Search

Fosil yakıtların yenilenebilir olmaması ve kullanımlarından kaynaklı ortaya çıkan; sera gazı salımı, hava kirliliği ve denizlerde asiditenin artması gibi çevresel sorunlar, bilim insanlarını alternatif enerji kaynaklarını araştırmaya yönlendirmektedir. Hidrojen, enerji sistemlerindeki önemi özellikle son yirmi yılda artan temiz bir enerji taşıyıcısıdır. Hidrojenin önemi; doğada en yaygın bulunan element olması, yakılması sonucunda sadece su buharı oluşturması ve birim ağırlık başına yüksek enerji verimliliği bulunmasından kaynaklanmaktadır. Hidrojen günümüzde çoğunlukla fiziko-kimyasal yöntemlerle üretilmekte, fakat bu yöntemlerin sera gazı açığa çıkarıyor olmasından dolayı alternatif enerji üretim prosesleri aranmaktadır. Bu amaçla, hidrojenin biyolojik yollarla üretilmesi en temiz alternatif olarak göze çarpmaktadır. Fotoheterotrofik mikroorganizmaları kullanarak biyolojik hidrojen üretimi, hidrojen üretiminin en temiz yöntemlerinden biridir. Bu tip hidrojen üretimi, kapalı alan fotobiyoreaktörleri ve açık alan fotobiyoreaktörleri olmak üzere iki farklı reaktör sisteminde gerçekleştirilir. Açık alan foto biyoreaktörleri ışık kaynağı olarak gün ışığını kullandıkları için işletme maliyeti açısından kapalı alan fotobiyoreaktörlerine karşı avantajlı konumda bulunmaktadır. Fakat açık alan koşullarında çevresel etmenlerin kontrolü mümkün olmadığından, ilgili biyoreaktör içerisinde bulunan mikroorganizma kültürleri sezona ve gün devinimine bağlı olarak ısı şokuna maruz kalmaktadır. Açık alan fotobiyoreaktörlerinde aşırı ısınmaya bağlı verim kaybını gidermek için ısıya dirençli mikroorganizmalar arzu edilir. Bu çalışmada, daha önceki bir çalışmada yönlendirilmiş evrim yaklaşımıyla elde edilmiş olan, ısıya dirençli Rhodobacter capsulatus A52 ve B41 adlı, sırasıyla düşük ve yüksek hidrojen üretim kapasitesine sahip mutant suşların karşılaştırmalı tüm genom dizi, proteomik ve transkriptomik analizleri gerçekleştirilerek; istenilen daha yüksek hidrojen üretim kapasitesi ve ısı direnci ile ilgili mutasyonlar ve ekspresyon farklılıkları tespit edilmiştir.Yönlendirilmiş evrimle geliştirilen bakteri suşlarında arzu edilen bir fenotipik özellik; öncelikle bakteri popülasyonu üzerinde mutasyon oranını artıracak bir ajan kullanılıp genetik çeşitliliğin arttırılmasına, sonrasında ilgili popülasyon üzerine artan stres koşulları uygulanarak arzu edilen fenotipe sahip organizmaların seçilmesine dayanır. Bu yöntem, istenilen fenotipin geliştirilmesi için çok uygun bir yöntem olmasına karşın, ilgili fenotipi oluşturan genetik faktörler bilinmediği için mutantların tam bir genomik, protemik ve transkriptomik karakterizasyonunu zorunlu kılmaktadır.R. capsulatus bakterisinde hidrojen üretimi sadece azotun limitli olduğu fotosentetik koşullarda gerçekleşmektedir. Bu koşullar altında elektron taşıma zinciri elemanlarının bulunduğu hücre membranı aşırı derecede indirgenerek hücre redoks dengesi bozulur. R. capsulatus, redoks dengesini sağlayabilmek için karbonxxivfiksasyonu (RubisCO) ve azot fiksasyonu (Nitrojenaz) mekanizmalarını aktive eder. R. capsulatus hidrojen üretimi nitrojenaz enzimi elemental azotu amonyağa indirgerken yan ürün olarak oluşmaktadır. Bu nedenle; gerçekleştirilen genomik, proteomik ve transkriptomik analizlerde, özellikle bu iki sistemi kodlayan veya ifade düzeylerini kontrol eden genler ve proteinler üzerindeki varyasyonlar dikkate alınmıştır.Bu çalışmada karakterizasyon analizlerine genomik analizlerle başlanmıştır. Genom analizleri, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmiş olup, elde edilen veriler; ısı-stresine dayanıklı mutant suşların ve yaban-tip DSM1710 suşunun de novo genom birleştirmeleri ve mutant suşların yaban tiple karşılaştırılmasıyla genetik varyasyonların tespiti için kullanılmıştır. Genomik analizler, doğrudan hidrojen üretim metabolizması ile ilişkili küçük bir mutasyon grubuna işaret etmektedir, bu mutasyonların bir kısmı ilgili gen bölgelerinin içerisinde diğerleri de gen ifadesinin regülasyonunda görevli bölgeler üzerinde bulunmaktadır. Mutant B41 genomunda mutasyonlar; nifD, nifJ, glnD, nifBl, ccpA, hupD, dmsA ve cbbR1 genlerinde; A52 mutantında mutasyonlar, nifB2, rnfF, nifJ, cbbO, anhH, amt, moeA ve hupD genlerinde karakterize edilmiştir.Genomik analizleri takiben ilgili mutant ve yaban-tip suşlar üzerinde proteomik analizler gerçekleştirilmiştir. Proteomik analizler, LC-MS/MS sıralı kütle spektrometrisi ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforezi yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiş ve ilgili mutant suşlar ile yaban-tip DSM1710 suşu arasındaki protein ifade düzeyi farklılıkları tespit edilmiştir. Proteomik analizler, R.capsulatus'un hidrojen üretim metabolizmasında, RCAP_rcc03215, RCAP_rcc03277 ve RCAP_rcc00730 varsayımsal proteinlerinin olası düzenleyici işlevlerini ortaya koymuştur.Tüm genom dizi analizleri ve proteomik analizler sonucunda elde edilen veriler glnD, cbbR1, hupD ve dmsA genleri üzerindeki mutasyonların B41 suşunun yüksek hidrojen verimine sahip olmasındaki temel sebepler olduğunu, A52 suşunun hidrojen üretiminin düşük olmasının temel sebeplerinin de nifA ve nifH genlerindeki mutasyonlar olduğunu göstermektedir.İlgili mutasyonların etkisinin transkriptomik düzeydeki etkilerinin belirlenmesi için gerçek-zamanlı kantitatif ters-transkripsiyon PZR analizleri gerçekleştirilmiştir. Hidrojen üretimi açısından azot metabolizmasına bağlı mutasyonların etkileri nifA geninin (diğer azot fiksasyon genlerinin aktivatörü), nitrojenaz yapısal gen nifH, nitrojenaz regülatörü ntrC geni, RubisCO yapısal genleri cbbL, cbbS ve cbbO, nitrojenaz demir proteini kodlayan anhH geni, hidrojenaz olgunlaştırma proteazı kodlayan hupD, molibdopterin biyosentez proteini kodlayan moeA, amonyum taşıyıcı gen amt ve dimetil sulfoksit redüktaz A altbirimini kodlayan dmsA genleri üzerinde sınanmıştır. Yapılan analizler nifA, nifH ve glnD ifade düzeylerinin B41 mutantında önemli derecede arttığını (yaklaşık olarak 2 kat, glnD için 7 kat), öte yandan A52 mutant suşunda ciddi ölçüde azaldığını (10-16 kat azalma) ortaya koymuştur. Karbon metabolizması için önem arz eden cbbL ve cbbS genlerinin ifadelerinde mutant suşlar arasında önemli bir farklılaşma görülmemesine karşın, RubisCO aktivatörü cbbO ifade düzeyinin B41 mutantında önemli ölçüde azaldığı, yani karbon metabolizmasının ilgili mutantta yavaşladığı tespit edilmiştir. Bu durum, elektron havuzundaki elektronların nitrojenaz sistemine aktarıldığını ve bunun, bu mutant suştaki hidrojen üretiminin artmasındaki sebeplerden biri olduğu şeklinde ortaya koyulmuştur. Proteomik vegenomik analiz verileriyle uyumlu olarak; en umut verici mutasyonlar, ısıya dirençli mutantlar arasında yüksek hidrojen üreten suş olan B41 suşunun glnD ve cbbR1 genlerinde bulunan mutasyonlardır.Sonuç olarak bu çalışmada, ilgili mutant suşların moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiş ve R. capsulatus'un biyohidrojen üretimini arttırmak için gelecekte yapılacak çalışmalara yönelik yeni hedef genler tespit edilmiştir. Hydrogen is a clean energy carrier whose importance in energy systems has been increasing, especially for the last two decades. The biological hydrogen production by using photoheterotrophic microorganisms is one of the cleanest methods of hydrogen production. To overcome efficiency losses due to overheating in outdoor photobioreactors, heat-resistant microorganisms are desirable. In this study, a combination of the comparative whole genome sequencing, comparative proteomic, and transcriptomic analyses of two previously obtained Rhodobacter capsulatus heat-resistant mutants; A52 and B41, with decreased and elevated hydrogen production capacities, respectively, have been performed to identify mutations and expression differences related to desired higher hydrogen production capacity and heat resistance.Uncovering the molecular mechanisms of resistance to high temperature besides hydrogen production by R.capsulatus will be a reference for the development of strains resistant to heat stress. Also the characterization of mechanisms affecting the production of hydrogen in R.capsulatus allowed the determination of target genes and metabolic pathways for the creation of high-efficiency hydrogen producing mutants through metabolic engineering.Genomic analyses showed a small group of mutations which was directly related to hydrogen production metabolism. In the mutant B41 genome, mutations were characterized in nifD, nifJ, glnD, nifB1, ccpA, hupD, dmsA and cbbR1 genes, on the other hand; in the A52 mutant, mutations were characterized on the nifB2, rnfF, nifJ, cbbO, anfH, amt, moeA, and hupD genes. Proteomic analyses revealed possible regulatory functions of the hypothetical proteins RCAP_rcc03215, RCAP_rcc03277, and RCAP_rcc00730 in hydrogen production metabolism of R.capsulatus.The effects of nitrogen metabolism-related mutations were tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) on the expression levels of nifA gene (the activator of other nitrogen fixation genes), nitrogenase structural gene nifH, nitrogenase regulator ntrC gene, RubisCO structural genes cbbL, cbbS and cbbO, nitrogenase iron protein encoding gene anfH, hydrogenase maturation protease encoding hupD, molybdopterin biosynthesis protein encoding moeA, ammonium transporter gene amt, and dimethyl sulfoxide reductase, A subunit encoding dmsA genes. The most promising mutation was the one found on the glnD gene of B41 strain which is the highest hydrogen-producing strain among the heat-resistant mutants. This gene encodes PII uridylyltransferase and the effect of this mutation was confirmed by quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses. 138

Hidrojen biyolojik olarak üretilebilen gelecek vadeden alternatif bir enerji kaynağıdır. Sülfür bakterisi olmayan, mor bakteri, Rhodobacter capsulatus azotun sınırlı olduğu durumlarda fotoheterotrofik koşullarda basit organik asitler gibi karbon kaynaklarını indirgeyerek hidrojen üretebilir. Biyolojik hidrojen üretimi için kullanılmakta olan açıkalan-kapalı fotobiyoreaktörler direk güneş ışığı altına yerleştirilirler; buna bağlı olarak, gün içinde sıcaklık değişimlerine maruz kalırlar. Bu problemi çözmek için; bu çalışmada R. capsulatus bakterisinin sıcağa dayanıklı (42°C' ye kadar) mutantları evrimsel mühendislik yaklşımıyla geliştirilmiştir ve ileri metabolik mühendislik çalışmaları için sıcak ve soğuk stresinin R. capsulatus hidrojen üretim metabolizması üzerine etkileri proteomik yaklaşımla çalışıldı. R. capsulatus bakterisinin DSM 1710 soyuna EMS mutagenezi uygulanarak, onbir mutant soy oluşturuldu ve 42°C' de solunum koşullarında seçildi. Mutantların genetik kararlılığı incelendi ve sekiz mutantın genetik olarak kararlı olduğu görüldü. Sıcaklık stresine dayanıklı bu sekiz suşun tamamı 42°C'de büyüyebilmenin yanısıra fotosentetik ortamda da büyüyebilmektedirler. Ayrıca, mutant soyların hidrojen üretimleri analiz edildi, analiz sonucunda beş mutantın yaban tip DSM 1710 soyundan daha fazla hidrojen ürettiği; üç mutantın ürettikleri hidrojenin hacim olarak yaban tipten daha az olduğu tespit edildi. En yüksek hidrojen üretim kapasitesine sahip olan mutantın (B41) ürettiği hidrojen miktarının yaban tipin hidrojen üretiminden % 11.7 daha fazla olduğu; öte yandan, hidrojen üretimi en düşük olan mutantın (A52) yaban tipten %11.2 daha az hidrojen ürettiği görüldü. Bu sonuçlar, endüstriyel açıdan önemli özelliklerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılan evrimsel mühendislik yöntemiyle R.capsulatus bakterisinde sıcaklık direncinin geliştirilebilir olduğuna işaret etmektedir.Proteome analizleri sonucunda elde edilen veriler, sıcak ve soğuk stresine karşı birçok proteinin aktive olduğu veya ekspresyonun azaldığı görülmüştür. Sıcak şoku durumunda ekspresyonu artan proteinlerin sıcak şoku proteinleri, membran proteinleri, ribozomal proteinler ve elektron transfer zinciri proteinleri olduğu görülmüştür. Bu proteinlerin yanı sıra hidrojen üretim metabolizmasında görevli proteinlerin ekspresyonu sıcak şoku karşısında azalma göstermiştir. Bu durum sıcak şoku koşullarında hidrojen üretiminin azalmasına neden olmaktadır. Soğuk koşulları altında ekspresyonu artan proteinler soğuk şoku proteinleri, ayrıca sıcak şoku koşullarında olduğu gibi membran proteinleri, ribozomal proteinler ve elektron transfer zinciri proteinleridir. Hidrojen üretim metabolizması proteinleri soğuk şoku koşullarında da azalma göstermiştir. Soğuk şoku koşullarında hidrojen üretimi azalmıştır. Hydrogen is a promising alternative energy source which can be produced biologically. Rhodobacter capsulatus, a non-sulphur purple photosynthetic bacterium, can produce hydrogen in nitrogen-limited conditions under photoheterotrophic conditions by using reduced carbon sources such as simple organic acids. Outdoor closed photobioreactors used for biological hydrogen production are located under direct sunlight, as a result; bioreactors are exposed to temperature fluctuations during day time and hydrogen production is affected considearbly because of day and night temperature changes. To overcome this problem, temperature-resistant mutants (up to 42°C) of R. capsulatus were gererated by evolutionary engineering approach, and the effect of heat and cold stress on the R. capsulatus hydrogen production metabolism was studied by proteomics approach for further metabolic engeneering studies. Eleven mutant strains of R. capsulatus DSM 1710, generated by ethyl methane sulfonate (EMS), were selected at 42°C under respiratory conditions. The genetic stability of the mutants was tested and eight of them were genetically stable. All of the eight mutant strains could grow under photosynthetic conditions along with growth ability at 42°C. Moreover, hydrogen production of mutant strains was analyzed; five of the mutants were producing higher amounts of hydrogen when compared to DSM 1710 wild-type strain and three mutants were producing less hydrogen in volume. The mutant whose hydrogen production was higher than those of the other mutants (B41) produced 11.7 % more hydrogen compared to wild type, and the mutant with lowest hydrogen production (A52) generated 11.2 % less hydrogen compared to the wild type. These results indicated that heat resistance of R. capsulatus can be improved by evolutionary engineering which is a useful tool to improve industrially important microbial properties.Data gathered from proteomic analysis, it was seen that a number of proteins expressed or repressed as a response to heat and cold stress. Proteins whose expression increased under heat shock conditions are heat shock proteins, membrane proteins, ribosomal proteins, and electron transfer chain proteins. Along with these proteins, proteins occupied with hydrogen production metabolism were decreased in expression. This situation leads to decrease in hydrogen production under heat shock conditions. Under cold shock conditions, proteins whose expression increased are membrane proteins, ribosomal proteins, cold shock proteins, and electron transfer chain proteins. Proteins of hydrogen metabolism decreased as in the case of heat shock. So, hydrogen production decreased under cold shock conditions. 109