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Mestrado em Biologia Molecular e Celular As mutações nonsense são mutações pontuais que originam codões de terminação prematura (PTCs). A expressão de genes portadores de PTCs pode levar à síntese de proteínas truncadas. As proteínas truncadas caracterizam-se por serem menores e, na maioria das vezes, não possuem função biológica, apesar de poderem ter funções deletérias para a célula. Em condições normais, transcritos portadores de PTCs são degradados rapidamente através do processo de nonsense mediated mRNA decay (NMD). Quando um PTC atinge o sítio A ribossomal, os fatores de terminação da tradução ligam-se ao mesmo e a tradução termina imediatamente. A terapia de supressão consiste numa abordagem terapêutica que tem o objetivo de utilizar compostos de baixo peso molecular para induzir a incorporação de aminoacil-tRNAs quase cognatos, moléculas que possuem complementaridade para dois dos três nucleótidos de um códão de stop, quando o ribossoma atinge um PTC. Assim, a tradução não termina prematuramente. Estudos anteriores mostraram que alguns aminoglicósidos possuem a capacidade de suprimir PTCs responsáveis por doenças, como fibrose quística e distrofia muscular de Duchenne. Algumas mutações nonsense são responsáveis pela β-talassemia. Neste estudo foram utilizados dois aminoglicósidos, canamicina e gentamicina, de modo a avaliar a sua capacidade em aumentar a competitividade de tRNAs quase cognatos com os fatores de terminação da tradução pelo sítio A ribossomal, na presença de um PTC, evitando dessa forma a terminação prematura da tradução. Nonsense mutations are point mutations that originate premature termination codons (PTCs). The expression of PTC-containing genes may lead to the synthesis of truncated proteins. Truncated proteins are shorter proteins that at most times do not have biological function, but may have deleterious functions for the cell. In regular conditions, PTC-containing transcripts are taken to rapid decay, through nonsense mediated mRNA decay (NMD). When a PTC reaches the ribosomal A-site, translation release factors bind it and translation immediately stops. Suppression therapy is a therapeutic approach that aims to suppress PTCs by using low molecular weight compounds to induce the incorporation of near cognate aminoacyl tRNAs, molecules that show complementarity to two of the three nucleotides of a stop codon, when the ribosome reaches a PTC. Thus, translation does not prematurely terminates. Previous studies have shown that some aminoglycosides have the ability to suppress PTCs responsible for diseases like cystic fibrosis and Duchenne muscular dystrophy. Some nonsense mutations are responsible for β-thalassemia disease. In this study two aminoglycoside compounds, kanamycin and gentamicin, were used in order to evaluate their capacity to increase the competition of near cognate aminoacyl tRNAs with translation release factors by the ribosomal A-site, when the ribosome reaches a PTC, therefore avoiding the premature termination of translation.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2017-06-12T14:03:54Z No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 1719967 bytes, checksum: 5c6d2207304ea95669d1ecb2425469ce (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-12T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 1719967 bytes, checksum: 5c6d2207304ea95669d1ecb2425469ce (MD5) Previous issue date: 2016

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Recent evidences indicate that tRNA modifications and tRNA modifying enzymes may play important roles in complex human diseases such as cancer, neurological disorders and mitochondrial-linked diseases. We postulate that expression deregulation of tRNA modifying enzymes affects the level of tRNA modifications and, consequently, their function and the translation efficiency of their tRNA corresponding codons. Due to the degeneracy of the genetic code, most amino acids are encoded by two to six synonymous codons. This degeneracy and the biased usage of synonymous codons cause alterations that can span from protein folding to enhanced translation efficiency of a select gene group. In this work, we focused on cancer and performed a meta-analysis study to compare microarray gene expression profiles, reported by previous studies and evaluate the codon usage of different types of cancer where tRNA modifying enzymes were found de-regulated. A total of 36 different tRNA modifying enzymes were found de-regulated in most cancer datasets analyzed. The codon usage analysis revealed a preference for codons ending in AU for the up-regulated genes, while the down-regulated genes show a preference for GC ending codons. Furthermore, a PCA biplot analysis showed this same tendency. We also analyzed the codon usage of the datasets where the CTU2 tRNA modifying enzyme was found deregulated as this enzyme affects the wobble position (position 34) of specific tRNAs. Our data points to a distinct codon usage pattern between up and downregulated genes in cancer, which might be caused by the deregulation of specific tRNA modifying enzymes. This codon usage bias may augment the transcription and translation efficiency of some genes that otherwise, in a normal situation, would be translated less efficiently. Estudos recentes indicam que as modificações de tRNAs e as enzimas modificadoras de tRNAs desempenham papéis importantes em doenças Humanas complexas como são exemplos: cancro, doenças neurológicas e mitocondriais. Conjecturamos que a desregulação na expressão das enzimas modificadoras de tRNAs afecta o nível de modificações dos tRNAs e, consequentemente, as suas funções e eficiência de tradução dos codões correspondentes aos tRNAs que afectam. Devido à degeneração do código genético, a maior parte dos aminoácidos são codificados por dois a seis codões sinónimos. Esta degeneração e o uso tendencioso de codões sinónimos causam alterações que podem ir desde problemas de enovelamento proteico a um aumento de eficiência de tradução de um grupo de genes específico. Neste trabalho, focámo-nos no cancro e fizemos um estudo de metaanálise para comparar perfis de expressão génica de microarrays, onde foram encontradas enzimas modificadoras de tRNA desreguladas e analisar o codon usage dos diferentes tipos de cancro nestes dados, reportados em estudos anteriores. Encontrámos um total de 36 diferentes enzimas modificadoras de tRNAs que se encontram desreguladas na maior parte das datasets de cancro analisadas. A análise de codon usage revelou uma preferência, por parte dos genes sobre-expressos, por codões acabados em AU e uma preferência por codões acabados em GC, em genes sub-expressos. Uma subsequente análise de PCA biplot veio mostrar esta mesma tendência. Analisámos também o codon usage de datasets onde a enzima modificadora de tRNA CTU2 se encontrava desregulada uma vez que esta enzima afecta a posição “wobble” (posição 34) de tRNAs específicos. Os nossos dados apontam para um padrão de codon usage distinto entre genes sobre-expressos e sub-expressos em cancro, que pode ser causado pela desregulação de enzimas modificadores de tRNA específicas. Esta tendência de codon usage pode aumentar a transcrição e eficiência de tradução de alguns genes que, de outra forma, numa situação normal, seriam traduzidos de forma menos eficiente.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-08-30T14:33:45Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-30T14:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Previous issue date: 2015-12-16

Mestrado em Biomedicina Molecular The non-standard decoding of the CUG codon in Candida cylindracea raises a number of questions about the evolutionary process of this organism and other species Candida clade for which the codon is ambiguous. In order to find some answers we studied the transcriptome of C. cylindracea, comparing its behavior with that of Saccharomyces cerevisiae (standard decoder) and Candida albicans (ambiguous decoder). The transcriptome characterization was performed using RNA-seq. This approach has several advantages over microarrays and its application is booming. TopHat and Cufflinks were the software used to build the protocol that allowed for gene quantification. About 95% of the reads were mapped on the genome. 3693 genes were analyzed, of which 1338 had a non-standard start codon (TTG/CTG) and the percentage of expressed genes was 99.4%. Most genes have intermediate levels of expression, some have little or no expression and a minority is highly expressed. The distribution profile of the CUG between the three species is different, but it can be significantly associated to gene expression levels: genes with fewer CUGs are the most highly expressed. However, CUG content is not related to the conservation level: more and less conserved genes have, on average, an equal number of CUGs. The most conserved genes are the most expressed. The lipase genes corroborate the results obtained for most genes of C. cylindracea since they are very rich in CUGs and nothing conserved. The reduced amount of CUG codons that was observed in highly expressed genes may be due, possibly, to an insufficient number of tRNA genes to cope with more CUGs without compromising translational efficiency. From the enrichment analysis, it was confirmed that the most conserved genes are associated with basic functions such as translation, pathogenesis and metabolism. From this set, genes with more or less CUGs seem to have different functions. The key issues on the evolutionary phenomenon remain unclear. However, the results are consistent with previous observations and shows a variety of conclusions that in future analyzes should be taken into consideration, since it was the first time that such a study was conducted. A descodificação não-standard do codão CUG na Candida cylindracea levanta uma série de questões sobre o processo evolutivo deste organismo e de outras espécies do subtipo Candida para as quais o codão é ambíguo. No sentido de encontrar algumas respostas procedeu-se ao estudo do transcriptoma de C. cylindracea, comparando o seu comportamento com o de Saccharomyces cerevisiae (descodificador standard) e de Candida albicans (descodificador ambíguo). A caracterização do transcriptoma foi realizada a partir de RNA-seq. Esta metodologia apresenta várias vantagens em relação aos microarrays e a sua aplicação encontra-se em franca expansão. TopHat e Cufflinks foram os softwares utilizados na construção do protocolo que permitiu efectuar a quantificação génica. Cerca de 95% das reads alinharam contra o genoma. Foram analisados 3693 genes, 1338 dos quais com codão start não-standard (TTG/CTG) e a percentagem de genoma expresso foi de 99,4%. Maioritarimente, os genes têm níveis de expressão intermédios, alguns apresentam pouca ou nenhuma expressão e uma minoria é altamente expressa. O perfil de distribuição do codão CUG entre as três espécies é muito diferente, mas pode associar-se significativamente aos níveis de expressão: os genes com menos CUGs são os mais altamente expressos. Porém, o conteúdo em CUG não se relaciona com o nível de conservação: genes mais e menos conservados têm, em média, igual número de CUGs. Os genes mais conservados são os mais expressos. Os genes de lipases corroboram os resultados obtidos para os genes de C. cylindracea em geral, sendo muito ricos em CUGs e nada conservados. A quantidade reduzida de codões CUG que se observa em genes altamente expressos pode dever-se, eventualmente, a um número insuficiente de genes de tRNA para fazer face a mais CUGs sem comprometer a eficiência da tradução. A partir da análise de enriquecimento foi possível confirmar que os genes mais conservados estão associados a funções básicas como tradução, patogénese e metabolismo. Dentro destes, os genes com mais e menos CUGs parecem ter funções diferentes. As questões-chave sobre o fenómeno evolutivo permanecem por esclarecer. No entanto, os resultados são compatíveis com as observações anteriores e são apresentadas várias conclusões que em futuras análises devem ser tidas em consideração, já que foi a primeira vez que um estudo deste tipo foi realizado.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular The genetic code is defined as a series of biochemical reactions that establish the cellular rules that translate DNA into protein information. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Over the years, several alterations to the standard genetic code and codon ambiguities have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, suggesting that the genetic code is flexible. However, the molecular mechanisms of evolution of the standard genetic code and the cellular role(s) of codon ambiguity are not understood. In this thesis we have engineered codon ambiguity in the eukaryotic model Sacharomyces cerevisiae to clarify its cellular consequences. As expected, such ambiguity had a strong negative impact on growth rate, viability and protein aggregation, indicating that it affects fitness negatively. However, it also created important selective advantages in certain environmental conditions, suggesting that it has the capacity to increase adaptation potential under environmental variable conditions. The overall negative impact of genetic code ambiguity on protein aggregation and cell viability, suggest that codon ambiguity may have catastrophic consequences in multicellular organisms. In particular in tissues with low cell turnover rate, namely in the brain. This hypothesis is supported by the recent discovery of a mutation in the mouse alanyl-tRNA synthetase which creates ambiguity at alanine codons and results in rapid loss of Purking neurons, neurodegeneration and premature death. Therefore, genetic code ambiguity can have both, negative or positive outcomes, depending on cell type and environmental conditions. O código genético pode ser definido como uma série de reacções bioquímicas que estabelecem as regras pelas quais as sequências nucleotídicas do material genético são traduzidas em proteínas. Apresenta um elevado grau de conservação e estima-se que tenha tido a sua origem há mais de 3.5 mil milhões de anos. Ao longo dos últimos anos foram identificadas várias alterações ao código genético em procariotas e eucariotas e foram identificados codões ambíguos, sugerindo que o código genético é flexível. Contudo, os mecanismos de evolução das alterações ao código genético são mal conhecidos e a função da ambiguidade de codões é totalmente desconhecida. Nesta tese criámos codões ambíguos no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae e estudámos os fenótipos resultantes de tal ambiguidade. Os resultados mostram que, tal como seria expectável, a ambiguidade do código genético afecta negativamente o crescimento, viabilidade celular e induz a produção de agregados proteicos em S. cerevisiae. Contudo, tal ambiguidade também resultou em variabilidade fenótipica, sendo alguns dos fenótipos vantajosos em determinados condições ambientais. Ou seja, os nossos dados mostram que a ambiguidade do código genético afecta negativamente a capacidade competitiva de S. cerevisiae em meio rico em nutrientes, mas aumenta a sua capacidade adaptativa em condições ambientais variáveis. Os efeitos negativos da ambiguidade do código genético, nomeadamente a agregação de proteínas, sugerem que tal ambiguidade poderá ser catastrófica em organismos multicelulares em que a taxa de renovação celular é baixa. Esta hipótese é suportada pela recente descoberta de uma mutação na alaniltRNA sintetase do ratinho que induz ambiguidade em codões de alanina e resulta numa forte perda de neurónios de Purkinge, neurodegeneração e morte prematura. Ou seja, a ambiguidade do código genético pode ter consequências negativas ou positivas dependendo do tipo de células e das condições ambientais.

Doutoramento em Bioquímica Submitted by Maria da Graça Mónica do Casal Breda (gbreda@ua.pt) on 2012-03-26T16:11:43Z No. of bitstreams: 1 242926.pdf: 34240697 bytes, checksum: ef7e809806ddec7d09f9b822ff44b775 (MD5) Made available in DSpace on 2012-03-26T16:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 242926.pdf: 34240697 bytes, checksum: ef7e809806ddec7d09f9b822ff44b775 (MD5) Previous issue date: 2011-07-22

Doutoramento em Bioquímica The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations. O código genético regula a correcta descodificação da informação contida nos genes durante a síntese de proteínas. Apresenta um elevado grau de conservação e estima-se que tenha sido originado há mais de 3.5 biliões de anos. Contudo, várias alterações ao código genético foram identificadas em procariotas e eucariotas, nomeadamente nos fungos denominados de “CTG clade”, nos quais um tRNA de serina atípico (tRNACAG Ser) descodifica o codão de leucina CUG como serina. Este tRNACAG Ser foi originado há 272±25 milhões de anos, pela inserção de uma adenosina no centro do anticodão do gene do tRNACGA Ser que alterou a sequência original do anticodão de 5´-CGA-3´ para 5´-CAG-3´. Esta alteração ao código genético promoveu a restruturação do proteoma das espécies denominadas de “CTG clade”. Contudo, permanece por esclarecer o motivo que permitiu que esta alteração atípica fosse preservada no genome destes fungos. Numa tentativa de clarificar os aspectos evolutivos desta alteração ao código genético, procedemos à reconstrução da via evolutiva, proposta para esta alteração, na levedura Saccharomyces cerevisiae. Para tal, induzimos a expressão do gene do tRNACGA Ser de C. albicans, nas versões mutantes e original, em S. cerevisiae e determinámos o impacto das mesmas no crescimento celular, bem como na estabilidade, eficiência na tradução e aminoacilação do tRNA. Os nossos dados, demonstram que as versões mutantes do tRNA, apesar de sua reduzida expressão, induzem a incorporação de serina nos codões CUG de leucina. Observámos ainda, através de uma estratégia de evolução forçada, que o tRNACAG Ser é facilmente inactivado por mutações naturais que impedem o seu reconhecimento pela seryl-tRNA synthetase. O nosso estudo demonstra que a repressão da expressão do tRNACAG Ser, terá desempenhado um papel fundamental na evolução da redefinição do codão CUG de leucina para serina. Com o intuito de compreender a evolução das alterações ao código genético, induzimos redefinições parciais em vários codões de levedura. Os nossos resultados confirmam que a ambiguidade no código genético afecta o crescimento, induz a produção de agregados proteicos, interfere no ciclo celular e promove alterações nucleares, morfológicas, instabilidade genómica e desregulação da expressão genética. Contudo, origina também variedade fenotípica e fenótipos vantajosos em determinadas condições ambientais. Este estudo demonstra o impacto do ambiente na evolução das alterações ao código genético.

Mestrado em Biotecnologia Molecular Submitted by Maria da Graça Mónica do Casal Breda (gbreda@ua.pt) on 2012-04-04T09:54:05Z No. of bitstreams: 1 243329.pdf: 3001149 bytes, checksum: da483f946f2dac0321fee1f828281630 (MD5) Made available in DSpace on 2012-04-04T09:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 243329.pdf: 3001149 bytes, checksum: da483f946f2dac0321fee1f828281630 (MD5) Previous issue date: 2011

Mestrado em Biotecnologia Molecular Due to the degeneracy of the genetic code, an average protein of 300 amino acids can be encoded by the truly astronomical number of more than 10150 different codon combinations; more than the estimated number of atoms in the observable universe. However, the choice between synonymous codons in the mRNA coding sequence is not random, but follows rules and has important functions in translation accuracy, efficiency and co-translational protein folding. This additional layer of information that mRNA primary structures encode is found in all three domains of life and is modulated by evolutionary forces as mutation and selection. Particularly, codon usage and codon context are strongly biased features in mRNA primary structure of different species. In heterologous protein expression, the translation instructions contained in the coding sequence, need to be recognized by the heterologous host, to avoid the production of insoluble, non-functional proteins. Factors such as differences in codon usage, and codon context between native and heterologous host must be considered, as well as the presence of rare codon rich regions and mRNA secondary structures. Gene optimisation is often the solution to overcome these difficulties and to obtain a higher yield of functional, correctly folded heterologous protein. The present work aimed at studying the effects of rare codons in a Plasmodium falciparum lysyl-tRNA synthetase gene (Pf LysRS) on protein solubility in Escherichia coli and whether protein solubility can be improved through codon harmonisation. Furthermore, the effect of other parameters such as codon context on translation accuracy and efficiency were analysed using the -galactosidase gene as another model. Devido ao facto do código genético ser degenerado, uma proteína composta por 300 aminoácidos, pode ser codificada por um valor verdadeiramente astronómico de mais de 10150 combinações de codões; mais do que o número estimado de átomos no Universo observável. Contudo, a escolha entre codões sinónimos na sequência de mRNA não é aleatória, mas pelo contrário, segue regras e apresenta funções importantes ao nível da precisão e eficiência de tradução, bem como no folding co-traducional de proteinas. Esta camada adicional de informação que a estrutura primária do mRNA codifica é encontrada nos três domínios da vida e é modelada por forças como a mutação e a selecção. Em particular, a utilização de codões e o contexto de codões são características fortemente enviesadas na estrutura primária do mRNA de diferentes espécies. Na expressão heterologa de proteínas, as instruções traducionais contidas na sequência codificante necessitam de ser reconhecidas pelo hospedeiro heterologo de forma a evitar a produção de proteínas insolúveis, não funcionais. Factores como diferenças na utilização de codões e contexto de codões entre o hospedeiro nativo e heterologo devem ser consideradas, tal como a presença de regiões ricas em codões raros e a presença de estruturas secundárias de mRNA. A optimização de genes é frequentemente a solução encontrada para ultrapassar estas dificuldades e para obter um maior rendimento em proteínas heterologas solúveis e funcionais. O presente trabalho tem por objectivo estudar os efeitos de codões raros no gene da Lisil-tRNA sintetase de Plasmodium falciparum (Pf LysRS) em termos de solubilidade proteica em Escherichia coli, bem como estudar como essa solubilidade pode ser melhorada através de harmonização de codões. O efeito de outros parâmetros, como o contexto de codões, na precisão e eficiência de tradução foram analisados num outro modelo, o gene de -galactosidase.

Mestrado em Biomedicina Molecular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-06-08T12:56:17Z No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2785432 bytes, checksum: c1619665d74e6d5313d35ba6451464db (MD5) Made available in DSpace on 2016-06-08T12:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese.pdf: 2785432 bytes, checksum: c1619665d74e6d5313d35ba6451464db (MD5) Previous issue date: 2015-07-31