Tez (Yüksek Lisans) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2012, Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2012, Gıda endüstrisinde ve biyoteknolojide bir çok üretim süreci ekmek mayası üzerinden yürütülmektedir. Bu üretim süreçlerinde maya hücreleri çok çeşitli stress koşullarına maruz kalmaktadır. Endüstriyel üretimlerindeki bu maya süreçlerinin verimini arttırmak, hücrelerin süreç boyunca maruz kalacağı stress koşullarına karşı dirençli hale getirilmesiyle sağlanabilir. Bu sebeple, hem endüstride maya kullanımını geliştirmek hem de ileri ökaryotlarda stres cevaplarına bir model sağlamak amacı ile Saccharomyces cerevisiae mayası evrimsel mühendislik yöntemleri ile çeşitli streslere dirençli hale getirilmeye çalışılmaktadır. Günümüze kadar bu mayanın etanol, ağır metaller, donma erime, hidrojen peroksit gibi faktörlere karşı dirençli suşları elde edilmiştir. Bu dirençli suşların endüstride kullanılabilirliğinin araştırılması için strese dirençli suşların karakterizasyonu ve sürdürülebilirlik testlerinin yapılması önemlidir. Bu çalışmada, daha önceden evrimsel mühendislik yöntemleri ile elde edilmiş NaCl tuzuna dirençli Saccharomyces cerevisiae T8 mutantı ile yaban tip karakterize edilmiş ve birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Çalışmada karakterizasyon işlemleri iki adımda yapılmıştır. Birinci adımda, yaban tip ve mutant hücrelerin tuzlu ortamdaki farklılıklarının anlaşılması amacıyla T8 ve yaban tip hücreler biyoreaktörde kontrol ve %5 (w/v) NaCl içeren besiyerlerinde üretilmiştir. Biyoreaktördeki her bir üreme koşulu ve her bir suş için, üreme fizyolojisi, hücre içi metabolit üretim oranları ve morfolojik farklılıkları araştırılmıştır. Ayrıca, hücre içi metabolik aktiviteler hakkında ayrıntılı bilgi edinebilmek için suşların oksijen tüketim ve karbondioksit üretim miktarları kaydedilmiş, bu değerler ile her suşa-koşula ait solunum katsayısı hesaplanmıştır. Biyoreaktör, sıcaklık, pH, çalkalama hızı gibi inkübasyon değişkenlerini her bir suş-koşul için aynı tutabilme özelliği ile mutant hücreler ve yaban tip hücreler arasında sağlıklı karşılaştırma yapma olanağı sağlamıştır. Her bir fermentasyonda biyoreaktör koşulları 30ºC sıcaklık, pH 4,5 ve 700 rpm çalkalama hızında tutularak her suş-koşul için eşit şartlar sağlanmıştır. Biyoreaktör ile yapılan inkübasyonlarda üç farklı parametreye gore büyüme eğrileri elde edilmiştir. Bunlardan birincisi spektrofotometre ile 600 nm’de hücre miktarının ölçülmesi ile, ikincisi kuru ağırlık tartımı ile, üçüncüsü ise direkt hücre sayımı ile elde edilmiştir. Spektrofotometrik ölçümler ile elde edilen eğride yüksek tuz konsantrasyonunun hem mutant hem de yaban tip hücrelerin büyümesini inhibe ettiği, ancak büyüme engellenmesinin yaban tipte daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Hesaplanan spesifik büyüme katsayıları da bu gözlemi doğrulamıştır. Kuru ağırlık ölçümleri ile elde edilen eğrilerde tuz konsantrasyonu yüksek olan ortamda hem yaban tip hem de mutant suşlar yeterli büyüme gösteremediğinden dolayı sadece inkübasyonun 24.saatinde ölçüm yapılabilmiş ve büyüme eğrisi elde edilememiştir. Direkt hücre sayımı ile elde edilen büyüme eğrilerinde kontrol koşullarında yaban tip ve mutant arasında, diğer büyüme eğrilerinde gözlenmeyen, beklenmedik bir farklılık gözlenmiştir. Bu farklılığın sebebi; sayımdaki hata payının, mutant hücrelerin birbirlerine yapışma özelliğinden dolayı, muhtemel yüksekliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür. Her ne kadar kuru ağırlık ve direkt hücre sayımları ile elde edilen büyüme eğrilerinde eksik noktalar olsa da, tuz stres koşullarında mutant hücrelerin daha hızlı ve fazla büyüdüğü her büyüme eğrisinde açıkça gözlenmiştir. Yaban tip ve mutant hücrelerin kontrol ve tuz stresi içeren ortamdaki fermentasyonlarına ait CO2 ve O2 ölçümleri de stresli ortamda mutant hücrenin daha iyi büyüdüğünü, hatta yaban tipin stresli ortamda hiç bir metabolik faaliyet gösteremediğini desteklemektedir. Ayrıca gaz analizlerinde, özellikle kontrol koşullarında inkübasyonun ilk 10 saatinde maya hücreleri üzerindeki Crabtree etkisi açıkça gözlenmiştir. Solunum katsayılarının bu sure içinde 1’den çok büyük olması hücrelerin aerobic ortamda, solunumla eş zamanlı olarak fermentasyon da yaptığının göstergesidir. Solunum katsayısı eğrileri, HPLC analizi ile elde edilmiş glikoz tüketim miktarı ve etanol üretim miktarı eğrileri ile karşılaştırıldığında; Crabtree etkisinin gözlendiği ilk 10 saatin glikozun tüketilip tamamen bitirildiği etanolün ise devamlı olarak üretildiği zaman dilimine denk geldiği görülmüştür. Inkübasyonun 10.saatinden sonra glikozun tükenmesiyle, önceden üretilen etanol karbon kaynağı olarak solunumda kullanılıp tüketilmeye başlanmıştır. Bu da inkübasyonun 10.saatinden sonra solunum katsayısında 1 civarına düşüşlere sebep olmuştur. Bunun yanısıra, etanol, gliserol ve asetat üretiminin ölçüldüğü HPLC analizi sonuçlarına göre, stres koşullarında mutant hücreler adı geçen her üç metabolitin üretimini en yüksek düzeyde yapmıştır. Mutant hücrede gliserol üretiminin artması; aydınlatılmış osmotik stres direnç mekanizmasının direkt sonucu olarak düşünülmüştür. Ancak etanol ve asetat üretim miktarlarındaki artış tuz stress direnci mekanizmasının sadece gliserol ile değil diğer hücre içi metabolit üretim süreçleri ile de bağlantılı daha karmaşık bir yapısı olduğunu düşündürmüştür. Suşlar arasında kontrol ve tuz stresi içeren ortamlardaki trehaloz ve glikojen üretim miktarları karşılaştırılmıştır. Mutant suşun, stres koşulları altında yaban tipten daha fazla trehaloz ve glikojen ürettiği gözlenmiştir. Trehaloz ve glikojen molekülleri stres koşulları altında hücreyi koruma mekanizmasındaki genel rolüyle bilinmektedir. Bu sebeple tuz mutantında, strese karşı direnç sağlanmasında trehaloz ve glikojen üretim süreçlerinde meydana gelmiş olası bir modifikasyonun rolünün de olabilieceği düşündüldü. Mutant ve yaban tip hücrelerinin morfolojik farklılıkları öncelikle faz contrast mikroskobu ile karşılaştırılmıştır. Mikroskop ile yapılan araştırmada hücreler arasındaki en belirgin morfolojik farklılık mutant hücrelerinde görülen flokulasyon olmuştur. Ayrıca flokulasyon oranının artan tuz konsantrasyonu ve inkübasyon süresi ile doğru orantılı olarak arttığı gözlenmiştir. Flokulasyon oranındaki bu artışın sebebi, yüksek miktarda tuz içeren ortam ile hücrelerin temas yüzeyini azaltmanın olası avantajı olarak düşünülmüştür. Morfolojik farklılık araştırmalarına, invasiv büyüme deneyi, plastik adezyon testi ve kalsiyum bağımlı flokulasyon testi ile devam edilmiştir. Bu üç deneye, yaban tip ve mutant hücrelere ek olarak, flo11 geni PCR bazlı delesyon ile silinmiş mutant suş da (T8 flo11:KANMX) dahil edilmiştir. flo11 geni maya hücrelerinde flokulasyondan sorumlu gendir. Önceki çalışmalarda tuz stresine dayanıklı mutant T8 suşunda bu genin ifadesinin arttığı saptanmıştır. Bu sebeple flo11 geninin mutant hücredeki morfolojik değişikliklere katkısını görmek amacıyla bu suş da çalışmaya dahil edilmiştir. Invasiv büyüme deneyinde, suşlar 5 gün boyunca YPD agar besiyerinde büyütülmüş ve daha sonra sabit hızla akan çeşme suyunun altında yıkanarak hangi suşun agar içine doğru tutunarak büyüdüğü araştırılmıştır. Bu deney sonucunda, mutant hücrenin agar içine doğru büyüme oranı yaban tipten daha fazla gözlenmiştir. Ayrıca flo11 geni silinmiş mutant suşta agar içine doğru büyüme hiç gözlenmemiştir. Plastik adezyon testinde ise tuz mutantı en fazla adhezyonu gösteren suş olarak belirlenmiş ve besiyerinde glikoz konsantrasyonu arttıkça mutantın adhezyon oranının da arttığı gözlenmiştir. Kalsiyum katyonuna bağımlı flokulasyon araştırmasında ise, hücrelerin flokulasyon oranı flokulasyon engelleyici madde (EDTA) varlığında ve kalsiyum klorür varlığında ölçülerek kalsiyum katyonunun maya hücrelerinin flokulasyon oranına etkisi hesaplanmıştır. Bu deney sonucunda da tuz mutantı kalsiyum katyonuna bağlı flokulasyonu en yüksek oranda gösteren suş olarak belirlenmiştir. Ancak, beklenmedik bir şekilde flo11 geni silinmiş tuz mutantı yaban tipten daha fazla flokulasyon göstermiştir. Bu durum, maya hücrelerinde kalsiyuma bağımlı flokulasyonun sadece flo11 genine bağlı olmadığını, flo gen ailesinin diğer bireylerinden de etkileniyor olabileceğini düşündürmüştür. Ayrıca tuz mutant hücrelerinin yüksek flokulasyon oranının tuz sresiyle direk bağlantılı olduğu düşünülmesine rağmen; flo11 geni silinmiş mutant hücrelerin tuz stresi içeren koşullarda; flo11 geni silinmemiş mutant hücreler ile yarışabilecek kadar iyi büyüyebilmiş olması, flo gen ailesi ile ilgili bu düşünceyi desteklemiştir. Çalışmanın ikinci bölümüde, kontrol ve NaCl stresi içeren ortamlarda üretilmiş T8 ve yaban tip suşların hücre içi proteinleri iki boyutlu jel elektroforezi yöntemiyle karşılaştırılmıştır. Bunun için ilk once suşların hücre içi proteinleri French press uygulaması ile izole edilmiş ve Bradford tayini ile protein miktarları belirlenmiştir. Suşların hücre içi proteinleri hakkında genel bir bilgiye sahip olmak için öncelikle SDS PAGE uygulaması yapılmış ancak suşların proteinleri arasında belirgin bir farklılık gözlenmemiştir. Daha sonra bu örnekler ile 2 boyutlu jel elektroforezi yapılmış ve suşların hücresel proteinleri hem büyüklüklerine gore hem de izoelektrik noktalarına gore birbirlerinden ayrılmıştır. Protein analizi sonuçlarına göre, iki suşun da proteinleri birbirlerine benzer bir şekilde 30-60 kDa boyutları arasında yoğunlaşmış ve bu proteinlerin izoelektrik noktaları 6 ile 10 arasında değişiklik göstermiştir. Ancak, yaban tip ve mutant hücrelerin kontrol ve NaCl- stresli ortamda üretilmiş kültür örnekleri arasında kendi içlerinde 25 kDa‘dan küçük boyutlu izoelektrik noktası 5 ile 7 arasında olan proteinlerde farklılık gözlenmiştir. Ancak bu farklılığın var olduğundan emin olmak için aynı örnekler ile 2 boyutlu el elektroforezi tekrar edilmeli ve protein farklılığı araştırması için daha hassas metodlar kullanılmalıdır. Bu çalışmada analiz edilen proteinler suşların hücre içi proteinleridir. Ancak, ozmotik stres direnci mekanizmasının membran geçirgenliği ile direkt alakasından dolayı mutant ve yaban tip hücrelerin membran proteinlerinin araştırılması; bu iki suş arasındaki proteome farklılıklarının saptanmasında etkili bir yöntem olabilir. Ayrıca, flo11 genine ek olarak flo ailesine ait diğer genlerin tuz mutantında delesyonu yapılarak bu çalışmada yapılan morfoloji karşılaştırma testleri yeni delesyonlu hücrelere uygulanabilir. Ayrıca bu genlerin yaban tip ve mutant hücrelerdeki ifade oranları microarray uygulaması ile araştırılabilir. Böylece, tuz mutantının gösterdiği yüksek flokulasyona sebep olan mekanizma daha iyi anlaşılabilir. Tuz stresine dirençli mutantın, tuz stres koşulları altında asetat üretim metabolizması indükleyen sebepler, bu sebeplerin diğer metabolik süreçler ve özellkle Crabtree etkisi ile ilişkisi araştırılarak asetat üretiminin ozmotik stres direnci üzerindeki etkisi araştırılabilir. Ayrıca, tuz stresinin ağır metaller, donma erime stresi, etanol, hidrojen peroksit vb. stress faktörleri ile olası çapraz dirençleri incelenebilir. Saccharomyces cerevisiae mayası ile yapılan bu çalışmada tuza dirençli maya suşu incelenerek, direncin fenotipik etkileri ve mekanizması anlaşılmaya çalışılmıştır. Bu çalışma, mayada başka streslere dirençli suşların direnç mekanizmaları ile birleştirilerek; S.cerevisiae’de ortak stres direnç mekanizmalrı aydınlatılabilir ve bu gelişmiş ökaryotik canlılardaki stres mekanizmalrı için bir temel oluşturabilir., In food industry and biotechnology, plenty of processes involve Baker’s yeast. In these processes yeast cells are exposed to a variety of stress conditions. To advance the yield of processes driven by yeast cells, studies on obtaining stress resistant yeast strains are necessary. Characterization and sustainabilty tests of obtained stress resistant yeasts are also important. In this study, salt resistant Saccharomyces cerevisiae strain T8, which was previously obtained by evolutionary engineering, and wild type strain were characterized and compared with each other. Characterization was made in two steps, first of which was carried out by incubating the strains in a bioreactor. Since mutant T8 is NaCl resistant, both wild type and T8 strains were incubated in control medium and 5% (w/v) NaCl containing medium to have an eloquent data which demonstrate difference between w/t and mutant strains in salt stress conditions. While incubating these different strains in bioreactor, both with the control and salt stress containing medium, growth physiology, internal metabolite production rates, and morphology of the strains were investigated. Additionally, their oxygen consumption and carbondioxide production rates were determined to calculate their respiratory quotients that provided detailed information on the internal metabolic activity. According to the bioreactor experiments, in 5% NaCl stress containing medium, mutant T8 grew more and faster than the wild-type (w/t) and had higher glucose consumption rates. Moreover, the mutant had higher glycerol, acetate and ethanol production rates and yields than the wild type under stress conditions. When the off-gas analysis of carbondioxide and oxygen for T8 and w/t were compared; it was found that in stress conditions wild type cells could not perform any metabolic activies, while they showed better activities in control conditions than the mutant T8. Additionally, T8 mutant and w/t differed from each other in morphological properties. According to results of flocculation tests, T8 cells showed much higher flocculation rates than the w/t, and their flocculation rate and floc size became higher with increasing NaCl level and time of incubation. In the second part of this study, cellular proteins of both mutant and w/t cells; which were grown in control and NaCl stress medium, were compared by 2D gel electrophoresis. According to these results, both strains’ cellular proteins are similar as they were generally similar: they were mostly in the size of 30-60 kDa and had an isoelectric point between 6-10. However, there may be a difference in the cellular proteins which are smaller than 25 kDa and have an isoelectric point around 5-7, between the samples that were taken from the control medium and cultures exposed to NaCl stress for both wild -type and the mutant., Yüksek Lisans, M.Sc.