Search

Digital, os péptidos antimicrobianos (AMPs) son una buena opción terapéutica contra bacterias multidrogoresistentes. Sin embargo, el uso terapéutico de los AMPs se ha obstaculizado, debido a su inestabilidad en ambientes específicos, propensión al clivaje por proteasas o en algunos casos citotoxicidad. Los AMPs exhiben pequeño tamaño, carga neta positiva y anfipaticidad, necesarios para adquirir estructura secundaria, en superficies hidrofóbicas e hidrofílicas, lo que facilita la interacción electrostática con las membranas bacterianas. Los péptidos Ib-M1, Ib-M2 e Ib-M6, que se usarán en este estudio, son análogos sintéticos del péptido Ib-AMP4, nativo de la planta Impatiens balsamina, que fueron obtenidos después de modificar su carga neta e hidrofobicidad mediante la inserción de arginina y triptófano. Estudios de la actividad biológica de Ib-M contra E. coli O157:H7, mostraron actividad inhibitoria menor a 10 µM, sin evidencia de citotoxicidad en células Vero, por lo que se consideran agentes antibacterianos promisorios., Ciencias Médicas y de la Salud

1 p., El péptido Ib-M6 tiene actividad antibacteriana contra la cepa K-12 de Escherichia coli no patógena . La primera parte de este estudio determina la actividad antibacteriana de Ib-M6 contra catorce cepas patógenas de E. coli O157: H7. El ensayo de susceptibilidad mostró que Ib-M6 tenía valores de Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) más bajos que la estreptomicina, usada como antibiótico de referencia. Además, para predecir la posible interacción entre Ib-M6 y los componentes de la membrana externa de E. coli, utilizamos simulaciones de acoplamiento molecular donde la proteína FhuA y su complejo con Lipopolisacárido (LPS-FhuA) se utilizaron como objetivos del péptido. Los complejos FhuA / Ib-M6 tenían valores de energía entre -39,5 y -40,5 unidades de energía Rosetta (REU) y solo un enlace de hidrógeno. En contraste, los complejos entre LPS-FhuA e Ib-M6 mostraron valores de energía entre -25,6 y -40,6 REU, y la presencia de cinco posibles enlaces de hidrógeno. Por tanto, la actividad antimicrobiana del péptido Ib-M6 mostrada en los ensayos experimentales podría deberse a su interacción con la membrana externa de E. coli ., The Ib-M6 peptide has antibacterial activity against non-pathogenic Escherichia coli K-12 strain. The first part of this study determines the antibacterial activity of Ib-M6 against fourteen pathogenic strains of E. coli O157:H7. Susceptibility assay showed that Ib-M6 had values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) lower than streptomycin, used as a reference antibiotic. Moreover, to predict the possible interaction between Ib-M6 and outer membrane components of E. coli, we used molecular docking simulations where FhuA protein and its complex with Lipopolysaccharide (LPS–FhuA) were used as targets of the peptide. FhuA/Ib-M6 complexes had energy values between 􀀀39.5 and 􀀀40.5 Rosetta Energy Units (REU) and only one hydrogen bond. In contrast, complexes between LPS–FhuA and Ib-M6 displayed energy values between 􀀀25.6 and 􀀀40.6 REU, and the presence of five possible hydrogen bonds. Hence, the antimicrobial activity of Ib-M6 peptide shown in the experimental assays could be caused by its interaction with the outer membrane of E. coli., Ej. 1

Digital, Actualmente, la encapsulación es un método de gran importancia científica debido a las ventajas que estas poseen. En la industria farmacéutica, se ha encontrado la forma de controlar la dosificación de los antibióticos usando esta metodología para proteger los sistemas bioactivos, y manejar el tiempo de entrega y concentración de este. El Alginato y el Chitosan, son algunos de los biopolímeros de mayor uso para esta metodología, gracias a que no son tóxicos, y se puede dosificar repetidas veces sin ocasionar efectos adversos. En el caso de E. coli O157:H7, es un microorganismo de gran importancia, ya que causa grandes cifras de morbimortalidad al año, y no existe tratamiento específico para este. La estreptomicina, es un antibiótico que se ha usado en algunos cuadros para E. coli O157:H7, por lo que el objetivo de este proyecto es la inmovilización de estreptomicina en micropartículas poliméricas de Alginato-Chitosan para la inhibición de E. coli O157:H7. Se probaron distintas formulaciones de micropartículas, alterando la concentración de Alginato y CaCO3. Se utilizó SEM para la visualización de las micropartículas formuladas y se probó su actividad antimicrobiana mediante la técnica de microdilución. Se obtuvo un tamaño promedio de 0.5-5 μm de las micropartículas y se logró una CMI de 12.5μM de estreptomicina contra E. coli O157:H7, con la estreptomicina inmovilizada en las micropartículas. No se encontró actividad antimicrobiana por parte de las micropartículas de Alginato-Chitosan, por lo que la actividad de inhibición se le atribuye a la estreptomicina inmovilizada., Currently, encapsulation is a method of great scientific importance due to its advantages. In the pharmaceutical industry, a way has been found to control the dosage of antibiotics using this methodology to protect bioactive systems, and manage the delivery time and concentration of this. Alginate and chitosan are some of the most widely used biopolymers for this methodology, thanks to the fact that they are not toxic, and can be dosed repeatedly without causing adverse effects. In the case of E. coli O157: H7, it is a microorganism of great importance, since it causes large numbers of morbidity and mortality per year, and there is no specific treatment for it. Streptomycin is an antibiotic that has been used in some cases for E. coli O157: H7, so the objective of this project is the immobilization of streptomycin in polymeric alginate-chitosan microparticles for the inhibition of E. coli O157: H7. Different microparticle formulations were tested, altering the concentration of alginate and CaCO3. SEM was used to visualize the formulated microparticles and their antimicrobial activity was tested using the microdilution technique. An average size of 0.5-5 μm of the microparticles was obtained and a MIC of 12.5 μM of streptomycin against E. coli O157: H7 was achieved, with streptomycin immobilized on the microparticles. No antimicrobial activity was found by the alginate-chitosan microparticles, so the inhibition activity is attributed to immobilized streptomycin., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Planteamiento del Problema ........................................................................................... 18 2. Justificación .................................................................................................................... 20 3. Objetivos ......................................................................................................................... 22 3.1 Objetivo General ............................................................................................................. 22 3.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 22 4. Pregunta de Investigación ............................................................................................... 23 5. Hipótesis ......................................................................................................................... 24 5.1 Hipótesis de Investigación .............................................................................................. 24 5.2 Hipótesis Nula ................................................................................................................ 24 5.3 Hipótesis Alterna ............................................................................................................ 24 6. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 25 7. Marco Legal .................................................................................................................... 29 8. Marco Referencial .......................................................................................................... 30 8.1 Propiedades de los Biopolímeros .................................................................................... 30 8.2 Chitosan .......................................................................................................................... 31 8.2.1 Características Estructurales del Chitosan ...................................................................... 31 8.2.2 Características Físico-Químicas del Chitosan ................................................................ 32 8.2.3 Propiedades Funcionales del Chitosan ........................................................................... 32 8.3 Alginato .......................................................................................................................... 34 8.3.1 Estructura del Alginato ................................................................................................... 35 8.3.2 Características Físico-Químicas del Alginato ................................................................ 36 8.3.3 Propiedades del Alginato ................................................................................................ 36 8.4 Micropartículas Poliméricas ........................................................................................... 37 8.4.1 Clasificación de la Microencapsulación ......................................................................... 38 8.4.2 Métodos de Preparación de las Micropartículas ............................................................. 39 8.4.2.1 Gelificación Iónica. ......................................................................................................... 39 8.5 Encapsulación en Emulsión ............................................................................................ 41 8.6 Escherichia coli .............................................................................................................. 42 8.6.1 E. coli O157:H7 .............................................................................................................. 42 8.6.1.1 Síntomas E. coli O157:H7.. ............................................................................................ 42 9. Marco Metodológico ...................................................................................................... 44 9.1 Lugar de Realización ...................................................................................................... 44 9.2 Técnicas y Métodos ........................................................................................................ 44 9.2.1 Preparación de Soluciones .............................................................................................. 44 9.2.1.1 Solución de Alginato Sódico (Solución A) ..................................................................... 44 9.2.1.2 Solución de Chitosan (Solución B). ................................................................................ 44 9.2.1.3 Solución de Estreptomicina. ........................................................................................... 45 9.3 Preparación de Micropartículas Alginato-Chitosan ........................................................ 45 9.4 Inmovilización de Estreptomicina en las Micropartículas de Alginato- Chitosan ......... 46 9.5 Determinación de Porcentaje de Inmovilización ............................................................ 46 9.6 Caracterización de las Micropartículas ........................................................................... 47 9.7 Determinación de la Actividad Antimicrobiana ............................................................. 47 10. Resultados ....................................................................................................................... 48 11. Conclusión ...................................................................................................................... 58 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 59

Digital, Escherichia coli enterohemorrágica (O157:H7) es un microorganismo Gram negativo y uno de los patógenos más importantes para el ser humano. Su principal mecanismo de patogenicidad es la expresión de la toxina shiga, ya que ocasiona graves daños al epitelio intestinal. Actualmente existen diversos mecanismos para la detección de este microorganismo; entre ellos está la filtración por membrana y la cuantificación molecular. Sin embargo, cada una de estas técnicas tiene limitaciones como el tiempo que se requiere para obtener algún resultado, la capacitación que del personal y los altos costos del equipamiento. Por lo anterior surge la necesidad de nuevos métodos que permitan la detección rápida y sensible de este microorganismo. Por lo cual, en este trabajo se desarrolló de un aptasensor electroquímico cuya molécula de reconocimiento consiste en un aptámero diseñado “in silico” que permite la detección de Escherichia coli en matrices acuosas. Para esto se realizó una revisión bibliográfica sobre artículos científicos, que trataran de aptasensores diseñados para la detección de Escherichia coli y a partir de ellos se construyó una base de datos con la información más importante de cada uno. Todos estos datos se analizaron y a partir de las mejores secuencias se inició la construcción, agregando fragmentos necesarios para que fuera un aptámero “in silico” completamente funcional. El aptámero diseñado fue inmovilizado sobre electrodos serigrafiados modificados con nanopartículas de oro y la detección electroquímica se realizó a través de EIS (Espectroscopía de impedancia electroquímica), CV (Voltametría cíclica) y SWV (Voltametría de onda cuadrada). De los cuales se obtuvo que los electrodos que mostraron mejor comportamiento fueron el 1 y 2 por lo que se podría concluir que la electrodeposición de oro a +0.05mV beneficia la detección de Escherichia coli O157:H7, además es importante mencionar que el método “in silico” puede ser una gran alternativa para diseñar y obtener aptámeros., Enterohemorrhagic Escherichia coli (O157: H7) is one of the most important human pathogens. Its main pathogenicity mechanism is the expression of shiga toxin, since it causes serious damage to the intestinal epithelium and produces hemolytic uremic syndrome. Currently there're various mechanisms for the detection of this microorganism in aqueous matrices; among them are membrane filtration and molecular quantification. However, each of these techniques has limitations such as the time required to obtain a result, the training required by the personnel and the high costs of the equipment. Therefore, arises the need to design new methods that allow the rapid and sensitive detection of this microorganism. In this work, an electrochemical aptasensor was developed, whose recognition molecule consists of an “in silico” designed aptamer that allows the detection of E. coli in aqueous matrices. For this, a bibliographic review was carried out on scientific articles, which dealt with aptasensors designed for the detection of E. coli and from them, a database was built with the most important information of each one, such as the type of biosensor, the dissociation constant, the complete sequence that made up the aptamer. All these data were analyzed and from the best sequences the construction began, adding fragments necessary to make it a fully functional “in silico” aptamer. The designed aptamer was immobilized on silkscreened electrodes modified with gold nanoparticles and electrochemical detection was carried out through EIS (Electrochemical Impedance Spectroscopy), CV (Cyclic Voltammetry) and SWV (Square Wave Voltammetry). It was found that the electrodes that showed the best behavior were 1 and 2, so it could be concluded that the electrodeposition of gold at + 0.05mV benefits the detection of E. coli O157: H7. In addition, it's important to mention that the “in silico” method can be a great alternative to design and obtain aptamers., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Resumen ........................................................................................................................................ 12 Abstract ......................................................................................................................................... 14 Introducción .................................................................................................................................. 16 1. Objetivos ......................................................................................................................... 18 1.1 Objetivo General ............................................................................................................. 18 1.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 18 2. Marco de Antecedentes ................................................................................................... 19 2.1 Detección por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). ........................................ 19 2.2 Colorimetría .................................................................................................................... 20 2.3 Fluorescencia .................................................................................................................. 21 2.4 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 22 3. Marco Teórico ................................................................................................................ 25 3.1 Enfermedades Transmitidas por Alimentos .................................................................... 25 3.2 Escherichia coli O157:H7 .............................................................................................. 25 3.2.1 Generalidades y Taxonomía ........................................................................................... 25 3.2.2 Patogenicidad .................................................................................................................. 26 3.3 Métodos de Detección .................................................................................................... 27 3.3.1 Filtración por Membrana ................................................................................................ 27 3.3.2 Métodos Moleculares (qPCR) ........................................................................................ 28 3.3.3 Método del Número Más Probable ................................................................................. 29 3.4 Biosensores ..................................................................................................................... 30 3.4.1 Biosensores Electroquímicos .......................................................................................... 32 3.4.2 Técnica Electroquímica .................................................................................................. 33 3.5 Aptámeros ....................................................................................................................... 36 3.5.1 Ventajas y Limitantes ..................................................................................................... 38 4. Marco Legal .................................................................................................................... 40 5. Metodología .................................................................................................................... 42 5.1 Diseño de Aptámero “in silico” ..................................................................................... 42 5.2 Acondicionamiento de Electrodos Serigrafiados ............................................................ 43 5.3 Inmovilización del Aptámero ......................................................................................... 45 5.4 Detección Electroquímica de Escherichia coli O157:H7 ............................................... 46 6. Resultados y Discusión ................................................................................................... 49 6.1 Diseño “in silico” del Aptámero 917A. .......................................................................... 49 6.2 Caracterización de los Electrodos Iniciales .................................................................... 52 6.3 Inmovilización del Aptámero sobre el Electrodo Modificado con AuNP ...................... 58 6.4 Detección de Escherichia coli O157:H7 por medio de Aptasensor. .............................. 63 7. Conclusiones ................................................................................................................... 69 8. Recomendaciones ........................................................................................................... 70 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 71 Apéndices ...................................................................................................................................... 75

Digital, El diseño de biosensores electroquímicos basados en electrodos serigrafiados (SPEs) ha demostrado su aplicabilidad en una serie de áreas relacionadas con la salud pública, que requieren el desarrollo de técnicas y dispositivos para la detección de microorganismos patógenos debido a su simplicidad y alta sensibilidad. Por consiguiente, se desarrolló un biosensor electroquímico para la detección analítica rápida de Escherichia coli mediante la modificación de un electrodo serigrafiado (SPE) con nanopartículas de oro y péptidos PEPTIR como elemento biológico de reconocimiento. En este estudio se analizó la influencia de diferentes parámetros experimentales como la síntesis de nanopartículas, inmovilización del péptido y concentración de E. coli en la respuesta del biosensor para mejorar la respuesta. Para el diseño del biosensor, se utilizaron péptidos diseñados en el grupo de investigación CIBAS; PEPTIR 1,0 CQKVNIDELGNAIPSGVLKDD y PEPTIR 2,0 CQKVNIAELGNAIPSGVLKDD. El péptido 1 corresponde a un péptido análogo a la proteína TIR (Translocated Intimin Receptoren) y el péptido 2,0 corresponde a un péptido análogo a la proteína TIR modificado con el cambio de una Asparagina por una Alanina. Se encontró que los electrodos modificados con AuNPs a potencial de reducción de -0,05 V por 100 s favorecía el proceso de síntesis de nanopartículas sobre la superficie del electrodo. Por su parte, cuando se utilizó una concentración baja de péptido (100 nM) para la inmovilización se presentaron los mejores resultados en la detección de E. coli. Cuando se utilizó PEPTIR 1,0 para la modificación de los electrodos se presentó una tendencia lineal en la curva de cuantificación en un rango de concentración de E. coli entre 10 y 250 UFC/mL, que indica que la concentración de la bacteria es directamente proporcional al ΔINormalizado obtenido de la señal del sensor. Este trabajo demuestra que los electrodos modificados con nanopartículas de oro y péptidos PEPTIR como elemento de reconocimiento molecular en la detección de bacterias es una plataforma prometedora para el desarrollo de biosensores electroquímicos., The design of electrochemical biosensors based on screen-printed electrodes (SPEs) has demonstrated its applicability in a series of areas related to public health, which require the development of techniques and devices for the detection of pathogenic microorganisms due to its simplicity and high sensitivity. Consequently, an electrochemical biosensor was developed for the rapid analytical detection of Escherichia coli by modifying a silkscreened electrode (SPE) with gold nanoparticles and PEPTIR peptides as a biological recognition element. In this study, the influence of different experimental parameters such as nanoparticle synthesis, peptide immobilization and E. coli concentration on the response of the biosensor to improve the response was analyzed. For the design of the biosensor, peptides designed in the CIBAS research group were used; PEPTIR 1,0 CQKVNIDELGNAIPSGVLKDD and PEPTIR 2,0 CQKVNIAELGNAIPSGVLKDD. Peptide 1 corresponds to a peptide analogous to the TIR protein (Translocated Intimin Receptors) and peptide 2,0 corresponds to a peptide analogous to the TIR protein modified with the change of an Asparagine for an Alanine. Electrodes modified with AuNPs at a reduction potential of -0,05 V per 100 s were found to favor the nanoparticle synthesis process on the electrode surface. For its part, when a low concentration of peptide (100 nM) was used for immobilization, the best results were presented in the detection of E. coli. When PEPTIR 1,0 was used for the modification of the electrodes, a linear behavior was presented in the quantification curve in an E. coli concentration range between 10 and 250 CFU / mL, which indicates that the concentration of the bacteria is directly proportional to the Normalized ΔIN obtained from the sensor signal. This work shows that electrodes modified with gold nanoparticles and PEPTIR peptides as an element of molecular recognition in the detection of bacteria is a promising platform for the development of electrochemical biosensors., Pregrado, Microbiólogo Industrial, 1 ed., Capítulo 1. Introducción ..............................................................................................................1 Capítulo 2. ..................................................................................................................................7 Objetivos .................................................................................................................................7 Objetivo general ......................................................................................................................7 Objetivos específicos ...............................................................................................................7 Capítulo 3. Marco de antecedentes ..............................................................................................8 Capítulo 4. Marco teórico .......................................................................................................... 26 Capítulo 5. Marco legal ............................................................................................................. 36 Capítulo 6. Metodología ............................................................................................................ 38 Capítulo 7. Resultados y discusión ............................................................................................ 48 Conclusiones ............................................................................................................................. 80 Recomendaciones ..................................................................................................................... 82 Referencias bibliograficas ......................................................................................................... 84