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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O Toxoplasma gondii, causador da toxoplasmose, é um parasito intracelular obrigatório com grande capacidade de invadir as células hospedeiras e de evadir suas defesas. Dentro do hospedeiro, o parasito pode estimular a ativação de mecanismos antimicrobianos, como a produção de óxido nítrico (NO) e de espécies reativas de oxigênio (ROS). Muitos trabalhos vêm tentando elucidar o papel das ROS durante à infecção pelo T. gondii, porém os dados mostram-se inconclusivos. A fim de entender a importância das ROS na infecção in vivo pelo T. gondii, acompanhamos durante 15 dias, camundongos nocautes na produção de superóxido via NOX2 (PHOX KO) e camundongos selvagens (C57BL/6 WT) infectados com 10 cistos da cepa Me49 (tipo II) por via intragástrica. Nossos resultados mostraram que os camundongos WT e PHOX KO infectados com 10 cistos da cepa Me49 de T. gondii não apresentaram mortalidade durante o período de infecção avaliado. Apesar disso, os camundongos WT apresentaram notáveis características de caquexia a partir do nono dia de infecção, que foram confirmadas através dos elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF e IFN-γ), NO e da elevada perda de peso em comparação aos camundongos PHOX KO. Mostramos também que a presença da NOX2 ativa em camundongos WT infectados pelo T. gondii promoveu maior dano tecidual e maiores níveis de inflamação no fígado, que foram comprovados através dos níveis elevados de peroxidação lipídica (dano oxidativo) e de enzimas hepáticas (dano hepático) nesses camundongos. Esses dados foram reforçados através da análise histopatológica do fígado, que mostrou dano tecidual nos camundongos WT em todos os tempos de infecção avaliados com a presença de infiltrado de células inflamatórias e focos de necrose. No intestino, principal porta de entrada do parasito a outros órgãos, não observamos diferenças nos níveis de peroxidação lipídica entre os grupos de camundongos infectados devido à ausência do parasito no período de infecção avaliado. Ao associar o dano tecidual (presente em maior intensidade nos camundongos WT) à provável produção de ROS em resposta a infecção, não observamos diferenças entre os grupos de camundongos infectados. Também não observamos diferenças nos níveis de enzimas antioxidantes (SOD e catalase) no fígado e no intestino dos grupos de camundongos infectados que poderiam explicar os baixos níveis de ROS encontrados nesses camundongos. Nossos resultados indicam que as ROS não estão envolvidas na eliminação do parasito durante a infecção pelo T. gondii. De maneira surpreendente, o estresse oxidativo contribui no desenvolvimento de diversas consequências negativas para o hospedeiro infectado, já que esse estresse oxidativo não é capaz de eliminar o parasito, conforme mostramos em nossos resultados. Toxoplasma gondii, which causes toxoplasmosis, is an obligate intracellular parasite with great ability to invade host cells and evade their defenses. Within the host, the parasite can stimulate activation of antimicrobial mechanisms, such as production of nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS). Many studies have been trying to elucidate the role of ROS during T. gondii infection, but the data are inconclusive. In order to understand the importance of ROS in T. gondii infection in vivo, we monitored for 15 days knockout mice producing NOX2 superoxide (PHOX KO) and wild type mice (C57BL/6 WT) infected with 10 cysts of T. gondii Me49 strain. (type II) intragastrically. Our results showed that WT and PHOX KO mice infected with 10 cysts of the T. gondii Me49 strain did not show mortality during the evaluated period of infection. Nevertheless, WT mice showed remarkable cachexia characteristics from the ninth day of infection, which were confirmed by high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF and IFN-γ), NO and high weight loss compared to PHOX KO mice. We also noted that the presence of active NOX2 in T. gondii-infected WT mice promoted greater tissue damage and higher levels of inflammation in liver, which were confirmed by elevated levels of lipid peroxidation (oxidative damage) and liver enzymes (liver damage) in these mice. These data were reinforced by histopathological analysis of the liver, which showed tissue damage in WT mice at all times of infection verified by the presence of inflammatory cell infiltrate and necrosis focus. In the intestine, the parasite's main gateway to other organs, we did not observe differences in lipid peroxidation levels between groups of infected mice due to absence of parasites during the period of infection evaluated. When associating tissue damage (present in higher intensity in WT mice) with the probable production of ROS in response to infection, we did not observe differences between groups of infected mice. We also did not observe differences in the levels of antioxidant enzymes (SOD and catalase) in the liver or the intestine of the infected groups that could explain the low levels of ROS found in these mice. Our results indicate that ROS are not involved in parasite elimination during T. gondii infection. Surprisingly, oxidative stress contributes to the development of several negative consequences for the infected host, since this oxidative stress is not able to eliminate the parasite as we show in our results.

Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, é exposto a várias situações de estresse oxidativo durante o seu complexo ciclo de vida. Para lidar com este tipo de estresse, uma das estratégias utilizadas pelo parasito para detoxificar hidroperóxidos é um peculiar sistema de defesa antioxidante dependente de tripanotiona. Entretanto, o repertório antioxidante do T. cruzi não inclui a enzima catalase, a qual decompõe peróxido de hidrogênio (H2O2) e é encontrada na maioria dos organismos aeróbicos. Para investigar a razão pela qual o T. cruzi não possui a enzima catalase, geramos uma linhagem do parasito capaz de expressar o gene desta enzima. Parasitos que expressam catalase apresentam uma resistência aumentada ao tratamento com H2O2 em relação aos selvagens (WT). O pré-tratamento de parasitos WT com uma baixa concentração de H2O2 antes do tratamento com a mesma substância faz com que os mesmos sejam tão resistentes ao H2O2 quanto àqueles que expressam catalase. Porém, esta adaptação ao pré-tratamento não foi observada com a mesma intensidade nos parasitos mutantes. A expressão de catalase em T. cruzi aumentou o nível da enzima ferro-superóxido dismutase B e diminuiu o nível de tripanotiona redutase, resultando em níveis aumentados de H2O2 após a exposição a esta substância. Embora a expressão heteróloga de catalase contribua para o aumento da proliferação do parasito no inseto vetor, a mesma não induziu um grande aumento na virulência em camundongos. Nossos resultados, associados às informações de que a catalase está presente em tripanossomatídeos monoxênicos e que o H2O2 é capaz de atuar como segundo mensageiro, indicam que a ausência de catalase em T. cruzi seja importante para que o parasito possa sinalizar melhor o estresse oxidativo Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, is exposed to oxidative stress situations during its complex life cycle. To deal with these stresses, one of the strategies employed by this parasite for hydroperoxides detoxification is a peculiar trypanothione-dependent antioxidant system. However, T. cruzi's antioxidant repertoire does not include catalase, an enzyme that decomposes H2O2 and is found in most aerobic organisms. In order to investigate the reason why T. cruzi does not have the catalase gene, a T. cruzi cell line which expresses this enzyme was generated. Parasites expressing catalase have an increased resistance to H2O2 in relation to wild type cells (WT). Moreover, pretreatment of parasites with a low concentration of H2O2 before treatment with higher concentrations makes the WT cells as resistant to H2O2 as cells expressing catalase. However, improvement in resistance to H2O2 after pretreatment was not observed with the same intensity in cells expressing catalase. Catalase expression in T. cruzi decreased the trypanothione reductase and increased superoxide dismutase levels, which resulted in higher levels of H2O2 after H2O2 treatment. More important, although the heterologous expression of catalase contributed to higher proliferation rates in the insect vector, expression of catalase does not induce a large increase in virulence of mice. These results, associated with the facts that catalase is present in monoxenous trypanosomatids and that H2O2 can act as second messenger, indicate that the absence of the catalase gene in T. cruzi was important in order to allow cells with a better capacity in sensing oxidative stress

O Trypanosoma cruzi é um protozoário parasita, causador da Doença de Chagas. Assim como a maioria dos organismos vivos, é susceptível ao estresse oxidativo e precisa adaptar-se a diferentes ambientes. Portanto, o reparo de DNA é essencial para sua sobrevivência e aumento da sua capacidade de infecção (Aguiar et al., 2013). Dada a importância do reparo de DNA para T. cruzi, decidimos investigar se o parasito possui homólogos das enzimas OGG1 (TcOGG1) e MutY (TcMYH). Primeiramente, foram feitos ensaios de complementação funcional heteróloga. Para OGG1, foram feitos experimentos em Escherichia coli, porém, a expressão de TcOGG1 foi tóxica tanto para células selvagens (WT - AB1157) quanto para células fpg -/- (BH20). Entretanto, a expressão de TcOGG1 não foi tóxica para Saccharomyces cerevisiae. Leveduras mutantes ogg1-/- (CD138) possuem uma alta taxa de mutação espontânea, mas quando expressam TcOGG1 esta taxa fica similar à observada para as células selvagens (WT FF18733). Por outro lado, a expressão de TcMYH não foi tóxica para E. coli e complementou bactérias MutY-, reduzindo as frequências de mutantes para níveis similares às das células WT. Em ensaios in vitro, TcMYH foi capaz de remover uma adenina pareada com 8-oxoguanina. Também foram construídas linhagens de T. cruzi que superexpressam OGG1 ou MYH. Embora em condições-padrão estas linhagens possuam crescimento similar às células controle, os superexpressores são mais sensíveis ao peróxido de hidrogênio do que o controle. Quando tratados com benzonidazol, a droga utilizada no tratamento da Doença de Chagas, os superexpressores não demonstraram mudança em seu crescimento, em relação ao controle. Além disso, T. cruzi superexpressor de TcOGG1 exibiu menores níveis de danos no DNA nuclear, mas não no kDNA (DNA do cinetoplasto (mitocôndria)). Isto pode estar relacionado à quantidade de enzima presente nestes compartimentos celulares, bem como à distribuição desigual de outras proteínas de reparo no núcleo e no kDNA. Experimentos de localização com TcOGG1 ou TcMYH em fusão com GFP mostraram que ambas as enzimas encontram-se no núcleo e na mitocôndria do parasito. Estes resultados sugerem que T. cruzi possui proteínas 8-oxoguanina DNA glicosilase e MutY DNA glicosilase funcionais, sendo que estas participam do BER nuclear e mitocondrial do parasito. Estes resultados sugerem que T. cruzi possui proteínas 8-oxoguanina DNA glicosilase e MutY DNA glicosilase funcionais, sendo que estas participam do BER nuclear e mitocondrial do parasito. Trypanosoma cruzi is a protozoan parasite, causative of Chagas disease. Like most living organisms, it is susceptible to oxidative stress, and needs to adapt to distinct environments. Hence, DNA repair is essential for its survival and improvement of infection (Aguiar et al., 2013). Given the importance of DNA repair to T. cruzi, we decided to study if this protozoan has homologous of the enzymes OGG1 (TcOGG1) and MYH (TcMYH). First, we performed heterologous complementation assays. For OGG1, experiments were carried out in Escherichia coli, however, expression of TcOGG1 was toxic both to wild type (WT) cell (AB1157) and to fpg -/- cells (BH20). Nevertheless, expression of TcOGG1 was not toxic to Saccharomyces cerevisiae. Yeast mutants ogg1-/- (CD138) have an increased spontaneous mutation frequency, but when they expressed TcOGG1, this frequency was similar to the one seen for the WT cell (FF18733). On the other hand, TcMYH was not toxic to E. coli and complemented the bacterial MutY- strain, reducing the mutation frequencies to a level similar to the wild types frequencies. In in vitro assays, TcMYH was able to remove an adenine that was opposite to 8-oxoguanine. We have also constructed T. cruzi lineages that overexpress OGG1 or MYH. Although in standard conditions these lineages have similar growth in comparison with control cells, the overexpressors are more sensitive to hydrogen peroxide than control. When overexpressor parasites were treated with benzonidazole, the drug used in Chagas disease treatment, they exhibited no phenotype. Also, TcOGG1-overexpressor T. cruzi exhibited lower levels of DNA damage in the nucleus, but not in the kDNA (kinetoplast (mitochondrial) DNA). This might be related to the quantity of the enzyme present in each subcellular compartment and to the unequal distribution of other repair proteins in the nucleus and kDNA. Localization experiments with TcOGG1 or TcMYH fused to GFP showed that the protozoans enzymes are both nuclear and mitochondrial.These data suggest that T. cruzi has functional 8-oxoguanine and MutY DNA glycosylases, which participate in nuclear and mitochondrial BER.

Proteínas da família Y-box (YBP) são consideradas reguladores multifuncionais da expressão gênica e, geralmente, apresentam dois domínios característicos: um altamente conservado de ligação a ácidos nucléicos (CSD - cold shock domain) e um Cterminal pouco conservado (Tail ou cauda). Vários estudos têm demonstrado o papel de algumas YBP na resposta celular ao estresse causado por agentes genotóxicos, na capacidade de interagir com lesões e erro de pareamento de bases no DNA, além da interação com algumas proteínas das vias de reparo do DNA evidenciando que as YBP podem participar nos mecanismos de reparo do DNA. SMYB1 é uma proteína de Schistosoma mansoni que apresenta grande similaridade entre seu domínio CSD e domínios correlatos em outros membros dessa família de proteínas. S. mansoni, o parasito trematódeo responsável pela esquistossomose, exibe um ciclo de vida complexo com alternância de fases entre um hospedeiro intermediário e um definitivo, que vivem em ambientes diferentes. A caracterização de proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica é de grande importância para o entendimento dos eventos moleculares que controlam mudanças fisiológicas e morfológicas em tais organismos. O presente estudo visa ampliar o conhecimento acerca da proteína SMYB1 e sua função biológica. Para isso, foram realizados ensaios de localização de SMYB1 em diferentes fases do desenvolvimento de S. mansoni, detectando a proteína nos estágios de ovo, vermes adultos macho e fêmea, cercária, miracídio e esquistossômulos, sempre no citoplasma. A localização citoplasmática da proteína corrobora achados anteriores do nosso grupo que mostraram a sua habilidade de interação com moléculas de RNA. A interação com mRNAs realizada por outros membros da família YBP é bem estabelecida e sugere sua possível função na regulação de eventos pós-transcricionais da expressão gênica. O papel de SMYB1 na proteção contra o estresse oxidativo no DNA foi também avaliado. Para isso, os protozoários Trypanosoma cruzi heminocaute para o gene MSH2 (homólogo de mutS em Eucariotos) e Trypanosoma brucei nocaute para o gene MSH2 foram utilizados como modelo e verificamos que SMYB1 é capaz de complementar a função desempenhada por MSH2 tanto em T. cruzi quanto em T. brucei. As cepas expressando SMYB1 foram mais resistentes ao tratamento com peróxido de hidrogênio, sugerindo que a proteína possa reconhecer lesões oxidativas no DNA (incluindo a 8-oxoG, que tem sua produção aumentada na presença de peróxido de hidrogênio) e ativar uma resposta a essa lesão. RBP16, ortóloga de SMYB1, é uma proteína de ligação a RNA mitocondrial de T. brucei cujo domínio cold shock apresenta entre 33% e 38% de identidade com o CSD de outras proteínas eucarióticas da família YBP. Assim sendo, outro objetivo deste trabalho foi avaliar o papel de RBP16 em parasitos selvagens frente ao tratamento com agentes genotóxicos. Ao avaliar o efeito do silenciamento de RBP16 em T. brucei, verificamos que seu gene é essencial para o crescimento da forma sanguínea do parasito e para a resposta ao estresse oxidativo. No entanto, a diminuição nos níveis da proteína não aumenta a sensibilidade das células aos danos causados pela cisplatina e pelo metilmetanosulfonato (MMS). Os processos de reparo de DNA são cruciais para o sucesso parasitário do T. cruzi e T. brucei e, dessa forma, o maior entendimento dessas vias pode levar a uma melhor compreensão da biologia dos tripanossomatídeos e à elaboração de novas estratégias para o tratamento das doenças causadas por esses parasitos. Y-box binding proteins (YBP) are considered multifunctional regulators of gene expression that present two characteristic domains: a highly conserved nucleic acid binding domain (cold shock domain, CSD) and a less conserved C-terminal domain (tail domain). Several studies have demonstrated the role of some YBP in the cellular response to stress caused by genotoxic agents, the ability to interact with injuries and DNA mismatch repair, as well as interaction with some proteins of the DNA repair pathways showing that the YBP may participate in DNA repair processes. SMYB1 is a Schistosoma mansoni protein that presents a CSD highly similar to CSDs from other YBP family members. S. mansoni, the etiologic agent of schistosomiasis, is a trematode parasite with a complex life cycle that alternates between two different hosts and also lives in diverse environments. The characterization of proteins involved in the regulation of gene expression is of great importance for the understanding of molecular events that control physiological and morphological changes in such organisms. The present study aims to increase the current knowledge about the SMYB1 protein and its biological function. To this end, immunolocalization experiments were performed in different S. mansoni life cycle stages, revealing the presence of this protein in the citoplasm of eggs, male and female adult worms, cercaria, miracidia and schistosomulae. The citoplasmic localization of SMYB1 is in agreement with previous findings from our research group that have shown its ability to interact with RNA molecules. The interaction with mRNAs by other YBP members is well-established and suggests a possible function in the regulation of post-transcriptional gene expression events. The role of SMYB1 in the protection against oxidative stress was also evaluated. To reach this goal, we have obtained MSH2 single knockout lines of Trypanosoma cruzi MSH2 double knockout lines of Trypanosoma brucei and verified that SMYB1 is able to complement the function of MSH2 in both parasites. SMYB1-expressing strains were more resistant to hydrogen peroxide treatment, suggesting that this protein may recognize oxidative lesions in the DNA (including 8-oxoG, which is increased in the presence of hydrogen peroxide) and a response to that injury. RBP16, an ortholog of SMYB1, is a mitochondrial RNA binding protein from Trypanosoma brucei that contains a CSD 33-38% identical to CSDs of other eukaryotic YBPs. Therefore, another aim of this work was to evaluate the role of RBP16 in wildtype parasites and the behaviour of such organisms in the presence of genotoxic agents. Evaluating the effect of RBP16 silencing in T. brucei, we have verified that this is an essential gene for parasite growth and response to oxidative stress. Nevertheless, the decreasing of protein levels did not increase cell sensitivity to DNA damages caused by cisplatin and metilmetanosulfonate. DNA repair processes are crucial to the parasitic success of both T. cruzi and T. brucei and, therefore, a better understanding of the mechanisms involved in the repair of damaged DNA may help to explain the biology of Trypanosomatids and lead to the development of new strategies for the treatment of diseases caused by such parasites.

Uma das consequências do estresse oxidativo é a formação de lesões no DNA, que podem resultar em instabilidade genômica e levar a morte celular. A guanina é a base mais vulnerável à oxidação devido ao seu baixo potencial redox, e a 8-oxoguanina (8-oxoG) é a lesão mais abundante. Esta característica faz da 8- oxoG um bom biomarcador celular para indicar a extensão de dano oxidativo. Se não for reparada, a 8-oxoG pode parear com adenina e causar transversão de G:C para T:A. Quando a 8-oxoG é inserida durante a replicação do DNA ela pode gerar quebras de fita dupla, o que torna esta lesão particularmente deletéria. Todos os organismos evoluíram mecanismos de reparo para lidar com 8-oxoG. Em eucariotos superiores, as enzimas OGG1, MUTYH e MTH (Homólogo de MutT) constituem a via de reparo a 8-oxoG. Trypanosoma cruzi precisa lidar com várias situações de estresse oxidativo a que é exposto, como o ambiente intracelular no hospedeiro mamífero e o trato intestinal do triatomíneo onde o parasito replica. Desde a publicação do genoma do parasito, algumas destas enzimas de reparo de DNA foram caracterizadas. No entanto, alguns elementos importantes da maquinaria de reparo de DNA, como um homólogo de MutT, não foram identificados. A enzima MutT é responsável pela hidrólise de 8-oxo-dGTP para 8-oxo-dGMP no pool de nucleotídeos, prevenindo a incorporação destes nucleotídeos oxidados no DNA. Isso estimulou nosso grupo a transformar parasitos T. cruzi CL Brener com o gene mutT de Escherichia coli para investigar a importância da 8-oxoG durante o ciclo de vida do parasito. Na forma epimastigota, as populações de parasitos recombinante e selvagem apresentaram crescimento semelhante em condições normais, mas as células que expressam MutT foram mais resistentes ao tratamento com peróxido de hidrogênio. Adicionalmente, demonstramos por experimentos de QPCR que a expressão da MutT de E. coli em T. cruzi reduz a quantidade de lesões no DNA, em relação às células controle. A população de parasito recombinante também mostrou crescimento aumentado após 48 horas de infecção em fibroblastos quando comparada às células do tipo selvagem, assim como parasitemia aumentada em camundongos Suíços. Além disso, demonstramos por experimentos de western blotting que a expressão heteróloga de MutT pode influenciar o nível das enzimas peroxidases citosólica e mitocondrial (CPX e MPX) do parasito. Estes resultados mostram a importância do sistema de reparo da 8-oxoG para a viabilidade celular de T. cruzi. Neste trabalho também foi possível realizar a caracterização da proteína TcMTH, a homóloga de MutT de T. cruzi. A sequência do gene foi caracterizada in silico, e parasitos que superexpressam a TcMTH mostraram maior resistência ao tratamento com peróxido de hidrogênio. The formation of DNA lesions is one of the consequences of oxidative stress, which might result in genomic instability and lead to cell death. Guanine is the base that is most susceptible to oxidation due to its low redox potential, and 8-oxoguanine (8-oxoG) is the most abundant lesion. This characteristic makes 8-oxoG a good cellular biomarker to indicate the extent of oxidative stress. If not repaired, the 8- oxoG could pair with adenine and cause G:C to T:A transversion. When 8-oxoG is inserted during the DNA replication it could generate double strand breaks, which makes this lesion particularly deleterious. All organisms evolved repair mechanisms to deal with 8-oxoG. In higher eukaryotes, the enzymes OGG1, MUTYH and MTH (MutT Homologous) constitute the 8-oxoG repair pathway. Trypanosoma cruzi needs to deal with various oxidative stress situations that it is exposed to, such as the mammalian intracellular environment and the triatomine insect gut where it replicates. Since the publication of the parasites genome, some of this DNA repair enzymes have been characterized. However, some important elements of the DNA Repair machinery, such as a MutT homolog, have not been identified. The MutT enzyme is responsible for the hydrolysis of 8-oxo-dGTP to 8-oxo-dGMP in the nucleotide pool, preventing the incorporation of these oxidized nucleotides in DNA. This prompted our group to transform T. cruzi CL Brener clone with the Escherichia coli mutT gene to investigate the importance of the 8-oxoG during the parasites life cycle. In the epimastigote form, the recombinant and wild type strains showed similar growth in normal conditions, but MutT expressing cells were more resistant to hydrogen peroxide treatment. Furthermore, we demonstrated by QPCR experiments that E. coli MutT expression in T. cruzi reduces the amount of nuclear DNA lesions, in comparison to control cells. The recombinant strain also showed statistically significant increase in growth after 48 hours of infection in fibroblasts when compared to wild type cells, as well as increased parasitemia in Swiss mice. Additionally, we demonstrated by western blotting experiments that MutT heterologous expression can influence the parasites mitochondrial and cytosolic peroxidase enzymes (MPX and CPX) protein levels. These results show the importance of the 8-oxoG repair system for T. cruzi cell viability. This study also accomplished the characterization of TcMTH, the T. cruzi MutT homolog. The gene sequence was studied in silico, and parasites overexpressing TcMTH showed increased resistance to hydrogen peroxide treatment.

Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas, possui uma população altamente heterogênea, composta de um pool de cepas e clones com características distintas, tais como morfologia, taxas de crescimento, virulência e sensibilidade a drogas. Esta diversidade pode ser um reflexo da variabilidade genética intra-específica que, como em outros organismos, é originadaprincipalmente por mutações e rearranjos gênicos. Entretanto, os mecanismos que levam a esta diversidade em T. cruzi não estão completamente esclarecidos. Análises filogenéticas serviram de base para uma proposição de classificação do táxon T. cruzi em três linhagens principais, denominadas T. cruzi I, II e III. Como estudosrelacionados a funções envolvendo metabolismo de DNA principalmente reparo e recombinação ainda são escassos, o presente trabalho teve como objetivo estudar o papel de uma destas vias de reparo de DNA, o sistema de reparo de erros de pareamento ou MMR, na geração de variabilidade genética em T. cruzi.Polimorfismos no gene Tcmsh2 resultam na expressão de três isoformas da proteína TcMSH2 (um componente chave do MMR) características de cada linhagem. A comparação das taxas de crescimento de cepas pertencentes aos haplogrupos A (T.cruzi I) e C (T. cruzi II) frente à exposição a agentes genotóxicos, bem como a determinação dos níveis de dano no DNA induzido por estresse oxidativo, forneceram evidências de que cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I apresentam uma capacidade de reparo mais eficiente. O cultivo de parasitos na presença de cádmio, um inibidor da via de MMR, juntamente com os resultados de ensaios in vitro com proteínas recombinantes indicam que diferenças observadas entre as cepaspodem ser, em parte, devido às diferenças na atividade de TcMSH2.A fim de investigar melhor o papel do MMR e, mais precisamente, daproteína TcMSH2 na geração de variabilidade genética em T. cruzi, foram geradas linhagens heminocautes para o gene Tcmsh2. Os resultados obtidos sugerem que, além do seu papel no MMR, a proteína TcMSH2 exerça uma função MMRindependente importante na resposta ao estresse oxidativo, o que impossibilitaria a deleção de ambos os alelos. Esta função parece ser conservada em um tripanossomatídeo relacionado, T. brucei. Como estratégia alternativa, vetores paratransfecção de T. cruzi foram construídos de maneira a gerar parasitos11 superexpressando o gene Tcmsh2. Entretanto, devido possivelmente a mecanismos que controlam a expressão do gene Tcmsh2, não foi possível obter linhagens transfectadas expressando altos níveis dessa proteína. Com o objetivo adicional de estudar quais são os sinais importantes para a expressão de um gene exógeno em T. cruzi, de forma a aperfeiçoar vetores já utilizados, foram realizadas análises in silico onde procuramos investigar melhor os requerimentos necessários para o processamento correto, através de trans-splicing epoliadenilação, dos mRNAs no parasito. Essas análises mostraram que a distância mediana entre os motivos de polipirimidinas (sinais já conhecidos como importantes para o processamento do mRNA) e os sítios de trans-splicing e os de poliadenilação é de 18 e 40 nt, respectivamente. Os motivos de polipirimidinas apresentaramtamanhos medianos de 11 nt (acima do sítio de trans-splicing) e 12 nt (abaixo do sítio de poliadenilação). Os tamanhos médios de 5UTR (35 nt) e 3UTR (137 nt) obtidos corroboram resultados anteriores, que indicam que o genoma de T. cruzi é mais compacto quando comparado com outros tripanossomatídeos, tais como T. brucei e Leishmania major. Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas, possui uma população altamente heterogênea, composta de um pool de cepas e clones com características distintas, tais como morfologia, taxas de crescimento, virulência e sensibilidade a drogas. Esta diversidade pode ser um reflexo da variabilidade genética intra-específica que, como em outros organismos, é originada principalmente por mutações e rearranjos gênicos. Entretanto, os mecanismos que levam a esta diversidade em T. cruzi não estão completamente esclarecidos. Análisesfilogenéticas serviram de base para uma proposição de classificação do táxon T. cruzi em três linhagens principais, denominadas T. cruzi I, II e III. Como estudos relacionados a funções envolvendo metabolismo de DNA principalmente reparo e recombinação ainda são escassos, o presente trabalho teve como objetivo estudar o papel de uma destas vias de reparo de DNA, o sistema de reparo de erros de pareamento ou MMR, na geração de variabilidade genética em T. cruzi. Polimorfismos no gene Tcmsh2 resultam na expressão de três isoformas da proteína TcMSH2 (um componente chave do MMR) características de cada linhagem. A comparação das taxas de crescimento de cepas pertencentes aos haplogrupos A (T. cruzi I) e C (T. cruzi II) frente à exposição a agentes genotóxicos, bem como a determinação dos níveis de dano no DNA induzido por estresse oxidativo, forneceram evidências de que cepas pertencentes à linhagem T. cruzi I apresentam uma capacidade de reparo mais eficiente. O cultivo de parasitos na presença de cádmio, um inibidor da via de MMR, juntamente com os resultados de ensaios in vitro com proteínas recombinantes indicam que diferenças observadas entre as cepas podem ser, em parte, devido às diferenças na atividade de TcMSH2. A fim de investigar melhor o papel do MMR e, mais precisamente, da proteína TcMSH2 na geração de variabilidade genética em T. cruzi, foram geradas linhagens heminocautes para o gene Tcmsh2. Os resultados obtidos sugerem que, além do seu papel no MMR, a proteína TcMSH2 exerça uma função MMRindependente importante na resposta ao estresse oxidativo, o que impossibilitaria a deleção de ambos os alelos. Esta função parece ser conservada em um tripanossomatídeo relacionado, T. brucei. Como estratégia alternativa, vetores para transfecção de T. cruzi foram construídos de maneira a gerar parasitos 11 superexpressando o gene Tcmsh2. Entretanto, devido possivelmente a mecanismos que controlam a expressão do gene Tcmsh2, não foi possível obter linhagens transfectadas expressando altos níveis dessa proteína. Com o objetivo adicional de estudar quais são os sinais importantes para a expressão de um gene exógeno em T. cruzi, de forma a aperfeiçoar vetores já utilizados, foram realizadas análises in silico onde procuramos investigar melhor os requerimentos necessários para o processamento correto, através de trans-splicing e poliadenilação, dos mRNAs no parasito. Essas análises mostraram que a distância mediana entre os motivos de polipirimidinas (sinais já conhecidos como importantes para o processamento do mRNA) e os sítios de trans-splicing e os de poliadenilação é de 18 e 40 nt, respectivamente. Os motivos de polipirimidinas apresentaram tamanhos medianos de 11 nt (acima do sítio de trans-splicing) e 12 nt (abaixo do sítio de poliadenilação). Os tamanhos médios de 5UTR (35 nt) e 3UTR (137 nt) obtidos corroboram resultados anteriores, que indicam que o genoma de T. cruzi é mais compacto quando comparado com outros tripanossomatídeos, tais como T. brucei e Leishmania major