Search

Aim. Comparison of the IgG-binding activity of recombinant Staphylococcal protein A with introduced C-terminal cysteine residue (SPA-Cys) or goat anti-human IgG antibodies (anti-IgG) after their immobilization on a gold sensor surface of surface plasmon resonance (SPR) spectrometer. Methods. SPA-Cys or anti-IgG were immobilized on a gold sensor surface to form two variants of a bioselective element of the immunosensor. SPR spectrometry was used for the detection of IgG-binding activity of the immobilized proteins. Results.The SPR sensor response to the immobilization of anti-IgG was more than two times higher than that at the immobilization of SPA-Cys. However, there is almost the double advantage for SPA-Cys in the number of immobilized molecules. Moreover, the bioselective element of the immunosensor based on SPA-Cys showed a much better capability of binding Ig than bioselective element based on anti-IgG. Conclusions.The study on the immobilization of SPA-Cys or anti-IgG on the sensor surface of SPR spectrometer, and the interactions of immobilized proteins with human IgG demonstrated obvious advantages of SPA-Cys. Мета. Порівняння імуноглобулін-зв’язувальної активності козячих антитіл проти IgG людини (анти-IgG) або рекомбінантного білка A Staphylococcus aureus зі спеціально введеним С-кінцевим залишком цистеїну (SPA-Cys) після їх іммобілізації на золотій сенсорній поверхні спектрометра поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Методи. SPA-Cys або анти-IgG були іммобілізовані на золотій сенсорній поверхні для формування двох варіантів біоселективного елементу імуносенсора. Дослідження IgG-зв’язувальної активності іммобілізованих білків проводили за допомогою спектрометрії ППР. Результати. Сенсорний відгук при іммобілізації анти-IgG виявився більш ніж удвічі вищим за відгук, отриманий при іммобілізації SPA-Cys. Однак по кількості іммобілізованих молекул – майже двократна перевага за SPA-Cys. Крім того, біоселективний елемент імуносенсора на основі SPA-Cys значно краще зв’язує IgG, ніж біоселективний елемент на основі анти-IgG. Висновки. Дослідження процесів іммобілізації SPA-Cys або анти-IgG на сенсорній поверхні спектрометра ППР, а також взаємодії іммобілізованих білків з IgG продемонструвало очевидні переваги рекомбінантного білка А. Цель. Сравнение иммуноглобулин-связующей активности козьих антител против IgG человека (анти-IgG) или рекомбинантного белка A Staphylococcus aureus со специально введенным С-концевым остатком цистеина (SPA-Cys) после их иммобилизации на золотой сенсорной поверхности спектрометра поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Методы. SPA-Cys или анти-IgG были иммобилизованы на золотой сенсорной поверхности для формирования двух вариантов биоселективного элемента иммуносенсора. Исследование IgG-связующей активности иммобилизованных белков проводили с помощью спектрометрии ППР. Результаты. Сенсорный отклик при иммобилизации анти-IgG оказался более чем вдвое выше отклика, полученного при иммобилизации SPA-Cys. Однако по количеству иммобилизованных молекул – почти двукратное преимущество за SPA-Cys. Кроме того, биоселективный элемент иммуносенсора на основе SPA-Cys значительно лучше связывает IgG, чем биоселективный элемент на основе анти-IgG. Выводы. Исследование процессов иммобилизации SPA-Cys или анти-IgG на сенсорной поверхности спектрометра ППР, а также взаимодействия иммобилизованных белков с IgG продемонстрировало очевидные преимущества рекомбинантного белка А.

Aim. To investigate the formation of an intermediate layer of the immunosensor bioselective element based on the recombinant protein A from Staphylococcus aureus with cysteine residue (SPA-Cys) and its interactions with human IgG using the SPR spectrometer «Plasmon». Methods. The activity of the immune components applied was tested by ELISA. The spectrometry of surface plasmon resonance was used for studying protein immobilization on a gold sensor surface and interactions between the immobilized SPA-Cys and human immunoglobulin. Results. A direct dependence of the sensor response on the concentration of SPA-Cys in the range of 0.2 to 2 µM at its immobilization was demonstrated. The efficiency of blocking nonspecific adsorption sites on the sensor surface with milk proteins and the direct dependence of the sensor response on IgG concentration and surface density of immobilized SPA-Cys were shown. Fitting the experimental data to a Langmuir plot yields a Kd value for SPA-Cys/IgG binding 8.5 ± 0.7× 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1× 107 M–1). The determined equilibrium binding constant indicates a quite strong interaction and its value is consistent with the literature data. Conclusions. A successful immobilization of SPA-Cys on a gold surface of the SPR spectrometer while preserving its high immunoglobulin-binding activity, selectivity and stability of the sensor response confirms the efficiency of SPA-Cys as an intermediate component for the creation of the immunosensor bioselective elements. Мета. Дослідити формування проміжного шару біоселективного елемента імуносенсора на основі рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його взаємодії з імуноглобуліном людини за допомогою спектрометра ППР "Плазмон". Методи. Активність використаних імунокомпонентів була перевірена за допомогою імуноферментного аналізу. Для вивчення іммобілізації білків на золотій сенсорній поверхні і взаємодій між іммобілізованим SPA-Cys і імуноглобуліном людини застосували спектрометрію поверхневого плазмонного резонансу. Результати. Продемонстрована пряма залежність сенсорного відгуку від концентрації SPA-Cys в діапазоні від 0,2 до 2 мкМ під час його іммобілізації. За допомогою білків молока вдалося ефективно знизити рівень неспецифічної адсорбції на сенсорній поверхні. Була показана пряма залежність сенсорного відгуку від концентрації IgG і поверхневої густини іммобілізованого SPA-Cys. Апроксимація експериментальних даних графіком ізотерми Ленгмюра дає значення Kd для взаємодії іммобілізованого SPA-Cys із IgG 8,5 ± 0,7 × 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1 × 107 М-1). Отримана величина рівноважної константи зв'язування вказує на досить сильну взаємодію, і її значення узгоджується з літературними даними. Висновки. Успішна іммобілізації SPA-Cys на золотій поверхні спектрометра ППР при збереженні його високої IgG-зв'я­зувальної активності, селективності та стабільності сенсорного відгуку підтверджує ефективність SPA-Cys як проміжного компонента для створення біоселективного елемента імуносенсора. Цель. Исследовать формирование промежуточного слоя био­селективного элемента иммуносенсора на основе рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его взаимодействие с иммуноглобулином человека с помощью спектрометра ППР "Плазмон". Методы. Активность использованных иммунокомпонентов была проверена с помощью иммуноферментного анализа. Для изучения иммобилизации белков на золотой сенсорной поверхности и взаимодействий между иммобилизованным SPA-Cys и человеческим иммуноглобулином применили спектрометрию поверхностного плазмонного резонанса. Результаты. Продемонстрирована прямая зависимость сенсорного отклика от концентрации SPA-Cys в диапазоне от 0,2 до 2 мкМ при его иммобилизации. С помощью белков молока удалось эффективно снизить уровень неспецифической адсорбции на сенсорной поверхности. Была показана прямая зависимость сенсорного отклика от концентрации IgG и поверхностной плотности иммобилизованного SPA-Cys. Аппроксимация экспериментальных данных графиком изотермы Ленгмюра дает значение Kd для взаимодействия иммобилизованного SPA-Cys с IgG 8,5 ± 0,7 × 10-8 M (Ka = 1.2 ± 0.1 × 107 М-1). Полученная величина равновесной константы связывания указывает на достаточно сильное взаимодействие, и ее значение согласуется с литературными данными. Выводы. Успешная иммобилизация SPA-Cys на золотой поверхности спектрометра ППР при сохранении его высокой IgG-связывающей активности, селективности и стабильности сенсорного отклика подтверждает эффективность SPA-Cys в качестве промежуточного компонента для создания биоселективного элемента иммуносенсора.

Aim. The development of a laboratory method for the production of immunoaffinity chromatography medium for the purification of the recombinant human IFN-β1b. Methods. A gene of the chimeric protein ScFvbINF-CBD was constructed using the DNA sequences encoding ScFv specific to hIFN-β1b and the cellulose-binding domain (CBD) of Clostridium thermocellum. The developed chimeric protein was expressed in Escherichia coli cells. The target protein was obtained in soluble, functionally active form by its renaturation from the bacterial inclusion bodies in vitro. The ScFvbINF-CBD was immobilized on a chitin carrier. Results. The introduction of CBD by gene engineering techniques enabled the oriented non-covalent immobilization of ScFvbINF-CBD on chromatographic matrix. The developed immunoaffinity medium allowed isolating the rhIFN-β1b from the complex mixture, after its renaturation from the inclusion bodies, with more than 89 % purity. Conclusion. The designed immunoaffinity medium provides isolating the rhIFN-β1b from the complex protein mixtures. Мета. Розробити лабораторний метод створення імуноафінного хроматографічного сорбенту для виділення та очищення рекомбінантного IFN-β1b людини. Методи. Викорис­то­ву­ючи послідовності ДНК, які кодують ScFv специфічні до hIFN-β1b, та целюлозозв’язувальний домен (CBD) Clostri­di­um thermocellum, створено ген химерного протеїну ScFvbINF-CBD. Проведено експресію створеного химерного протеїну в клітинах Escherichia coli. Цільовий білок одержували у розчинній, функціонально активній формі шляхом ренатурації з бактеріальних тілець включення in vitro. ScFvbINF-CBD іммобілізували на хітиновому носії. Результати. Вве­дення CBD до складу химерного білка забезпечує орієнтовану, не ковалентну іммобілізацію ScFvbINF-CBD на хроматографічній матриці. За допомогою створеного імуноафінного сорбенту було виділено rhIFN-β1b зі складної суміші білків, одержаної після його ренатурації з тілець включення, з чистотою більше ніж 89 %. Висновки. Створений імуноафінний хроматографічний сорбент дозволяє виділяти рекомбінантний IFN-β1b людини зі складних сумішей білків. Цель. Разработать лабораторный метод создания иммуноаффинного хроматографического сорбента для выделения и очистки рекомбинантного IFN-β1b человека. Методы. Ис­по­льзуя последовательности ДНК, кодирующие ScFv специ­фичные к hIFN-β1b, и целлюлозосвязывающий домен (CBD) Clostridium thermocellum, создан ген химерного белка ScFvbINF-CBD. Проведена экспрессия созданного химерного белка в клетках Escherichia coli. Целевой белок получали в растворимой, функционально активной форме путем ренатурации из бактериальных телец включения in vitro. ScFvbINF-CBD иммобилизовали на хитиновом носителе. Результаты. Вве­дение CBD в состав химерного белка обеспечивает ориентированную не ковалентную иммобилизацию ScFvbINF-CBD на хроматографической матрице. С помощью созданного иммуносорбента был выделен rhIFN-β1b из сложной смеси белков, полученной после его ренатурации из телец включения, с чистотой более 89 %. Вы­воды. Созданный иммуноаффинный хроматографический сорбент позволяет выделять рекомбинатный IFN-β1b человека из сложных белковых смесей.

Aim. The creation of genetically engineered fusion protein SPA-BAPmut and its application as a secondary immunoreagent in immunoassays. Methods. Gene cloning, PCR, electrophoresis, DNA sequencing, bacteria cells culturing, protein expression and purification, ELISA, Western-blotting were used. Results. The DNA sequences encoding Staphylococcus aureus protein A (SPA) and bacterial alkaline phosphatase with enhanced catalytic activity (BAPmut) were used for construction of gene encoding fusion protein SPA-BAPmut that was expressed in the high-productive Escherichia coli system and obtained in a soluble form. Cultivation conditions to provide a high-level expression of SPA-BAPmut (> 1 g/l) were determined. The target protein was obtained with purity more than 95 % using IMAX method. SPA-BAPmut is thermostable, and both parts of fusion protein (SPA and BAPmut) retain their IgG binding and alkaline phosphatase activity for a long time. SPA-BAPmut was used as a substitute of secondary antibodies in immunoassays. As little as 5 ng of the antigen could be detected in Western blotting and 1 g/ml of IgG in ELISA. Conclusions. The possibility of using SPA-BAPmut as universal secondary immunoreagent for different types of immunoassays was shown. Мета. Створення генно-інженерного злитого білка SPA-BAPmut та його застосування як вторинного імунореагенту в імунологічних тестах. Методи. Клонування генів, ПЛР, секвенування ДНК, культивування бактерій, електрофорез, синтез і очищення білків, ELISA, вестерн-блот. Результати. З використанням послідовновностей ДНК, що кодують білок А Staphylococcus aureus (SPA) і бактерійну лужну фосфатазу з покращеними каталітичними властивостями (BAPmut), сконструйовано ген злитого білка SPA-BAPmut та забезпечено його препаративне отримання у розчинній формі внаслідок синтезу в клітинах Escherichia coli. Визначено умови ферментації, за яких вихід SPA-ВAPmut становить приблизно 1 г/л культури E. coli. Із застосуванням методу металоафінної хроматографії одержано цільовий білок з чистотою понад 95 %. SPA-ВAPmut термостабільний, а обидва його компоненти (SPA і ВAPmut) зберігають імуноглобулінзв’язувальну і фосфатазну активність тривалий час. SPA-BAPmut дозволяє виявляти щонайменше 5 нг антигену та 1 мкг/мл антитіл. Висновки. Показано можливість використання SPA-ВAPmut як універсального вторинного імунореагенту в імунохімічних тестах. Цель. Создание генно-инженерного слитого белка SPA-BAPmut и eго использование как вторичного иммунореагента в иммунологических тестах. Методы. Клонирование генов, ПЛР, секвенирование ДНК, культивирование бактерий, электрофорез, биосинтез и очистка белков, ELISA, вестерн-блот. Результаты. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих белок А Staphylo- coccus aureus (SPA) и бактериальную щелочную фосфатазу с улучшенными каталитическими свойствами (BAPmut), сконструирован ген слитого белка SPA-BAPmut и обеспечено его препаративное получение в растворимой форме вследствие синтеза в клетках Escherichia coli. Определены условия ферментации, при которых выход SPA-ВAPmut составляет около 1 г/л культуры E. coli. С применением метода металлоаффинной хроматографии целевой белок получен с чистотой более 95 %. SPA-ВAPmut термостабилен, а оба его компонента (SPA и ВAPmut) сохраняют иммуноглобулинсвязывающую и фосфатазную активность на протяжении длительного времени. SPA-BAPmut позволяет детектировать 5 нг антигена и 1 мкг/мл антител. Выводы. Показана возможность применения SPA-ВAPmut как универсального вторичного иммунореагента в иммунохимических тестах.

Цель. Создание биоаффинного сорбента на основе ориентированно иммобилизованного белка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целлюлозосвязывающих домена (СBD) Clostridium thermocellum и его применение для очистки антител. Методы. С использованием последовательностей ДНК, кодирующих SPA и два СBD, сконструирован ген слитного белка SPA-CBD2 и обеспечено его получение в растворимой форме экспрессией в клетках Escherichia coli. Целевой белок иммобилизовали методом биоаффинного связывния на микрокристаллической целлюлозе. Результаты. Установлены такие характеристики биоаффинного сорбента, как емкость (1 мг SPA-CBD2 /1 мл целлюлози), динамическая емкость (3 мг иммуноглобулинов мыши/1 мл сорбента) и продуктивность, а также показана его стабильность при долгосрочном хранении. С помощью биоаффинного сорбента выделены фракции иммуноглобулинов с чистотой более 95 %. Определено, что очищенные таким способом антитела с высокой чувствительностью выявляют соответствующие антигены. Выводы. Предложенный биоаффинный сорбент позволяет получать очищенные функционально активные полии моноклональные антитела, а также проводить фракционирование на подклассы иммуноглобулинов G мыши. Ключевые слова: антитела, белок А, целлюлозосвязывающий домен, иммобилизация белка, аффинная хроматография. Мета. Створення біоафінного сорбента на основі орієнтовано іммобілізованого білка А Staphylococcus aureus (SPA) через два целюлозозв’язувальних домени (СBD) Clostridium thermocellum та його застосування для очищення антитіл. Методи. З використанням послідовностей ДНК, кодуючих SPA і два СBD, сконструйовано ген злитого білка SPA-CBD2 та забезпечено його отримання в розчинній формі експресією у клітинах Escherichia coli. Цільовий білок іммобілізовано методом біоафінного зв’язування на мікрокристалічній целюлозі. Результати. Встановлено такі характеристики біоафінного сорбента, як ємність (1 мг SPACBD2/1 мл целюлози), динамічна ємність (3 мг імуноглобулінів миші/1 мл сорбента) і продуктивність, а також показано його стабільність при тривалому зберіганні. За допомогою біоафінного сорбента виділено фракції імуноглобулінів з чистотою понад 95 %. Визначено, що очищені у такий спосіб антитіла з високою чутливістю виявляють відповідні антигени. Висновки. Запропонований біоафінний сорбент дозволяє отримувати очищені функціонально активні поліі моноклональні анттіла, а також проводити фракціонування на підкласи імуноглобулінів G миші. Ключові слова: антитіла, білок А, целюлозозв’язувальний домен, іммобілізація білка, афінна хроматографія. Aim. The obtaining of bioaffinity sorbent based on the immobilized protein A of S. aureus (SPA) using two cellulose-binding domains (CBD), and its application for purification of antibodies. Methods. The DNA sequences encoding SPA and two CBD were genetically fused, expressed in the high-productive Escherichia coli system and the protein SPA-CBD2 was obtained in a soluble form. The SPA-CBD2 fusion protein was affinity immobilized on the microcrystalline cellulose. Results. Capacity of bioaffinity sorbent (1 mg SPA-CBD2/1 ml CC31-cellulose), dynamic capacity (3 mg mouse IgG/1 ml bioaffinity sorbent), efficiency and stability during prolonged storage were determined. The bioffinity sorbent was used for purification of antibodies. The purity of antibodies in eluted fractions was more than 95 %. The purified antibodies detected target antigens with a high sensitivity. Conclusions. The designed bioaffinity sorbent provides obtaining pure poly- and monoclonal antibodies in functionally active form and can be useful for the fractionation of mouse immunoglobulin G. Keywords: antibodies, protein A, cellulose-binding domain, protein immobilization, affinity chromatography.

Antibodies against cell-surface proteins play an important role in cell detection, separation and determination of differentiation stage. The globular structure of extracellular region of cell-surface antigens is frequently characterized by heavily glycosilation and/or is stabilized by disulphide bonds. In this case the obtaining of antibodies against such proteins is a substantive problem. Aim. The development of strategy for obtaining recombinant antibodies against cell-surface biomarkers. Methods. The research strategy is based on the construction of cDNA library of VH and VL genes of animals, immunized with recombinant antigen, and subsequent cell-based biopanning for the library enrichment with desired phage clones. High-throughput automated systems were used for the detection and isolation of antigen-specific clones. Results. We have obtained a panel of five antibodies that recognize an antigen on CD34+ cell surface using the methods of immunocytochemistry and flow cytometry. Conclusions. The proposed strategy may be used for obtaining antibodies against cell-surface antigens

Aim. Engineering of recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue (SPA-Cys) for preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of bioselective element of immunosensor. Methods. DNA sequences encoding IgG-binding region of SPA, His-tag and cysteine were genetically fused and expressed in E. coli. SPA-Cys was immobilized on maleimide-functionalized silica beads for affinity chromatography stationary phase preparation and on a gold sensor surface as a bioselective element of immunosensor. Results. SPA-Cys was expressed at a high-level in a soluble form. The target protein was purified and showed a high IgG-binding activity. The capacity of the obtained SPA-Cys-based affinity chromatography stationary phase was 10–12 mg of IgG /ml. The purity of eluted IgG was more than 95 % in one-step purification procedure. The developed SPA-Cys-based bioselective element of immunosensor selectively interacted with human IgG and did not interact with the control proteins. Conclusions. The recombinant Staphylococcal protein A with cysteine residue was successfully used for the preparation of affinity chromatography stationary phase and formation of the bioselective element of immunosensor. Цель. Получение рекомбинантного белка А Staphylococcus aureus с остатком цистеина (SPA-Cys) и его применение для аффинной хроматографии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Методы. Генно-инженерными методами конструировали и экспрессировали в E. coli последовательность ДНК, которая кодирует пять IgG-связывающих доменов SPA, His-таг и цистеин. Полученный рекомбинантный белок SPA-Cys иммобилизовали на малеимид-активированных микрогранулах силикагеля для приготовления биоафинного сорбента и на золотой сенсорной поверхности для разработки иммуносенсора. Результаты. Cинтезом в E. coli был получен белок SPA-Cys в растворимой форме с высоким выходом. Очищенный рекомбинантный белок А имеет высокую IgG-связывающую активность. Емкость синтезированного с использованием SPA-Cys биоафинного сорбента составляла 10–12 мг IgG/мл. Одностадийная процедура аффинной хроматографии сыворотки крови позволяет получать IgG с чистотой более 95 %. Показано, что биоселек­тивный элемент иммуносенсора, сформированный на ос­нове SPA-Cys, избирательно взаимодействует с IgG человека и не взаимодействует с контрольными белками. Выво­ды. Рекомбинантный белок SPA-Cys был успешно использован для приготовления стационарной фазы аффинной хро­ма­то­графии и формирования биоселективного элемента иммуносенсора. Мета. Отримання рекомбінантного білка А Staphylococcus aureus із залишком цистеїну (SPA-Cys) та його застосування для афінної хроматографії та формування біоселективного елемента імуносенсора. Методи. Генно-інженерними методами конструювали та експресували в E. coli послідовність ДНК, яка кодує п’ять IgG-зв’язувальних доменів SPA, His-таг і цистеїн. Отриманий рекомбінантний білок SPA-Cys іммобілізували на малеїмід-активованих мікрогранулах силікагелю для приготування біоафінного сорбенту та на золотій сенсорній поверхні для розробки імуносенсора. Результати. Cин­те­зом у E. coli був отриманий білок SPA-Cys в розчинній формі з високим виходом. Очищений рекомбінантний білок А має високу IgG-зв’язувальну активність. Ємність біоафінного сор­бенту з іммобілізованим SPA-Cys складала 10–12 мг IgG/мл. Одностадійна процедура афінної хроматографії сироватки кро­ві дозволяє отримувати IgG з чистотою більш ніж 95 %. По­казано, що біоселективний елемент імуносенсора, сформований на основі SPA-Cys, вибірково взаємодіє з IgG людини і не взаємодіє з контрольними білками. Висновки. Рекомбінантний білок SPA-Cys був успішно використаний для приготування стаціонарної фази афінної хроматографії і формування біоселективного елемента імуносенсора.