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L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est une complication clinique associée à une mortalité significative. Parmi les diverses causes d'IRA, l'ischémie-reperfusion (IRI) est une étiologie importante, en particulier dans le contexte de la transplantation rénale. Les types de mort cellulaire programmée (MCP) activées dans l'IRA induite par IRI ont été étudiées par des nombreux groupes. L’atteinte tubulaire épithéliale est classiquement considérée comme le principal contributeur à l'IRA.En effet, plusieurs morts programmées de cellules tubulaires ont été démontrées dans la littérature. Cependant, les lésions endothéliales microvasculaires rénales attirent davantage l'attention en tant qu'inducteurs cruciaux de dysfonctionnement microvasculaire et de fibrose rénale progressive. Ainsi, certaines équipes de recherche, dont la nôtre a rapporté le développement de l'apoptose endothéliale rénale en association avec l’IRI. Le but de mon travail était donc de caractériser les types de mort cellulaire microvasculaires secondaires à l’IRI et leur contribution à la dysfonction rénale. Pour évaluer l'importance de l'apoptose dans l'IRA induite par IRI, nous avons utilisé un modèle murin d’IRI chez des souris caspase-3 knock-out (KO) et sauvages, avec clampage de l'artère rénale pendant 30 minutes (modèle IRA légère) ou 60 minutes (modèle IRA sévère). Dans le modèle IRA légère, notre résultat montre que la carence en caspase-3 empêche la mort apoptotique des cellules endothéliales dans toutes les phases de l'IRA, atténuant la raréfaction microvasculaire, le dépôt de collagène et la fibrose rénale. L’absence de caspase-3 favorise aussi le maintien d’une perméabilité endothéliale microvasculaire normale à long terme. Toutefois, l’invalidation de la caspase-3 aggrave la mort cellulaire tubulaire à court terme en favorisant la nécroptose, mais améliore l’homéostasie tubulaire à long terme grâce à la préservation des capillaires péritubulaires (PTCs) permettant un maintien de la perfusion tubulaire. En outre, le déficit en caspase-3 est également associé à un effet protecteur contre la raréfaction microvasculaire rénale, la fibrose rénale progressive, ainsi qu'une perméabilité endothéliale améliorée et une préservation de la fonction rénale dans le modèle d’IRA sévère. En conclusion, nos résultats démontrent l'effet crucial de l’apoptose endothéliale microvasculaire en tant qu'inducteur de dysfonctionnement microvasculaire rénal, de raréfaction microvasculaire et de fibrose rénale progressive dans la physiopathologie de l'IRA légère et sévère induite par l'IRI. Ils établissent aussi l’importance prédominante de l’atteinte microvasculaire plutôt que tubulaire épithéliale dans la prédiction de la perte de fonction rénale à long terme suite à une IRI., Acute kidney injury (AKI) is a crucial clinical event, with increasing incidence and mortality. Among various pathogenesis of AKI, ischemia-reperfusion injury (IRI) is an important etiology, especially in the renal post-transplant scenario. The complex of programmed cell deaths (PCD) developed in IRI-induced AKI has been proven in a number of investigations. Renal tubular epithelial injury has been considered as the major contributor in AKI and multiple programmed tubular epithelial cell (TECs) deaths have been demonstrated in the literature. However, renal microvascular endothelial injury is attracting more attention as an important inducer of microvascular dysfunction and renal progressive fibrosis. Some investigators, including our team, have reported the development of renal endothelial apoptosis in the condition of ischemia. Apoptosis, a commonly known programmed cell death, has been elucidated in both renal TECs and microvascular endothelial cells (ECs) post-IRI and the activation of caspase-3 functions as the key effector of caspase-dependent apoptosis. To verify the importance of apoptosis in IRI- induced AKI, we applied the in vivo murine renal IRI model in wild-type and caspase-3 KO mice, with clamping the renal artery for 30 minutes (mild AKI model) or 60 minutes (severe AKI model). In regard to the mild AKI model, our result demonstrates that caspase-3 deficiency prevents ECs apoptotic death in all phases of AKI, attenuating microvascular rarefaction, collagen deposition, and renal fibrosis, while maintaining physical endothelial permeability in the long-term. Meanwhile, caspase-3 deletion aggravates tubular injury in the short-term by promoting TECs necroptosis but ameliorates long-term tubular injury through preserved peritubular capillaries (PTCs) function. Furthermore, caspase-3 deficiency also demonstrated a protective effect against renal microvascular rarefaction, progressive renal fibrosis, as well as enhanced endothelial permeability in the severe AKI model. Conclusively, our findings determine the crucial effect of microvascular endothelial apoptosis as an inducer of renal microvascular dysfunction, microvascular rarefaction, and progressive renal fibrosis in the pathophysiology of mild and severe AKI induced by IRI. Additionally, our results demonstrate the predominant importance of microvascular endothelial injury over tubular epithelial injury in predicting renal function loss at long-term post-IRI.

La fibrose péri-prothétique est la complication la plus fréquente de la reconstruction mammaire par implant et se manifeste cliniquement par une contracture capsulaire. Cette complication est d'autant plus fréquente et sévère chez les patientes ayant nécessité un traitement de radiothérapie. Les indications de la radiothérapie adjuvante post-mastectomie sont de plus en plus élargies qu'auparavant. Dans un contexte où un nombre croissant de patientes auront recours à la radiothérapie dans le plan de traitement oncologique, la plupart des guides de pratique suggère de retarder la reconstruction mammaire jusqu'après la radiothérapie afin de prévenir les complications fibrotiques à long-terme. Est-ce que la radiothérapie modifie les propriétés cellulaires de façon permanente affectant ainsi les résultats cliniques de la reconstruction mammaire prothétique ? Si oui, y a-t-il un avantage à retarder la reconstruction mammaire post radiothérapie ? Notre modèle in vitro simulait deux approches de reconstruction mammaire par prothèse où la radiothérapie est nécessaire : l'irradiation de la reconstruction mammaire et la reconstruction mammaire prothétique retardée suite à la radiothérapie. Nous avons procédé à la culture cellulaire de fibroblastes pulmonaires Wi38 et des cellules endothéliales de cordon ombilical humain (HUVEC). Les fibroblastes irradiés simulaient les tissus sains retrouvés autour de l'implant. L'irradiation retardée de la reconstruction mammaire prothétique était simulée par des fibroblastes non-irradiés conditionnés dans un surnageant obtenu de cellules endothéliales irradiées. L'autophagie était induit par la culture cellulaire en milieu sans sérum. L'activation de la sénescence était déterminée grâce à des marqueurs protéiques connus tel que p16 par dosage Western Blot et le marquage histologique à la β-Galactosidase. La diminution du taux protéique de p62 était utilisée comme marqueur d'autophagie. Le Connective Tissue Growth Factor (CTGF), un activateur de la différentiation myofibroblastique, était dosé dans les lignées Wi38 et HUVEC. Le marqueur protéique de la différentiation myofibroblastique employé était l'αSMA. La Tubuline-A était utilisée comme contrôle positif des Western Blot. L'irradiation a induit la fibrose par la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes démontrée par une augmentation des taux du αSMA. Ceci constitue la base de la contraction cicatricielle observée dans la reconstruction mammaire par implant lorsque la radiothérapie est indiquée. L'irradiation des cellules endothéliales a induit la sénescence qui est un arrêt irréversible du cycle cellulaire ; de plus, la sécrétion de l'agent profibrotique CTGF a été observé. Les fibroblastes non-irradiés conditionnés avec un surnageant obtenu de cellules endothéliales irradiées ont démontré une différentiation myofibroblastique en plus de l'expression du phénotype fibrotique caractéristique de la contracture capsulaire. Nous n'avons pas observé d'activation autophagique en réponse à l'irradiation dans notre système. Nos résultats démontrent que la radiothérapie cause un arrêt irréversible du cycle cellulaire. Ceci altère le microenvironnement cellulaire en faveur de la fibrose. Étant donné que ces changements sont permanents, retarder la reconstruction mammaire après la radiothérapie ne présente pas d'avantage dans la prévention de la contracture capsulaire., The most common complication of irradiated implant-based mammary reconstruction is fibrosis and capsular contracture. The indications for post mastectomy adjuvant radiotherapy have significantly broadened. Facing an increased number of patients who will require radiotherapy, most guidelines recommend delaying reconstruction after radiotherapy to prevent long-term fibrotic complications. Does radiotherapy permanently alter cellular properties which will adversely affect implant-based reconstruction? If so, is there a benefit in delaying reconstruction after radiotherapy? Our in-vitro model simulates two implant-based mammary reconstruction approaches: the irradiated implant and the delayed implant reconstruction beneath healthy un-irradiated tissue post radiotherapy. We performed cell culture of fibroblasts and endothelial cells, in an attempt to simulate these two surgical conditions. Irradiated fibroblasts simulate the capsular tissue seen around the breast-implant. The delayed reconstruction approach is simulated by nonirradiated fibroblasts conditioned with supernatant culture media obtained from irradiated endothelial cells. Autophagy was induced by serum starvation. Senescence activation was measured through the protein marker p16 by Western Blot and histological β-Galactosidase staining. The decrease in p62 protein marker levels was used as a marker for autophagy activation. Connective Tissue Growth Factor (CTGF), a potent fibrotic activator, was measured in Wi38 and HUVEC cell lines. The protein marker for myofibroblast différentiation used is αSMA. Tubuline-A was used as a loading control for Western Blots. Irradiation induced fibrosis through fibroblast differentiation into myofibroblasts, as demonstrated by increased α-smooth-muscle actin (αSMA) levels in fibroblasts. This constitutes iv the basis for scar tissue contraction observed in irradiated implant-based breast reconstruction. Irradiation of endothelial cells induced irreversible cell cycle arrest known as senescence and secretion of the pro-fibrotic connective tissue growth factor. Non-irradiated fibroblasts conditioned with culture media obtained from irradiated endothelial cells exhibited myofibroblast differentiation and expression of fibrotic phenotype akin to capsular contracture. We did not observe autophagy activation secondary to irradiation in our system. Our results demonstrate that radiotherapy causes irreversible cellular changes which permanently alter the microenvironment in favor of fibrosis. Given that these changes are permanent, delaying reconstruction does not present an advantage in preventing capsular contracture.

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique., Recent evidence suggests that autophagy may favor fibrosis through enhanced differentiation of fibroblasts in myofibroblasts. Cellular senescence is also involved in tissue repair and fibrosis. Autophagy has been linked with senescence. This study focuses on understanding the molecular mechanisms linking autophagy, senescence and myofibroblast differentiation and the roles they could play in wound healing and fibrosis. Fibroblasts, serum starved for up to 4 days, showed increased LC3B-II/-I ratios and decreased SQSTM1/p62 levels. Autophagy was associated with acquisition of markers of myofibroblast differentiation including increased protein levels of ACTA2/αSMA (actin, α 2, smooth muscle, aorta), enhanced gene and protein levels of COL1A1 (collagen, type I, α 1) and COL3A1, and the formation of stress fibers. Autophagic fibroblasts showed expression of the senescence markers CDKN1A (p21) and p16INK4a (p16) and also exhibit increase in Senescence Associated-beta-galactosidase activity. Inhibiting autophagy with different class I phosphoinositide 3-kinase and class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) inhibitors or through ATG7 silencing prevented myofibroblast differentiation and senescence markers expression. Autophagic fibroblasts showed increased expression and secretion of CTGF (connective tissue growth factor), and CTGF silencing prevented myofibroblast differentiation. Phosphorylation of the MTORC1 target RPS6KB1/p70S6K kinase was abolished in starved fibroblasts. Phosphorylation of AKT at Ser473, a MTORC2 target, was reduced after initiation of starvation but was followed by spontaneous rephosphorylation after 2 d of starvation, suggesting the reactivation of MTORC2 with sustained autophagy. Importantly, inhibition of autophagy with PtdIns3K inhibitors or ATG7 silencing blocked AKT rephosphorylation. Inhibiting MTORC2 activation with long-term exposure to rapamycin, Torin 1 or by silencing RICTOR, a central component of the MTORC2 complex, abolished AKT rephosphorylation. RICTOR silencing, Torin 1 and rapamycin treatments prevented CTGF and ACTA2 upregulation and induction of senescence markers demonstrating the central role of MTORC2 activation in CTGF and senescence induction for myofibroblast differentiation. Since oxidative stress is a known inducer of senescence, we investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in autophagy-induced myofibroblast differentiation and senescence markers induction. Exposing fibroblasts to N-acetyl-L-cysteine (NAC) decreased production of ROS during serum starvation, inhibited autophagy and significantly decreased the expression of senescence and myofibroblast differentiation markers. NAC also inhibited the phosphorylation of AKT Ser473, establishing the importance of ROS in fuelling MTORC2 activation. Collectively, these results identify ROS production in association with sustained autophagy as novel inducers of MTORC2 signaling which in turn concomitantly activate senescence and myofibroblast differentiation.