importantes questoes do ponto de vista toxicologico. De fato, pouco se conhece a respeito da contribuicao lactacional para o desenvolvimento de neurotoxicidade frente a intoxicacoes com mercuriais. Alem disso, nao existem tratamentos efetivos capazes de reverter completamente os efeitos toxicos do mercurio. No presente estudo, foi demonstrado que a exposicao exclusivamente lactacional de camundongos jovens ao metilmercurio, uma forma organica de mercurio, causou deficits motores que foram correlacionados com um desequilibrio no estado tiolico cerebelar. Observamos tambem, que o mercurio inorganico causou neurotoxicidade em camundongos expostos a este metal atraves do leite materno. O cerebelo de animais jovens expostos ao mercurio inorganico apresentou uma atividade glutationa redutase aumentada, um efeito que pode estar relacionado a uma resposta de defesa celular frente a acao pro#]oxidativa do mercurio sobre tiois endogenos. Em contrapartida, os camundongos jovens expostos ao metilmercurio nao demonstraram esta resposta, o que aponta para mecanismos moleculares de resposta distintos para as diferentes formas de mercurio, sendo este fenomeno importante do ponto de vista toxicologico. O tratamento de animais adultos com metilmercurio por via oral causou uma diminuicao significativa na atividade glutationa peroxidase cerebral, uma enzima primaria no processo de detoxificacao de peroxidos produzidos endogenamente. Este efeito ocorreu em paralelo a um aumento na proteolise da enzima poli(ADP ribose) polimerase, um indice de apoptose. Em estudos in vitro, nossos dados demonstraram uma participacao importante do peroxido de hidrogenio como mediador da neurotoxicidade induzida por mercuriais e este fato foi acompanhado por uma marcante inibicao da enzima antioxidante glutationa peroxidase mitocondrial. O bloqueio da atividade desta enzima com acido mercaptosuccinico aumentou o estresse oxidativo e a disfuncao mitocondrial induzida pelos mercuriais in vitro. A incubacao de celulas de neuroblastoma humano SH#]SY5Y com metilmercurio causou uma diminuicao significativa na atividade glutationa peroxidase destas celulas. Este efeito tornou as celulas menos eficientes em degradar peroxido de hidrogenio e ocasionou um aumento na expressao de marcadores de dano oxidativo. Alem disso, a inibicao da lutationa peroxidase com acido mercaptosuccinico potencializou a perda de viabilidade celular e aumentou significativamente a expressao de marcadores de apoptose. O tratamento de animais adultos com extrato hidroalcoolico da planta Polygala paniculata preveniu os efeitos comportamentais e relacionados ao estresse oxidativo induzidos pelo tratamento com metilmercurio administrado por via oral. Este efeito se deu provavelmente devido a acao antioxidante do extrato. Em estudos in vitro, demonstramos a participacao do flavonoide quercetina como um importante mediador da neuroprotecao induzida pelo extrato de Polygala frente aos efeitos toxicos do metilmercurio. Alem disso, o flavonoide miricetina tambem apresentou efeito benefico contra a disfuncao mitocondrial e estresse oxidativo induzidos por metilmercurio in vitro. Em conclusao, nossos dados apontam para o sistema antioxidante da glutationa como um importante alvo molecular na neurotoxicidade induzida por mercuriais, onde disturbios no sistema antioxidante, causados por estes agentes, levam a um quadro de estresse oxidativo associado a disfuncao mitocondrial e aumentam a expressao de marcadores de morte celular. O extrato hidroalcoolico da planta Polygala paniculata, bem como os flavonoides quercetina e miricetina, representam potenciais agentes neuroprotetores contra a toxicidade induzida por mercuriais Mercury, in its organic and inorganic forms, is a potent environmental toxicant able to induce neurological deficits in both animals and humans. The developing central nervous system is particularly susceptible to the deleterious effects of mercury compounds. In this regard, mercury exposures during the pre#]natal and lactational periods are main factors from a toxicological point of view. In fact, little is known about the exclusive contribution of the lactational exposure to mercury and its relationship with neurotoxicity. In addition, there are no available treatments able to totally block mercurials#]induced toxicity. In the present study, we demonstrate that the exposure of young mice to methylmercury, an organic form of mercury, exclusively via maternal milk induces motor deficits associated with disturbs in the cerebellar thiol homeostasis. We also show that inorganic mercury caused neurotoxicity by exposure of young mice exclusively through the lactational route. The pups exposed to inorganic mercury presented an increased activity of the antioxidant enzyme glutathione reductase in the cerebellum. This effect appears to be related to an antioxidant response against the well known pro#]oxidative actions of mercury towards endogenous thiols. On the other hand, pups exposed to methylmercury through maternal milk did not show such adaptative response, pointing to different molecular mechanisms of action of the distinct forms of mercury. From a toxicological point of view, this is an important finding. Treatment of adult mice with methylmercury via oral route caused a significant decrease on the glutathione peroxidase activity in the brain. This enzyme is a main antioxidant defence against the deleterious effects of indogenous peroxides. This phenomenon was concomitant with an increase in poly(ADP ribose) polymerase proteolysis, an index of apoptosis. During in vitro studies, our data shows the central role of hydrogen peroxide as an important contributor to the neurotoxicity induced by mercuric compounds. We also show the inhibitory effect of methylmercury on mitochondrial glutathione peroxidase. The blockade of this enzyme with mercaptosuccinic acid caused an increase of oxidative stress markers and mitochondrial dysfunction induced by mercurials in vitro. The incubation of human neuroblastoma cells SH#]SY5Y with methylmercury caused a significant decrease on glutathione peroxidase activity. This effect resulted in a decreased ability of cells to remove hydrogen peroxide from the culture medium, causing an increase in the endogenous formation of peroxides. In addition, the inhibition of glutathione peroxidase improved the methylmercury#]induced anti#]viability effect and potentiated apoptosis. Treatment of adult animals with Polygala paniculata extract prevented the effects of methylmercury in inducing motor deficits and oxidative stress. This effect is probably related to the antioxidant actions of the extract. During in vitro studies, we demonstrated the participation of the flavonoid quercetin as an important mediator on the neuroprotection induced by Polygala extract. In addition, the flavonoid myricetin also displayed beneficial effects against methylmercury induced mitochondrial dysfunction and oxidative stress in vitro. In summary, our data point to the glutathione antioxidant system as an important molecular target for mercury#]induced neurotoxicity. Disturbances in this cellular defence system can induce oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction and apoptosis. The Polygala paniculata extract, as well as the flavonoids quercetin and myricetin, may be potential therapeutic agents against mercury induced neurotoxicity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. Cerebral ischemia is characterized by a transitory or a permanent reduction in the blood flow in a specific area of the central nervous system, producing glucose and oxygen deprivation (OGD) to cells. Events such as glutamatergic excitotoxicity and oxidative stress can lead to necrotic or apoptotic neuronal cell death. Besides being an essential element in the structure and function of a number of proteins, Zinc is released concurrently with glutamate in the glutamatergic synaptic transmission, exerting a modulatory role. Quercetin is a flavonoid obtained through the food, displaying known neuroprotective effects. The objective of this study was to develop neuroprotection strategies utilizing a model of ischemia and a model of oxidative stress by using hippocampal slices of adult rats. The animals treated in vivo with ZnCl2 (300 mg/L; p.o.) during 30 days did not show any evidence of neuroprotection in the hippocampal slices in the ex vivo ischemia model. The cell viability and permeability tests indicated impairment in the cell condition after 15 or 60 min of ischemia. The total glutathione (GSH-t) levels were decreased only after 2 hours of reperfusion. Protein thiol (PSH) content remained unchanged in all treatment conditions. In the in vitro treatment with ZnCl2 the response was dual, when the cell viability was evaluated, ZnCl2 10 and 100 ìM was able to protect hippocampal slices exposed to 15 minutes OGD followed by 2 hours of reperfusion, however, ZnCl2 100 ìM was neurotoxic when these slices were subjected to 60 minutes of OGD followed, or not, by 2 hours of reperfusion. In the cell permeability assay, ZnCl2 100 ìM was neuroprotective in the reperfusion period. Still, GSH-t and PSH content decreased after 15 or 60 min PGO specially at the highest ZnCl2 (10 and/or 100 ìM) tested concentration. In hippocampal slices incubated for 1 ctivity of the antioxidant enzyme glutathione reductase (GR), as did the GR specific inhibitor carmustine (BCNU). The GR inhibition by BCNU did not alter the ischemic response, indicating that GR inhibition is a secondary event in the toxicity induced by the ischemic insult, which is in accordance with published data. In the in vitro treatment using quercetin it was possible to unravel neuroprotection at quercetin 10 and 30 ìM when the cell viability was tested during the ischemic or in the reperfusion period. Quercetin at different concentration was unable to reverse the GSH-t content decrease in the 2-hours reperfusion period. The PSH levels remained unchanged in all treatments. Quercetin at 30 and 100 ìM produced neuroprotection in the cell viability test when the hippocampal slices were exposed to 2.5 mM H2O2, but was unable to reverse the GSH-t decrease when hippocampal slices were exposed to 1.0 or 2.5 mM H2O2. The PSH content remained unaltered after H2O2 treatment. These results suggest that ZnCl2 did not cause neuroprotection when administered in vivo, while, in vitro it caused a dual effect, being neurotoxic or neuropretective, depending on the parameter tested. Inhibition of GR is not a relevant fator in the ischemic model employed. Quercetin, demonstrated a strong neuroprotective action in the in vitro ischemia model and a moderate neuroprotective effect against H2O2.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. A glutationa (GSH) é um tripeptídeo que possui diversas funções, incluindo defesa antioxidante, detoxificação de xenobióticos e regulação da apoptose. A literatura mostra que condições estressantes (choque) diminuem os níveis de GSH no córtex cerebral de camundongos, um efeito que foi revertido por antidepressivos. No presente estudo, o tratamento de camundongos com GSH produziu efeito antidepressivo no teste do nado forçado (TNF) nas doses entre 300-3000 nmol/sítio, i.c.v. e no teste da suspensão da cauda (TSC) nas doses entre 100-1000 nmol/sítio, i.c.v., sendo que as doses que diminuíram o tempo de imobilidade dos animais nos dois testes comportamentais não alteraram a locomoção no teste do campo aberto, evidenciando um efeito antidepressivo específico da GSH. O efeito da GSH no TNF perdurou até 3 h após sua administração. Após administração de GSH, não houve alterações nos níveis de GSH-t no hipocampo, nem na atividade das enzimas antioxidantes glutationa redutase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase. Além disto, a N-acetilcisteína (NAC; precursora de glutationa), reduziu o tempo de imobilidade dos animais no TNF nas doses de 100 e 150 mg/kg, i.p., sem alterar a locomoção no campo aberto, sendo que seu efeito perdurou até 4 horas após sua administração. Semelhante aos resultados obtidos com a administração de GSH, a administração de NAC não foi capaz de alterar os níveis de GSH-t em hipocampo. A inibição da síntese intracelular de GSH por butionina sulfoximina (BSO) não afetou a ação antidepressiva da GSH, ao contrário da inibição da degradação extracelular da GSH por acivicina que ocasionou a reversão do efeito antidepressivo da GSH (300 nmol/sítio, i.c.v.). O efeito antidepressivo da GSH (300 nmol/sítio, i.c.v.) no TNF foi prevenido pelo pré-tratamento dos animais com GMP (100 mg/kg, i.p., nucleotídeo que antagoniza várias ações induzidas pela ativação do receptor NMDA), ácido ascórbico (100 mg/kg, i.p., neuromodulador que se liga ao sítio redox do receptor NMDA e antagoniza seu efeito), cloreto de zinco (5 mg/kg, i.p., inibidor de receptor NMDA), melatonina (100 mg/kg, i.p., neurohormônio que pode atuar como antagonista de receptor NMDA), ditiotreitol (DTT, 25-100 mg/kg, i.p., agente redutor), L-arginina (750 mg/kg, i.p., precursor de óxido nítrico), S-nitrosoacetilpenicilamina (SNAP; 25 mg/sítio, i.c.v., doador de óxido nítrico), prazosim (62,5 mg/kg, i.p., antagonista de receptores a1-adrenérgicos), baclofen (1 mg/kg, i.p., agonista GABAB) e bicuculina (1 mg/kg; i.p., antagonista GABAA), mas não por ácido dinitrobenzóico (DTNB, 10 nmol/sítio, i.c.v., agente oxidante) e ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista de receptores a2-adrenérgicos). O pré-tratamento dos animais com doses sub-ativas de GMP (0,5 mg/kg, i.p.), DTNB (0,01 nmol/sítio, i.c.v.), imipramina (5 mg/kg, i.p.), fluoxetina (10 mg/kg, i.p.), glutationa oxidada (GSSG, 30 nmol/sítio, i.c.v.) e a co-administração de MK-801 (0,001 mg/kg, i.p., dose sub-ativa) foi capaz de potencializar o efeito antidepressivo da GSH (100 nmol/sítio, i.c.v., dose sub-ativa no TNF). Estes resultados sugerem o envolvimento dos sistemas glutamatérgico (receptores NMDA), noradrenérgico e GABAérgico, da via L-arginina óxido nítrico, além de uma participação na modulação redox no efeito da GSH no TNF. Os resultados também mostram uma ação antidepressiva sinérgica da GSH com a fluoxetina e imipramina. O conjunto dos dados sugere que a GSH pode ter um papel importante na modulação da depressão. Glutathione (GSH) is a tripeptide that has important functions, including a role in antioxidant defenses, detoxification of xenobiotics and regulation of apoptosis. Literature data has shown that stressant conditions (shock) decreases cortical GSH levels in mice, an effect that was reversed by antidepressants. In the present study, the treatment of mice with GSH significantly decreased the immobility time in the forced swimming test (FST) (dose range 300-3000 nmol/site, i.c.v.) and in the tail suspension test (TST) (dose range 100-1000 nmol/site, i.c.v.), without accompanying changes in ambulation in an open-field test. Moreover, the effect of GSH in the FST lasted until 3 h after its administration. No alterations neither in the levels of GSH-t in hippocampus nor on the activities of the antioxidants enzymes glutathione reductase, glutathione peroxidase and glutathione S-transferase were observed. Beyond that, N-acetylcysteine (NAC; a precursor of glutathione) administered by i.p. route (100-150 mg/kg), significantly reduced the immobility time in the FST, without accompanying changes in ambulation in an open-field test. Moreover, this effect lasted until 4 h after its administration. Similarly to the results obtained with GSH administration, the treatment with NAC was not able to modify the levels of GSH-t in the hippocampus.The inhibition of the intracellular synthesis of GSH by butionine sulfoximine did not affect the antidepressant-like effect of GSH. In contrast, the inhibition of the extracellular degradation of GSH by acivicin reversed the anti-immobility effect of GSH in the FST. The antidepressant-like effect of GSH (300 nmol/site, i.c.v.) was completely prevented by pre-treatment of animals with GMP (100 mg/kg, i.p., a nucleotide that antagonizes some actions induced by NMDA receptor activation), ascorbic acid (100 mg/kg, i.p., a putative neuromoculator that antagonizes NMDA receptors), zinc chloride (5 mg/kg, i.p., an inhibitor of NMDA receptors), melatonin (100 mg/kg, i.p., neurohormonio that can to act as NMDA receptor antagonist), dithiothreitol (DTT, 25-100 mg/kg, i.p., reducing agent), L-arginine (750 mg/kg, i.p., a nitric oxide precursor), S-nitroso-N-acetyl-penillamine (SNAP, 25 mg/site, i.c.v., a nitric oxide donor), prazosin (1 mg/kg, i.p., an a1-adrenoceptor antagonist), baclofen (1 mg/kg, i.p., an GABAB receptor angonist) and bicuculline (1 mg/kg; i.p., an GABAB receptor antagonist), but not with DTNB (10 nmol/sítio, i.c.v., oxidizing agent) and yohimbine (1 mg/kg, i.p., an a2-adrenoceptor antagonist). An antidepressant-like effect of a sub-active doses of GSH (100 nmol/sítio, i.c.v.) was produced by the pre-treatment of animals with sub-active doses of GMP (0.5 mg/kg, i.p.), DTNB (0.01 nmol/sítio, i.c.v.), (5 mg/kg, i.p., a triciclic antidepressant), fluoxetine (10 mg/kg, i.p., a selective serotonin-reuptake inhibitor), oxidized glutathione (GSSG; 30 nmol/sítio, i.c.v.) and the co-administration of MK-801 (0.001 mg/kg, i.p., sub-active dose). The results demonstrate that the antidepressant-like effects of GSH in the FST appear to be mediated by the glutamatergic (NMDA receptors), noradrenergic (a1-adrenoceptors), and GABAergic (GABAA and GABAB receptors) systems, L-arginine nitric oxide pathway, and by a redox modulation. Furthermore, the potentiation of the antidepressant-like effect of fluoxetine and imipramine by GSH might have potential therapeutic value. Taken together, the data suggest that glutathione may have an important role in the modulation of depression.