Search

D-Tyr-tRNATyr-deacylase (DTD) is a conservative enzyme, found in all domains of life, which ensures an additional checkpoint in the recycling of misaminoacylated D-Tyr-tRNATyr. DTD is capable of accelerating the hydrolysis of the ester linkage of D-Tyr-tRNATyr producing a free tRNA and D-tyrosine, thereby preventing an incorrect incorporation of D-amino acids into proteins. Deacylase distinguishes between D- and L-aminoacyl moieties and does not hydrolyze L-aminoacylated tRNA. The structural bases of this specificity and the mechanism of D-aminoacyl-tRNA hydrolysis are poorly understood. Aim. To clone D-Tyr-tRNATyr-deacylase from T. thermophilus (DTDTT), optimize the conditions for its expression in E.coli and develop an efficient purification procedure yielding the high quality enzyme suitable for the structural and functional studies. Methods. For amplification of DTD gene from T. thermophilus genomic DNA and its cloning into the pProEXHTb expression vector modern techniques were applied. Purification of the recombinant DTD protein was done with three types of column chromatography. His-tag was cleaved out from DTD by TEV protease. The cleavage was confirmed by Western blot analysis with anti-His-tag antibodies. Molecular weight of purified DTDTT was determined by the gel-filtration. Results. The expression construct pProEXHTb, containing DTD sequence from T. thermophilus, was obtained and successfully expressed in the BL21(DE3)pLysS E.coli strain. The protein of interest was purified to homogeneity by the combination of affinity (Ni-NTA), anion-exchange (Q-Sepharose) and size-exclusion (Superdex S 200) chromatographies. 2 mg of more than 90% pure recombinant DTD can be obtained from 1 L of bacterial culture. Molecular weight of purified DTD from T. thermophilus was determined to be 32 kDa, suggesting its dimeric structure. Conclusions. The pProEXHTb expression vector can be used for expression of DTD from T. thermophilus. The preparative amounts of DTD can be obtained after the three-step chromatographic procedures and used for further functional and structural studies. D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, знайденим у всіх царствах живої природи, що забезпечує додатковий корегувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНКТир DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв’язку в комплексі D-Тир-тРНКТир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином попереджуючи включення D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНКТир-деацилазу з T. the­rmophilus (DTDTT), оптимізувати умов її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Методи. Ампліфікацію та клонування в pProEXHTb DTD гена геномної ДНК T. ther­mo­philus проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проводено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Результати. Отримана конструкція pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацєю хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S 200) до чистоти 90%. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus – 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки. Отриманий вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus і підібрані умови очистки дозволяють отримати рекомбінантний DTD в кількостях достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень. D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) является консервативным белком, найденным во всех царствах живой природы, обеспечивающим дополнительный корректирующий этап гидролиза ошибочно аминоацилированных субстратов D-Тир-тРНКТир. DTD ускоряет гидролиз эфирной связи в комплексе D-Тир-тРНКТир, предупреждая, таким образом, ошибочное включение D-аминокислот в белки. Деацилаза различает D- и L-аминоацильные остатки в аминоацилированной тРНК и не гидролизирует последние. Структурные основы такой специфичности и механизм гидролиза D-аминоацил-тРНК при участии DTD являются недостаточно изученными. Цель. Клонировать D-Тир-тРНКТир-деацилазу из T. thermophilus (DTDTT), оптимизировать условия её экспрессии в E. coli и разработать эффективный, с высоким выходом высококачественного фермента, метод очистки. Методы. Для амплификации и клонирования в pProEXHTb гена DTD геномной ДНК T. thermophilus использованы стандартные молекулярно-биологические методы. Очистку рекомбинантного DTD белка проводили хроматографически. Остатки гистидина отщепили протеазой вируса табака (TEV), еффективность реакции проверили Вестерн-блот анализом с анти-His-антителами. Молекулярный вес очищенной DTDTT определили гель-фильтрацией. Результаты. Полученная конструкция pProEXHTb, содержащая DTD последовательность T. thermophilus, экспрессирована в клетках E. coli штамма BL21(DE3)pLysS. Последовательными хроматографиями: афинной (Ni-NTA), анион-обменной (Q-Sepharose) и гель-фильтрации (Superdex S 200) получен гомогенный белок с чистотой более 90 %. Разработанная методика позволяет получить до 2 мг целевого белка / 1 л культуры. Определенный молекулярный вес очищенной DTD из T. thermophilus – 32 кДа свидетельствует о ее димерной структуре. Выводы. Полученная конструкция pProEXHTb, содержаащя DTD последовательность T. thermophilus и подобранные условия очистки позволяют получить рекомбинантный DTD для дальнейших структурно-функциональных исследований.

Aim. To characterize the process of tRNA-dependent pretransfer edi- ting of alanine by prolyl-tRNA synthetase of bacteria Enterococcus faecalis (ProRSEf). Methods. Velocity of the editing processes in vitro was determined by ATP hydrolysis by ProRSEf. Pretransfer and posttransfer editing were experimentally separated by site-directed mutagenesis. Results. tRNA-dependent pretransfer editing is characterized by three-fold larger velocity then tRNA-independent editing. Effectivity of the process depends on the presence of 2'-hydroxyle group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro selective release of alanyl-AMP occurs simultaneously with tRNA-independent pretransfer editing. Released alanyl-AMP can be re-bound and hydrolyzed. Conclusions. tRNA-dependent pretransfer editing of alanine by ProRSEf is the catalytic mechanism, mediated by 2'-hydroxyl group of A76 tRNAPro. In the absence of tRNAPro tRNA-independent pretransfer editing and selective release of alanyl-AMP occur.

In prokaryotic cells three tRNA species, tRNASer, tRNALeu and tRNATyr, possess a long variable arm of 11–20 nucleotides (type 2 tRNA) rather than usual 4 or 5 nucleotides (type 1 tRNA). In this review we have summarized the results of our research on the structural basis for recognition and discrimination of type 2 tRNAs by Thermus thermophilus seryl-, tyrosyl- and leucyl-tRNA synthetases (SerRS, TyrRS and LeuRS) obtained by X-ray crystallography and chemical probing tRNA in solution. Crystal structures are now known of all three aminoacyl-tRNA synthetases complexed with type 2 tRNAs and the different modes of tRNA recognition represented by these structures will be discussed. In particular, emphasis will be given to the results on recognition of characteristic shape of type 2 tRNAs by cognate synthetases. In tRNASer, tRNATyr and tRNALeu the orientation of the long variable arm with respect to the body of the tRNA is different and is controlled by different packing of the core. In the case of SerRS the N-terminal domain and in the case of TyrRS, the C-terminal domain, bind to the characteristic long variable arm of the cognate RNA, thus recognizing the unique shape of the tRNA. The core of T. thermophilus tRNALeu has several layers of unusual base-pairs, which are revealed by the crystal structure of tRNALeu complexed with T. thermophilus LeuRS and by probing a ligand-free tRNA by specific chemical reagents in solution. In the crystal structure of the LeuRS-tRNALeu complex the unique D-stem structure is recognized by the C-terminal domain of LeuRS and these data are in good agreement with those obtained in solution. LeuRS has canonical class I mode of tRNA recognition, approaching the tRNA acceptor stem from the D-stem and minor groove of the acceptor stem side. SerRS also has canonical class II mode of tRNA recognition and approaches tRNASer from opposite, variable stem and major groove of acceptor stem site. And finally, TyrRS in strong contrast to canonical class I system has class II mode of tRNA recognition. У клітинах евкаріотів тРНК трьох специфічностей – тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr – мають довгу варіабельну гілку довжиною 11–20 нуклеотидів (2-га група тРНК) на відміну від чотирьох або п’яти нуклеотидів 1-ї групи тРНК. Підсумовано результати наших досліджень структурних основ упізнавання і дискримінації тРНК 2-ї групи серил-, тирозил- і лейцил-тРНК синтетазами з Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС і ЛейРС), отриманих методами рентгенівської кристалографії і хімічної модифікації тРНК у розчині. На сьогодні кристалічна структура відома для всіх трьох комплексів аміноацил-тРНК синтетаз з відповідними тРНК 2-ї групи, різні типи впізнавання яких обговорюються в огляді. Зокрема, особливу увагу приділено результатам аналізу впізнавання гомологічними синтетазами характерних рис просторової структури тРНК 2-ї групи. У тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr орієнтація довгої варіабельної гілки відносно основного тіла тРНК відрізняється і контролюється різною упаковкою корової частини молекули. У разі СерРС N-кінцевий, а в разі ТирРС – C-кінцевий домени зв’язуються з певними структурами довгих варіабельних гілок гомологічних РНК, упізнаючи таким чином унікальну структурну форму тРНК. Корова частина тРНКLeu має кілька шарів незвичайних пар основ, виявлених при вивченні кристалографічної структури комплексу тРНКLeu з ЛейРС із T. thermophilus та при дослідженні вільної тРНК у розчині методом хімічної модифікації з використанням специфічних реагентів. У кристалографічній структурі комплексу ЛейРС-тРНКLeu унікальна будова D-стебла впізнається С-кінцевим доменом ЛейРС і ці дані добре узгоджуються з результатами, отриманими в розчині. ЛейРС притаманний канонічний для синтетаз І структурного класу тип упізнавання тРНК – з боку D-стебла і малої борозенки акцепторного стебла. Для СерРС також характерний канонічний для синтетаз ІІ структурного класу тип упізнавання тРНК – з протилежного боку, тобто з боку варіабельного стебла і великої борозенки акцепторного стебла. І, нарешті, ТирРС на відміну від канонічного для ферментів І класу типу має тип упізнавання тРНК, властивий синтетазам ІІ класу. В клетках эукариотов тРНК трех специфичностей – тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr – имеют длинную вариабельную ветку длиной 11–20 нуклеотидов (2-я группа тРНК) в отличие от четырех или пяти нуклеотидов 1-й группы тРНК. Суммированы результаты наших исследований структурных основ узнавания и дискриминации тРНК 2-й группы серил-, тирозил- и лейцил-тРНК синтетазами из Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС и ЛейРС), полученные методами рентгеновской кристаллографии и химической модификации тРНК в растворе. На сегодня кристаллическая структура известна для всех трех комплексов аминоацил-тРНК синтетаз с соответствующими тРНК 2-й группы, разные типы узнавания которых обсуждаются в обзоре. В частности, особенное внимание уделено результатам анализа узнавания гомологичными синтетазами характерных черт пространственной структуры тРНК 2-й группы. У тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr ориентация длинной вариабельной ветви относительно основного тела тРНК отличается и контролируется разной упаковкой коровой части молекулы. В случае СерРС N-концевой, а в случае ТирРС – C-концевой домены связываются с определенными структурами длинных вариабельных веток гомологичных РНК, узнавая тем самым уникальную структурную форму тРНК. Коровая часть тРНКLeu имеет несколько слоев необычных пар оснований, выявленных при изучении кристаллографической структуры комплекса тРНКLeu с ЛейРС из T. thermophilus и при исследовании свободной тРНК в растворе методом химической модификации с использованием специфических реагентов. В кристаллографической структуре комплекса ЛейРС–тРНКLeu уникальное строение D-стебля узнается С-концевым доменом ЛейРС и эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в растворе. ЛейРС свойствен канонический для синтетаз І структурного класса тип узнавания тРНК – со стороны D-стебля и малой бороздки акцепторного стебля. Для СерРС также характерный канонический для синтетаз ІІ структурного класса тип узнавания тРНК – с противоположной стороны, т. е. со стороны вариабельного стебля и большой бороздки акцепторного стебля. И, наконец, ТирРС в отличие от канонического для ферментов І класса типа имеет тип узнавания тРНК, присущий синтетазам ІІ класса.

Aim. Cloning and sequencing of the T. thermophilus leucyl-tRNA synthetase (LeuRSTT) followed by the creation of genetically engineered construct for protein expression in E.coli cells and its purification. Methods. Searching for the LeuRSTT gene was performed by Southern blot hybridization with chromosomal DNA, where digoxigenin-labeled PCR fragments of DNA were used as probes. Results. The gene of T. thermophilus HB27 leucyl-tRNA synthetase was cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 878 amino acid residues in length (molecular mass 101 kDa). Comparison of the amino acid sequence of T. thermophilus LeuRS with that of the enzymes from other organisms showed that LeuRSTT was a part of the group of similar enzymes of prokaryotes, formed by the proteins of protobacteriae, rickettsia and mitochondria of eukaryotes. The resulting phylogenetic tree of LeuRSs reveals dichotomous branching into two lines: prokaryotic/eukaryotic mitochondrial and arhaeal/eukaryotic cytosolic proteins. Differences between prokaryotic and arhaeal branches of the LeuRSs phylogenetic tree are primarily due to the structure of two domains of the enzyme – the editing and the C-terminal. T. thermophilus LeuRS was expressed in E. coli cells by cloning the corresponding gene into pET29b vector. Conclusions. The cloned T. thermophilus leuS gene and expressed recombinant protein will be used for structural and functional studies on LeuRSTT, including X-ray analysis of the enzyme and its mutant forms in complex with different substrates

The gene encoding tyrosyl-tRNA synthetase (TyrRS) from the extreme thermophilic eubacterium T. thermophilus HB27 has been cloned and sequenced. The open reading frame encodes a polypeptide chain of 432 amino acid residues in length (molecular mass 48717 Da). Comparison of the amino acid sequence of the T. thermophilus TyrRS (TyrRSTT) with those of TyrRS from various organisms shows that T. thermophilus enzyme shares a branch in the philogenetic tree of eubacterial TyrRSs with the enzymes from Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae and Helicobacter pyroly (40-57 % amino acid identity), distinct from the branch containing Esherichia coli, Chlamydia trachomatis and Bacillus stearothermophilus, for example (24–28 % amino acid identity). The TyrRS active site domain is highly conserved, whereas a C-terminal tRNA binding domain contains only few conserved residues. But even in the active site exists one very important difference between the two groups of bacterial TyrRSs: Lys-41 in TyrRSTT (and in TyrRS from many human pathogenic bacteria) is conserved as a tyrosine in another group of bacterial TyrRSs and eukaryotic sequences including human. This knowledge could be exploited in the design of new antibiotics. Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність гена, що кодує тирозил-тРНК синтетазу (TyrRS) із екстремальнотермофільної еубактеріХ Т. thermophilus НВ27 (TyrRSTT). Відкрита рамка зчитування кодує поліпептидний ланцюг до­вжиною 432 амінокислотних залишки (молекулярна маса 48717 Да). Порівняння амінокислотної послідовності TyrRSTT з відповідними послідовностями інших організмів виявило, що фермент із Т. thermophilus належить до тієї ж гілки філо­генетичного дерева еубактеріальних TyrRS, що й ферменти із Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae і Helicobacter pyroly (ідентичність 40–57 %), але не до тієї, до якої належать, наприклад, Escherichia coli, Chlamydia tracho­matis і Bacillus stearothermophilus (24–28 % ідентичності). Амінокислотна послідовність каталітичного домену висококонсервативна, тоді як тРНК-зв'язувальний С-кінцевий домен містить лише невелику кількість консервативних залишків. Але навіть в активному центрі існує важлива відмінність між двома групами еубактеріальних TyrRS: залишок Lys-41 в TyrRSTT (і в TyrRS із багатьох патогенних бактерій людини) представлений консервативним залишком тирозину в бак­теріальних TyrRS іншої групи, а також еукаріотичних TyrRS, включаючи людину. Ця відмінність може бути використана при створенні нових антибіотиків. Клонирован ген, кодирующий тирозил-тРНК синтетазу (TyrRS) из экстремально термофильной эубактерии Т. ther­mophilus НВ27 (TyrRSTT), и определена его нуклеотидная последовательность. Открытая рамка считывания кодирует полипептидную цепь длиной 432 аминокислотных остатка (молекулярная масса 448717 Да). Сравнение аминокислотных последовательностей TyrRSTT с соответствующими последвательностями из других организмов выявило, что фермент из Т. thermophilus относится к той же ветви филогенетиче­ского древа эубактериальных TyrRS, что и ферменты из Aquifex aeolicus, Deinococcus radiodurans, Haemophilus influenzae и Helicobacter pyroly (идентичность 40–57 %), но не к той, к которой принадлежат, например, Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus stearothermophilus (24–28 % идентично­сти). Аминокислотная последовательность каталитического домена высококонсервативна, в то время как тРНК-связывающий С-концевой домен содержит лишь несколько консерва­тивных остатков. Однако даже в последовательности актив­ного центра отмечено важное различие между двумя группами эубактериальных TyrRS: остаток Lys-41 в TyrRSTT (и в TyrRS из многих патогенных бактерий человека) представлен консервативным остатком тирозина в бактериальных TyrRS другой группы, а также в TyrRS эукариот, включая человека Это отличие может быть использовано при создании новых антибиотиков.